Name: xylem water distribution in woody plants visualized with a cryo-scanning electron microscope
Uploaded: 2019-06-20T12:30:00
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Este trabajo fue apoyado por JSPS KAKENHI (No. 20120009, 20120010, 19780129, 25292110, 23780190, 23248022, 15H02450, 16H04936, 16H04948, 17H03825, 18H02258)

NOTA: En la Figura 1se muestra un gráfico esquemático de este protocolo.
1. Muestreo: Relajación de tensión dentro de la columna de agua de los conductos Xylem
NOTA: Se recomienda el siguiente tratamiento de relajación por tensión antes de la aplicación LN2 para evitar tanto la congelación como los artefactos inducidos por tensión en la distribución de agua de xilema.
<ol><li>Encierre una rama y hojas para tomar m...

Los métodos de observación crio-SEM introducidos en este artículo son prácticos para visualizar claramente la distribución del agua a escala celular. A través de este método, explorar los cambios en la distribución del agua dentro de xylem puede ayudar potencialmente a aclarar el mecanismo de tolerancia de las especies arbóreas al estrés abiótico (escasez o congelación de agua) o estrés biótico (enfermedad del árbol).
El paso más crucial en este método es preservar la distribu...

La disponibilidad de recursos hídricos (es decir, precipitación, contenido de agua del suelo) determina estrictamente la mortalidad y la distribución geográfica de las especies vegetales, ya que necesitan absorber el agua del suelo y transportarla a las hojas para la producción fotosintética. Las plantas deben mantener su sistema de transporte de agua bajo suministros de agua fluctuantes. En particular, las plantas leñosas generan altas tensiones en sus conductos a lo largo de los arroyos de transpiración, ya que, en algunos casos, necesitan sostener su corona más de 100 m sobre el suelo. Para mantener las columnas de agua bajo tan alta presión negativa, los conductos de xilema consisten en un continuo de células tubulares con paredes celulares rígidas e hidrofóbicas-lignificadas1. La vulnerabilidad a la disfunción xilema de los conductos de xilema en cada especie es un buen determinante de la supervivencia de la especie bajo el suministro de agua fluctuante2. Además, el estudio del estado del agua de los conductos de xilema es importante para la evaluación de la condición de salud de los árboles individuales sometidos a tensiones abióticas o bióticas. La medición del flujo de savia o del potencial hídrico puede proporcionar estimaciones del estado del agua de una planta leñosa debido a la función hidráulica integrada de los conductos de xilema. Además, la visualización de la distribución de agua en células xilem puede aclarar el estado de los componentes individuales del sistema hidráulico xilema.
Existen varias técnicas para visualizar el estado del agua de los conductos de xilema3. Los métodos clásicos y útiles para observar las vías del agua en el tejido leñoso implican la tinción de la columna de agua sumergiendo los extremos de las ramas cortadas en un tinte o inyectando un tinte en los tallos de los árboles de pie4. La fotografía de rayos X suave también permite la visualización de la distribución de agua de discosde madera en rodajas debido a la intensidad diferencial de absorción de rayos X de la humedad en xylem 5,6. Estos métodos, sin embargo, sólo proporcionan pistas de movimiento del agua o demuestran distribuciones macroscópicas de agua. Recientemente, técnicas de observación no destructivas, tales como la tomografía computarizada por rayos X de microfoco (CT)7,8,9,10y la resonancia magnética (RM)11, 12, se han mejorado significativamente para permitir la observación del agua en conductos de xilema dentro de los árboles intactos. Estos métodos no destructivos tienen grandes ventajas en el que podemos observar el estado del agua del xilema sin efectos de corte artificiales, y podemos rastrear la dinámica del flujo de agua mediante imágenes secuenciales o introduciendo un agente de contraste10. Sin embargo, necesitamos utilizar una resonancia magnética personalizada para la toma de imágenes de plantas o una instalación especializada para la ctuta ción basada en sincrotrón con el fin de obtener las imágenes que pueden identificar el contenido de agua a nivel celular. Además, aunque el sistema de caños basado en sincrotrón permite obtener imágenes finas con alta resolución espacial, que es comparable a la microscopía de luz7,8,9, las células vivas pueden ser lesionadas por el radiación de rayos X de alta energía13,14. El uso de un microscopio electrónico de barrido en el que se instalan criounidades (crio-SEM) es un método muy útil para localizar con precisión el agua en xilema a nivel celular, aunque esto requiere la recolección destructiva de la muestra para la observación. Para fijar el agua en conductos de xilema, una parte de los tallos (es decir, ramas, ramas o tallos) se congelan in situ por nitrógeno líquido (LN2). Las observaciones de la superficie de los especímenes recortados y congelados por crio-SEM proporcionan imágenes altamente magnificadas de la estructura xilema a partir de las cuales podemos identificar el agua en conductos de xilema como hielo. Una limitación significativa de este método es que la observación secuencial de la movilidad del agua dentro de la misma muestra es imposible. Sin embargo, la aplicación de la "CT" o de la RMN para la observación secuencial de los árboles que viven en un campo es extremadamente difícil porque estos instrumentos no son portátiles. Por el contrario, crio-SEM tiene un potencial para utilizar esta técnica en árboles grandes en experimentos de campo para visualizar claramente el contenido de agua no sólo a nivel celular, sino también a un nivel de estructura más fino, por ejemplo, agua en pozos intervasculares15, agua en espacios intercelulares16,o burbujas en la columna de agua17.
Muchos estudios observando el agua xilema por crio-SEM se han reportado 5,12,18,19,20,21,23. (1996) establecieron inicialmente el protocolo de observación del xilema in situ mediante la liofilización de un tronco vivo mediante el llenado de LN2 en un recipiente situado en el tallo21. La temperatura de la muestra se mantuvo por debajo de -20 oC durante la recolección de la muestra y durante la preparación crio-SEM con el fin de evitar el derretimiento del hielo dentro de los conductos de xilema. Este método se ha utilizado para observar el agua en xilema con el fin de aclarar la distribución del agua bajo el régimen cambiante de agua11,12,24,25,26, 27,28, la variación estacional de la distribución de agua21,29,30, el efecto de los ciclos de congelación-descongelación17,31, 32, la distribución de agua en madera húmeda5, cambios en la distribución del agua durante la transición de la madera de savia a la madera de samanjística20, curso de tiempo estacional de la actividad cambiaria y diferenciación de los vasos33, y la cavitación inducida por ciertas tensiones bióticas23,34. También se ha verificado la conductividad hidráulica y la vulnerabilidad de los conductos a la cavitación utilizando crio-SEM35,36. Cryo-SEM equipado con espectrometría de rayos X de dispersión de energía (EDX o EDS) se ha utilizado para estudiar la distribución de elementos sobre la superficie de un espécimen que contiene agua37.
La congelación de un tronco vivo que contiene conductos bajo alta tensión hidráulica a veces provoca cavitaciones artificiales que son observadas por crio-SEM como cristales de hielo fracturados en el lumen de los conductos38,39. En particular, las especies de hojas anchas con conductos más largos y anchos son vulnerables a artefactos inducidos por la tensión, como la cavitación causada por el corte de muestras, incluso si se llevan a cabo bajo el agua3,40. Los artefactos de cavitación se vuelven visibles después del muestreo de un árbol transpirante (es decir, muestreo durante el día) o en condiciones severas de sequía y pueden inducir a error a una sobreestimación de la ocurrencia de cavitación3,38, 39. Por lo tanto, la tensión que funciona en los conductos tiene que ser liberada con el fin de evitar la cavitación artifreal3,12,39.
La técnica de fractura por congelación utilizando un cuchillo instalado en una cámara de muestras se emplea a menudo para exponer la superficie de la muestra para la observación crio-SEM. Sin embargo, los planos fracturados por congelación de los tejidos vegetales leñosos, especialmente las seccionestransversales del xilema secundario, son demasiado ásperos para observar claramente las características anatómicas y el agua en el tejido 6. La aplicación de un criostato para recortar una muestra permite una preparación rápida y de alta calidad de las superficies de la muestra20,23. El objetivo general de este método es proporcionar evidencia con resolución de microscopía electrónica de la distribución de agua en varios tipos de células xilem in situ sin la ocurrencia de artefactos de muestreo. Presentamos nuestro procedimiento actualizado, que se ha mejorado constantemente desde que lo adoptamos por primera vez, en relación con el muestreo, recorte y limpieza de la superficie de la muestra para obtener micrografías electrónicas de alta calidad de muestras criofijas de xilema.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:904px;" width="904">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:249px;">coating material</td>
			<td style="width:179px;">JOEL Ltd., Japan</td>
			<td style="width:284px;">Gold wire, 0.50 &#215; 1000 mm, 99.99 %, Parts No. 125000499&#160;</td>
			<td style="width:192px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:59px;width:249px;">cryo scanning electron microscope</td>
			<td style="width:179px;">JOEL Ltd., Japan</td>
			<td style="width:284px;">JSM-6510 installed with MP-Z09085T / MP-51020ALS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:48px;width:249px;">cryostat</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:284px;">CryoStar NX70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:249px;">microtome blade</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:284px;">HP35 ULTRA Disposable Microtome Blades, 3153735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:249px;">tissue freezing embedding medium</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:284px;">Shandon Cryomatrix embedding resin, 6769006</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

xylem water distribution in woody plants visualized with a cryo-scanning electron microscope

Una criounidad de microscopio electrónico de barrido instalada (crio-SEM) permite la observación de muestras a temperaturas bajo cero y se ha utilizado para explorar la distribución de agua en tejidos vegetales en combinación con técnicas de fijación de congelación utilizando nitrógeno líquido (LN 2). Sin embargo, para las especies leñosas, los preparados para observar la superficie de corte transversal de xilema implican algunas dificultades debido a la orientación de las fibras de madera. Además, una mayor tensión en la columna de agua en los conductos de xilema puede ocasionalmente causar cambios artígrados en la distribución del agua, especialmente durante la fijación y recolección de la muestra. En este estudio, demostramos un procedimiento eficiente para observar la distribución de agua dentro del xilema de plantas leñosas in situ mediante el uso de un criostato y crio-SEM. Al principio, durante la recolección de muestras, la medición del potencial de agua de xilema debe determinar si hay alta tensión en los conductos de xilema. Cuando el potencial de agua de xilema es bajo (< aprox. 0,5 MPa), se necesita un procedimiento de relajación de tensión para facilitar una mejor preservación del estado del agua en conductos de xilema durante la fijación por congelación de la muestra. A continuación, se une un collar estanco alrededor del tallo del árbol y se llena con LN2 para la fijación de congelación del estado del agua de xylem. Después de la cosecha, se debe tener cuidado de asegurar que la muestra se conserve congelada mientras se completan los procedimientos de preparación de la muestra para la observación. Se emplea un criostato para exponer claramente la superficie transversal de xilema. En las observaciones crio-SEM, se requiere un ajuste de tiempo para el grabado en congelación para eliminar el polvo de escarcha y acentuar el borde de las paredes celulares en la superficie de visualización. Nuestros resultados demuestran la aplicabilidad de las técnicas crio-SEM para la observación de la distribución de agua dentro de xilemas a nivel celular y subcelular. La combinación de crio-SEM con técnicas de observación in situ no destructivas mejorará profundamente la exploración de la dinámica de flujo de agua de las plantas leñosas.

En la Figura 2se muestran imágenes representativas de superficies transversales de xilema de árboles de coníferas y de hojas anchas, observadas por crio-SEM. A bajo aumento, el área negra de las imágenes indica las cavidades de las que el agua desaparece total o parcialmente, y el área gris indica paredes celulares de xilema, citoplasma y agua (Figura2A). En un aumento alto, es evidente que el agua no se pi...

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Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope

Observar la distribución del agua dentro del xilema proporciona información significativa sobre la dinámica del flujo de agua en las plantas leñosas. En este estudio, demostramos el enfoque práctico para observar la distribución de agua de xilema in situ mediante el uso de un criostato y crio-SEM, que elimina los cambios más recientes en el estado del agua durante la preparación de la muestra.

Distribución de agua de Xylem en plantas leñosas visualizada con un microscopio electrónico de barrido crio-

A scanning electron microscope installed cryo-unit (cryo-SEM) allows specimen observation at subzero temperatures and has been used for exploring water ...

El objetivo general de este protocolo es proporcionarnos una resolución de electromicroscopía de la distribución de agua en varios tipos de células xilem in situ. Este método se ha utilizado para observar el agua en xillem con el fin de aclarar la distribución del agua y los regímenes cambiantes del agua, la variación estacional de la distribución del agua, el efecto de los ciclos de congelación / descongelación, la distribución de agua en la madera húmeda, y la cavitación inducida por ciertas tensiones bióticas. La fijación por congelación de un tronco vivo bajo altas tensiones hidráulicas a veces causa cavitaciones artificiales, que son observadas por crio-SEM como cristales de hielo rotos en el lumen de conducto.Este procedimiento actualizado se centra en la obtención de micrografías aerotódmicas de alta calidad de xilem sin el artefacto en el procedimiento de muestreo. La demostración viable es crítica porque hay una serie de detalles importantes que no se pueden explicar fácilmente. Al mismo tiempo, obtener formación no es fácil porque sólo unos pocos laboratorios de todo el mundo practican este método.Para comenzar este procedimiento, encierre una rama y las hojas para el muestreo con una bolsa de plástico negro para equilibrar el potencial de agua entre el xillem y las hojas más de dos horas antes del muestreo. Usando una cámara de presión, determine el potencial de agua de al menos dos hojas de la muestra. Cuando el potencial de agua es mayor que aproximadamente menos 0,5 megapascales, se puede cosechar una muestra después de la congelación.Cuando el potencial de agua sea inferior a menos de 0,5 megapascales, proceda con el tratamiento para la relajación. Fije un collar estanco alrededor del tallo, que se llenará con agua. Usando tijeras de poda o una sierra, corte el tallo debajo de la superficie del agua y mantenga el extremo de corte de la muestra bajo el agua.Transfiera la muestra a otro recipiente de agua lo más rápido posible para minimizar la exposición del extremo cortado al aire. Para las especies de hojas anchas, asegúrese de que la longitud desde el lugar donde se obtendrá la muestra criogénica para SEM hasta el borde de corte del tallo cosechado sea más larga que la longitud máxima del recipiente de la muestra con el fin de evitar artefactos inducidos por tensión dentro del crioample. A continuación, cubra la muestra con una bolsa de plástico negra para reducir la transpiración.Mantener el extremo cortado de la muestra en el agua y mantener esta condición durante aproximadamente 30 minutos con el fin de relajar la tensión del xiónigo. Después de esto, medir el potencial de agua de nuevo para confirmar la relajación de la tensión del xiónigo. En primer lugar, utilice tijeras o un cuchillo de utilidad para cortar y abrir un lado de un collar hermético.Fije el collar firmemente alrededor del tallo con cinta adhesiva mientras sostiene la abertura horizontalmente. Póngase guantes aislantes y sostenga con seguridad el recipiente de nitrógeno líquido. Ejecuta nitrógeno líquido en el collar hasta que esté lleno y mantenlo lleno añadiendo constantemente nitrógeno líquido adicional para congelar completamente el agua en el xílem.Después de un tiempo de congelación suficiente, desprenda el collar de la porción congelada del tallo de la muestra para eliminar el nitrógeno líquido. Utilice inmediatamente una sierra de mano fina para cosechar la muestra. A continuación, cubra la muestra congelada con un trozo de papel de aluminio o vuelva a colocarla en un tubo de muestra.Coloque rápidamente la muestra cosechada en un recipiente lleno de nitrógeno líquido. Almacene las muestras a menos 80 grados centígrados hasta que estén listas para realizar la observación. Para empezar, establezca la temperatura de la cámara de muestras del criostato en menos 30 grados Celsius, que generalmente es lo suficientemente fría como para mantener la savia de xylem de la mayoría de las plantas en un estado congelado.Utilice un cuchillo afilado o una sierra de dientes finos para recortar la muestra en una pequeña pieza que se puede ajustar para el soporte de la muestra de un crio-SEM. Monte la pieza recortada en un mandril, un soporte para un criostato, con medio de incrustación de congelación de tejido para crioseció. Fije el mandril a un soporte de muestra de un microtoma del criostato.Recorte la superficie afeitando repetidamente de cinco a siete secciones de espesor. Cortar más de 1.000 a 2.000 micrómetros en profundidad total a la superficie inicial es útil para elmininizar la parte dañada de la muestra causada por el pre-corte. Después de recortar aproximadamente una superficie de la muestra, ajuste una porción no utilizada de la hoja de microtoma por encima de la superficie de la muestra.Ensancha ligeramente la distancia entre la superficie de la muestra y la hoja. Y cortar la superficie sólo una o dos veces. A continuación, deslice la hoja de nuevo y coloque una parte no utilizada de la hoja sobre la superficie de la muestra.Repita este procesamiento de corte de tres a cuatro veces para obtener una superficie clara sin marcas de cuchillo. Después del corte final, coloque la posición de la hoja lejos de la muestra para evitar que el polvo se pegue a la muestra. Y separa el mandril del microtoma.A continuación, adjunte la muestra a un soporte de muestra crio-SEM con medio de incrustación de congelación de tejido en la cámara de criostato. En primer lugar, utilice nitrógeno líquido para mantener una temperatura inferior a menos 120 grados celsius en la cámara de muestras crio-SEM de acuerdo con el manual del usuario del equipo. A continuación, coloque el portaespecís con la muestra preparada en un recipiente aislante lleno de nitrógeno líquido en la cámara del criostato.Utilice una barra de intercambio de muestras para sujetar el soporte de la muestra debajo del nitrógeno líquido. Transfiera rápidamente el soporte de la muestra a la cámara de pre-evacuación de la cámara de muestra crio-SEM tan pronto como comience la evacuación de la cámara de pre-evacuación. Para empezar, encienda el voltaje de aceleración de la pistola eléctrica.A continuación, suba la temperatura de la etapa de la muestra a menos 100 grados centígrados. Espere varios minutos para que se elimine el polvo de escarcha y para que el nivel superficial del hielo en las células del xilán disminuya ligeramente en comparación con las paredes celulares. A continuación, baje la temperatura de la etapa speiumen a menos 120 grados centígrados.En este estudio, los métodos de observación crio-SEM se utilizan para visualizar claramente la distribución del agua a escala celular. Con bajo aumento, el área negra en las imágenes indica las cavidades de las que el agua desaparece total o parcialmente, mientras que el área gris indica las paredes celulares del xilem, el citoplasma y el agua. Con un alto aumento, se hace evidente que el agua no se pierde por completo de la lumina de tres traejes, lo que indica la ocurrencia de macro burbujas en la savia del xiónico in situ.Con respecto a las especies de hojas anchas, la aparición de cavitación se detecta fácilmente dentro de los vasos, mientras que la existencia de agua es difícil de distinguir dentro de las fibras, especialmente con bajo aumento. Las células del citoplasma y del parénquima se pueden distinguir del agua dentro de los trazadores o vasos a través de texturas de planos de hielo. El análisis del efecto de la temperatura en el proceso de congelación y grabado revela que el polvo de escarcha se sublima gradualmente, y las membranas de foso endotracehid se vuelven más claras a través de la progresión de la sublimación con el aumento de la temperatura.Las grandes partículas de polvo de escarcha restantes se pueden eliminar mediante un mayor grabado en congelación. Pero esto puede ser problemático, ya que disminuye innecesariamente el nivel superficial de hielo en los conductos de xylem. La alta calidad de la observación se logra en gran medida a través de una preparación precisa de la muestra.El alisamiento de la superficie con la hoja afilada del microtoma es especialmente importante. El suavizado insuficiente por una hoja usada a veces puede crear una superficie rugosa que se asemeja a las marcas de cuchillo, o puede crear numerosas apariciones de polvo de los cortes. La congelación de la muestra sin la relajación de la presión negativa de la columna de agua causará la inducción artefactol de la cavitación en los conductos de xílem.Los cristales de hielo agrupados se observan en recipientes de especímenes donde la muestra no se relajó. En contraste, no se observan cristales de hielo agrupados en los especímenes de muestra relajados con un potencial de agua similar. La aplicación de la fijación por congelación a las plantas vivas que transpiran y que sufren sequías puede inducir artefactos basados en resultados, como cristales de hielo agrupados.Esos artefactos conducen a interpretaciones erróneas del estado del agua en el conducto de xylem. Por lo tanto, es importante confirmar primero el potencial de agua de las muestras antes de la fijación por congelación. Aunque este procedimiento proporciona una imagen de qué estado en el conducto de xylem, un árbol vivo debe ser destruido para la observación.La combinación de otros métodos de observación no invasivos como la RMN o la micro-CT con la observación de imágenes a nivel subsidiario profundizará nuestra comprensión de la naturaleza entre el transporte de agua y el uso. La observación del estado del agua introducida por este documento también proporcionará un método para la clarificación de la relación del agua que se mezcla en las células y otras respuestas anatómicas al estrés abiótico o biótico. Cryo-SEM equipado con espectroscopia de rayos X dispersiva de energía o sim superior se han utilizado para estudiar la distribución de elementos sobre la superficie de una muestra que contiene agua.La combinación del análisis elemental y este procedimiento en ese marco similar puede darnos un profundo conocimiento del comportamiento celular del xiónigo relacionado con el estado del agua. Cuando utilice nitrógeno líquido para la fijación por congelación de muestras en una habitación, no olvide ventilar la habitación para evitar la deficiencia de oxígeno.

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