Name: xylem water distribution in woody plants visualized with a cryo-scanning electron microscope
Uploaded: 2019-06-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope at JoVE.com

Detta arbete stöddes av JSPS KAKENHI (nr. 20120009, 20120010, 19780129, 25292110, 23780190, 23248022, 15H02450, 16H04936, 16H04948, 17H03825, 18H02258)

Obs: en schematisk tabell över detta protokoll visas i figur 1.
1. provtagning: spänning avslappning inom Water Column av Xylem conduits
Anmärkning: följande spänning avslappnings behandling rekommenderas innan LN2 ansökan för att undvika både frysning och spänningar-inducerad artefakter i Xylem vatten distribution.
<ol><li>Bifoga en gren och blad för provtagning med en svart plast påse för att jämvikt vattenpo...

Den Cryo-SEM observations metoder som införts i detta dokument är praktiska för att tydligt visualisera vatten distribution på cellulär skala. Genom denna metod, utforska förändringar i distributionen av vatten inom Xylem kan potentiellt bidra till att klargöra mekanismen för trädslag tolerans mot abiotisk stress (vatten brist eller frysning) eller biotiska stress (träd sjukdom).
Det mest avgörande steget i denna metod är att bevara vatten distributionen som kännetecknar den ursp...

Till gången på vatten resurser (dvs. nederbörd, mark vatten halt) bestämmer strängt dödligheten och den geografiska fördelningen av växt arter, eftersom de måste absorbera vatten från marken och transportera det till bladen för foto syntetisk produktion. Anläggningarna måste bibehålla sitt vatten transport system under fluktuerande vatten leveranser. I synnerhet vedartade växter genererar höga spänningar i sina ledningar längs transpiration strömmar som, i vissa fall, de behöver för att hålla sin krona mer än ~ 100 m ovan jord. För att bibehålla vattenpelare under så högt negativt tryck består Xylem-conduits av ett kontinuum av tubulära celler med stela och hydrofoba-lignifierade cell väggar1. Den sårbarhet för Xylem dysfunktion av Xylem conduits i varje art är en bra avgörande av arten överlevnad under fluktuerande vattenförsörjning2. Dessutom är det viktigt att studera vatten status av Xylem conduits för utvärdering av hälso tillståndet hos enskilda träd som utsätts för abiotiska eller biotiska påfrestningar. Mätning SAP flöde eller vattenpotential kan ge uppskattningar av en Woody anläggningens vatten status på grund av den integrerade hydrauliska funktionen av Xylem conduits. Dessutom kan visualisering av vatten distributionen i Xylem-celler klargöra tillståndet för enskilda komponenter i XYLEMS hydraul system.
Flera tekniker för att visualisera vatten status av Xylem conduits finns3. Den klassiska och användbara metoder för observation av vatten vägar i vedartade vävnad innebär färgning av vattenpelaren genom att doppa ändarna av skurna grenar i ett färg ämne eller genom att injicera ett färg ämne i stående träd stammar4. Mjuk röntgen fotografering gör det också möjligt visualisering av vatten distribution av skivade trä skivor på grund av den differentiella x-ray absorptionsintensiteten av fukten i Xylem5,6. Dessa metoder, dock endast ge spår av vatten rörelse eller demonstrera makroskopiska distributioner av vatten. Nyligen, icke-förstörande observation tekniker, såsom Micro Focus X-ray datortomografi (μct)7,8,9,10och magnetisk resonanstomografi (MRI)11, 12, har förbättrats avsevärt för att möjliggöra observation av vatten i Xylem ledningar inom intakt plantor. Dessa icke-destruktiva metoder har stora fördelar i att vi kan observera XYLEMS vatten status utan konstgjorda skär effekter, och vi kan spåra vattenflödet dynamik genom sekventiell avbildning eller införa ett kontrast medel10. Vi måste dock använda en anpassad MRI för växt avbildning eller en specialiserad anläggning för synkrotronbaserad μCT för att erhålla de bilder som kan identifiera vattenhalten i cell nivå. Dessutom, även om synkrotron-baserade μct-systemet är aktiverat för att erhålla fina bilder med hög rumslig upplösning, vilket är jämförbart med ljusmikroskopi7,8,9, kan levande celler skadas av strålning av hög energi röntgen,13,14. Använda ett svep elektron Mikroskop där Cryo-enheter är installerade (Cryo-SEM) är en mycket användbar metod för att exakt lokalisera vattnet i Xylem på cell nivå, även om detta kräver destruktivt skörd provet för observation. För att fixera vattnet i XYLEMS ledningar är en del av stjälkarna (dvs. kvistar, grenar eller stammar) frysta in situ av flytande kväve (LN2). Observationer av ytan av trimmade, frysta exemplar av Cryo-SEM ger mycket förstorade bilder av Xylem struktur som vi kan identifiera vattnet i Xylem ledningar som is. En betydande begränsning av denna metod är att sekventiell observation av vattnets movabilitet inom samma prov är omöjlig. Tillämpningen av μCT eller MRI för sekventiell observation av träd som lever i ett fält är dock extremt utmanande eftersom dessa instrument inte är portabla. I motsats, Cryo-SEM har en potential för att använda denna teknik på stora träd i fält experiment för att tydligt visualisera vatten innehåll på inte bara cell nivå utan också på en finare struktur nivå, e.g., vatten i intervascular gropar15, vatten i intercellulära utrymmen16, eller bubblor i vatten kolumn17.
Många studier som observerar Xylem Water av Cryo-SEM har rapporter ATS 5,12,18,19,20,21,23. Utsumi et al. (1996) upprättade inlednings vis protokollet för observation av Xylem in situ genom frysning-fixering av en levande stam genom att fylla LN2 i en behållare inställd på stammen21. Temperaturen på provet bibehölls under-20 ° c under provtagning och under Cryo-SEM beredning för att undvika smältande is inom Xylem-ledningar. Denna metod har använts för att observera vattnet i Xylem för att klargöra vatten distributionen under förändrade vatten system11,12,24,25,26, 27,28, den säsongsbetingade variationen i vattendistribution 21,29,30, effekten av frys-tö cykler17,31, 32, fördelningen av vatten i vått trä5, förändringar i vatten fördelningen under över gången från sapwood till kärnved20, säsongsbunden tid av kambial aktivitet och differentiering av fartyg33, och kavitation induceras av vissa biotiska spänningar23,34. Hydraulisk konduktivitet och conduits sårbarhet för kavitation har också verifierats med Cryo-SEM35,36. Cryo-SEM utrustad med energidispersiv röntgenspektrometri (EDX eller EDS) har använts för att studera elementets fördelning över ytan av ett prov som innehåller vatten37.
Frysning-fixering av en levande stam som innehåller ledningar under hög hydraulisk spänning orsakar ibland konstgjorda kavitation som observeras av Cryo-SEM som brutna iskristaller i lumen av conduits38,39. I synnerhet, ädel löv arter med längre och bredare ledningar är sårbara för spännings-inducerad artefakter, såsom kavitation orsakad av provtagning, även om den utförs under vatten3,40. Kavitation artefakter blir iögonfallande efter provtagning av ett transpiring träd (dvs provtagning under dagtid) eller under svåra tork förhållanden och de kan vilseleda till en överskattning av kavitation förekomst3,38, på 39. Därför måste spänningen som arbetar i ledningarna släppas för att undvika den artifaktuella kavitation3,12,39.
Frys fraktur tekniken med hjälp av en kniv monterad i en preparat kammare används ofta för att exponera preparat ytan för Cryo-SEM-observation. Men frysa-Fractured plan av vedartade växt vävnader, särskilt tvärgående delar av sekundära Xylem, är för grova för att tydligt observera de anatomiska egenskaper och vatten i vävnaden6. Användning av kryostat för att trimma ett preparat möjliggör snabb och högkvalitativ beredning av prov ytorna20,23. Det övergripande målet med denna metod är att ge bevis med elektronmikroskopi upplösning av vatten distributionen i olika typer av Xylem celler in situ utan förekomst av provtagning artefakter. Vi introducerar vårt uppdaterade förfarande, som har förbättrats stadigt sedan vi först antog det, om provtagning, putsning och rengöring av preparat ytan för att erhålla högkvalitativa elektronmikrografer av Cryo-fasta prover av Xylem.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:904px;" width="904">
	<tbody>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:249px;">coating material</td>
			<td style="width:179px;">JOEL Ltd., Japan</td>
			<td style="width:284px;">Gold wire, 0.50 &#215; 1000 mm, 99.99 %, Parts No. 125000499&#160;</td>
			<td style="width:192px;"></td>
		</tr>
		<tr height="58">
			<td height="58" style="height:59px;width:249px;">cryo scanning electron microscope</td>
			<td style="width:179px;">JOEL Ltd., Japan</td>
			<td style="width:284px;">JSM-6510 installed with MP-Z09085T / MP-51020ALS</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="47">
			<td height="47" style="height:48px;width:249px;">cryostat</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:284px;">CryoStar NX70</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:249px;">microtome blade</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:284px;">HP35 ULTRA Disposable Microtome Blades, 3153735</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="38">
			<td height="38" style="height:38px;width:249px;">tissue freezing embedding medium</td>
			<td style="width:179px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:284px;">Shandon Cryomatrix embedding resin, 6769006</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

xylem water distribution in woody plants visualized with a cryo-scanning electron microscope

Ett svep elektron Mikroskop installerat Cryo-Unit (Cryo-SEM) tillåter preparat observation vid minus grader och har använts för att undersöka vatten distribution i växt vävnader i kombination med frys bindnings teknik med flytande kväve (LN 2). för Woody arter, dock preparat för observation av Xylem tvärgående yta innebära vissa svårigheter på grund av orientering av trä fibrer. Dessutom kan högre spänningar i vattenpelare i Xylem ledningar ibland orsaka artefakt förändringar i vatten distribution, särskilt under prov fixering och insamling. I denna studie visar vi ett effektivt förfarande för att observera vatten distributionen inom Xylem av vedartade växter på plats genom att använda en kryostat och Cryo-SEM. Vid första, under prov insamling, mätning av Xylem vattenpotentialen bör avgöra om hög spänning är närvarande i Xylem conduits. När Xylem vattenpotentialen är låg (< ca. − 0,5 MPa), en spänning avslappnings förfarande behövs för att under lätta bättre bevarande av vatten status i Xylem ledningar under provet frysa fixering. Därefter fästs en vatten tät krage runt träd stammen och fylls med LN2 för frys fixering av XYLEMS vatten status. Efter skörd skall försiktighet iakttas för att säkerställa att provet bevaras fryst medan förfarandet för prov beredning för observation är slutfört. Kryostat används för att tydligt exponera den tvärgående ytan av Xylem. I Cryo-SEM observationer krävs tids justering för frysning-etsning för att ta bort frost damm och accentuera kanten av cell väggarna på utsikts ytan. Våra resultat visar tillämpligheten av Cryo-SEM tekniker för observation av vatten distribution inom Xylem på cellulär och subcellulär nivå. Kombinationen av Cryo-SEM med icke-förstörande in situ observation tekniker kommer att grundligt förbättra utforskandet av vedartade växtvattenflödesdynamik.

Representativa bilder av tvärskurna ytor av barr-och lövträd Xylem, observerade av Cryo-SEM, visas i figur 2. Vid låg förstoring indikerar det svarta området i bilderna håligheter från vilka vatten helt eller delvis försvinner, och det gråa området indikerar XYLEMS cell väggar, cytoplasman och vatten (figur 2a). Vid hög förstoring, är det uppenbart att vattnet inte är helt förlorad från Lumina a...

Watch this Scientific Journal Video about Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope at JoVE.com

Xylem Water Distribution in Woody Plants Visualized with a Cryo-scanning Electron Microscope

Observation av vatten distributionen inom Xylem ger viktig information om vattenflödesdynamik i vedartade växter. I denna studie visar vi den praktiska metoden för att observera Xylem vatten distribution in situ genom att använda en kryostat och Cryo-SEM, vilket eliminerar artifaktuella förändringar i vatten status under prov beredning.

Xylem vatten distribution i Woody växter visualiseras med en Cryo-scanning Electron Mikroskop

A scanning electron microscope installed cryo-unit (cryo-SEM) allows specimen observation at subzero temperatures and has been used for exploring water ...

Det övergripande målet med detta protokoll är att ge oss elektromikroskopi upplösning av vattenfördelningen i olika typer av xylem celler in situ. Denna metod har använts för att observera vattnet i xylem för att klargöra vattenfördelningen och systemen för växlande vatten, vattenfördelningens säsongsvariation, effekten av frys-/töcykler, fördelningen av vatten i vått trä, och kavitation som framkallas av vissa biotiska påfrestningar. Frysa-fixering av en bosatt stam under kickhydrauliska spänningar orsakar ibland konstgjorda cavitations, som observeras av cryo-SEM som brusten iskristaller i lumen av conduit.Denna uppdaterade procedur fokuserar på att erhålla högkvalitativa aerotome mikrografer av xylem utan artefakten i provtagningsproceduren. Livskraftig demonstration är kritisk eftersom det finns ett antal viktiga detaljer som inte lätt kan förklaras. Samtidigt är det inte lätt att få utbildning eftersom det bara är ett fåtal laboratorier runt om i världen som praktiserar denna metod.Till att börja detta förfarande, bifoga en gren och lämnar för provtagning med en svart plastpåse för att balansera vattenpotentialen mellan xylem och lämnar mer än två timmar före provtagning. Med hjälp av en tryckkammare, bestämma vattenpotentialen för minst två blad från provet. När vattenpotentialen är högre än cirka minus 0,5 megapascal kan ett prov skördas efter frysning.När vattenpotentialen är lägre än minus 0,5 megapascal, fortsätt med behandlingen för avkoppling. Fixera en vattentät krage runt stammen, som kommer att fyllas med vatten. Använd beskärning saxar eller en såg, skär stammen under vattenytan och hålla den skurna änden av provet under vattnet.Överför provet till en annan behållare med vatten så snabbt som möjligt för att minimera utsätta den skurna änden till luft. För bredlällda arter, se till att längden från den plats där cryoprov för SEM kommer att erhållas till den avskurna kanten på den skördade stammen är längre än provets maximala kärllängd för att förhindra spänningsinducerade artefakter inom kryoprovet. Därefter täcker du provet med en svart plastpåse för att minska transpiration.Håll den skurna änden av provet i vattnet och underhåll detta tillstånd i cirka 30 minuter för att kunna lätta på xylemspänningen. Efter detta, mäta vattenpotentialen igen för att bekräfta avslappningen av xylemspänningen. Använd först sax eller en brukskniv för att skära och öppna ena sidan av en vattentät krage.Fäst kragen tätt runt stammen med självhäftande tejp samtidigt som du håller bländaren horisontellt. Ta på isolerande handskar, och säkert hålla kärlet av flytande kväve. Kör flytande kväve i kragen tills den är full och hålla den fylld genom att stadigt lägga till ytterligare flytande kväve för att helt frysa vattnet i xylem.Efter tillräckligt med frystid, lossa kragen från den frysta delen av provstammen för att avlägsna det flytande kvävet. Använd omedelbart en fin handsåg för att skörda provet. Täck sedan det frusna provet med en bit aluminiumfolie eller lägg tillbaka det i ett provrör.Placera snabbt det skördade provet i en behållare fylld med flytande kväve. Förvara proverna på minus 80 grader Celsius tills redo att utföra observationen. Till att börja, ställ in temperaturen i exemplaret kammaren i kryostaten till minus 30 grader Celsius, som vanligtvis är tillräckligt kallt för att hålla xylem sav av de flesta växter i ett fruset tillstånd.Använd en vass kniv eller en fintandad såg för att trimma provet till en liten bit som kan justeras för preparathållaren på en kryo-SEM. Montera den trimmade biten till en chuck, en hållare för en kryostat, med vävnadsfrysande inbäddningsmedium för kryosektionering. Fäst chucken på en preparathållare av en mikrotom av kryostaten.Trimma ytan genom att upprepade gånger raka av fem till sju mikrometer tjocka sektioner. Att skära bort mer än 1, 000 till 2, 000 mikrometer i totalt djup till den inledande ytan är användbart för elmininating den skadade delen av provet som orsakas av förskärning. Efter att grovputsat en yta av provet, justera en oanvänd del av mikrotombladet ovanför preparats yta.Vidstiga avståndet något mellan provexemplarets yta och bladet. Och skär ytan bara en eller två gånger. Skjut sedan bladet igen och placera en oanvänd del av bladet på preparatytan.Upprepa denna skärbearbetning tre till fyra gånger för att få en klar yta utan knivmärken. Efter det slutliga snittet, ställ bladets läge långt från provet för att förhindra att damm fastnar på provet. Och lösgör chucken från mikrotomen.Därefter fäster du preparatet på en cryo-SEM-preparathållare med vävnadsfrysande inbäddningsmedium i kryostatkammaren. Använd först flytande kväve för att hålla en temperatur under minus 120 Celsius i cryo-SEM-preparatkammaren enligt utrustningens användarhandbok. Därefter placerar du preparathållaren med det preparerade provexemplaret i en isolerande behållare fylld med flytande kväve i kryostatkammaren.Använd en preparat som utbyter stång för att hålla preparathållaren under det flytande kvävet. Snabbt överföra preparathållaren till förevakueringskammaren i cryo-SEM-preparatkammaren så snart som evakueringen av förevakueringskammaren påbörjas. Till att börja, slå på accelerationsspänningen av den elektriska pistolen.Därefter höjer du temperaturen på provstadiet till minus 100 grader Celsius. Vänta i flera minuter så att frostdammet tas bort och att isens ytnivå i xylem-cellerna minskar något jämfört med cellväggarna. Sänk sedan speiumenstadiets temperatur till minus 120 grader Celsius.I denna studie används kryo-SEM observationsmetoder för att tydligt visualisera vattenfördelning på en cellulär skala. Vid låg förstoring anger det svarta området i bilderna de håligheter från vilka vatten helt eller delvis försvinner, medan det grå området anger xylem-cellväggar, cytoplasma och vatten. Vid hög förstoring blir det uppenbart att vattnet inte helt är förlorat från luminan av tre trakeider, vilket indikerar förekomsten av makrobubblor i xylem saven in situ.När det gäller bredstågade arter, kavitation förekomst är lätt att upptäckas inom fartyg, medan vatten existens är svårt att skilja inom fibrer, särskilt vid låg förstoring. Cytoplasman och parenkyma celler kan skiljas från vatten inom trakeider eller fartyg genom is plan texturer. Analys av effekten av temperaturen på frys-etsning processen visar att frostdamm gradvis sublimeras, och endotracehid gropmembran blir tydligare genom progression av sublimering med ökande temperatur.Kvarvarande stora frostdammpartiklar kan elimineras genom ytterligare frys-etsning. Men detta kan vara problematiskt eftersom det i onödan minskar ytnivån av is i xylem-ledningar. Observationens höga kvalitet uppnås i stort sett genom noggrann preparering av exemplar.Underlagets utjämning med mikrotomens vassa blad är särskilt viktigt. Otillräcklig utjämning av ett använt blad kan ibland skapa en grov yta som liknar knivmärken, eller kan skapa många förekomster av damm från nedskärningarna. Prov frysning utan avkoppling av negativt vattenpelartryck kommer att orsaka artifactual induktion av kavitation i xylem-ledningar.Klustrade iskristaller observeras i kärl av exemplar där provet inte var avslappnat. Kontrasterande nog observeras inga klustrade iskristaller i de avslappnade provexemplar med liknande vattenpotential. Tillämpningen av frys-fixering till transpiring levande växter som lider torka kan framkalla resultatbaserade artefakter såsom klustrade iskristaller.Dessa artefakter leder till feltolkningar av vattenstatusen i xylem-ledning. Så det är viktigt att först bekräfta vattenpotentialen hos prover före frysfixering. Även om detta förfarande ger en bild av vilken status i xylem-ledning, måste ett levande träd förstöras för observationen.Att kombinera andra icke-invasiva observationsmetoder såsom MRI eller mikro-CT med subsidiär nivå bild observation kommer att fördjupa vår förståelse av arten mellan vattentransport och användning. Observationen av vattenstatus som införs genom detta dokument kommer också att ge en metod för förtydligande av förhållandet mellan vatten som blandas i celler och andra anatomiska svar på abiotisk eller biotisk stress. Cryo-SEM utrustad med energi dispersiv röntgenspektroskopi eller topp sim har använts för att studera elementfördelning över ytan av ett exemplar som innehåller vatten.Kombinera elementära analys och detta förfarande i att liknande ram kan ge oss djupgående kunskap om xylem cellen beteende i samband med vatten status. När du använder flytande kväve för frys-fixering av prover i ett rum, glöm inte att ventilera rummet för att undvika syrebrist.

Research

JoVE Journal

Environment

Laboratory-determined Phosphorus Flux from Lake Sediments as a Measure of Internal Phosphorus Loading

Laboratorium bestämda Fosfor Flux från sjösediment som ett mått på intern fosforbelastning

Eutrophication is a water quality issue in lakes worldwide, and there is a critical need to identify and control nutrient sources. Internal phosphorus (P) ...

Measuring Fluxes of Mineral Nutrients and Toxicants in Plants with Radioactive Tracers

Att mäta flöden av mineralnäringsämnen och gifter i Växter med radioaktiva markörer

Unidirectional influx and efflux of nutrients and toxicants, and their resultant net fluxes, are central to the nutrition and toxicology of plants. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. I. Collection of Virus Samples

EPA Metod 1615. Mätning av Enterovirus och Norovirus förekomst i vatten efter kultur och RT-qPCR. I. Insamling av virusprov

EPA Method 1615 was developed with a goal of providing a standard method for measuring enteroviruses and noroviruses in environmental and drinking waters. ...

EPA Method 1615. Measurement of Enterovirus and Norovirus Occurrence in Water by Culture and RT-qPCR. Part III. Virus Detection by RT-qPCR

EPA Metod 1615 Mätning av Enterovirus och Norovirus förekomst i vatten efter kultur och RT-qPCR. Del III. Virus Detection med RT-qPCR

EPA Method 1615 measures enteroviruses and noroviruses present in environmental and drinking waters. This method was developed with the goal of having a ...

How to Create Conditioned Taste Aversion for Grazing Ground Covers in Woody Crops with Small Ruminants

Hur man skapar kondition Taste Aversionen för betes Covers i Woody Grödor med små idisslare

Conditioned taste aversion (CTA) is a learning behavior process where animals are trained to reject certain feed after gastrointestinal discomfort has ...

Soil Lysimeter Excavation for Coupled Hydrological, Geochemical, and Microbiological Investigations

Jord lysimeter Grävning för kopplade Hydrologiska, geokemiska och mikrobiologiska undersökningar

Studying co-evolution of hydrological and biogeochemical processes in the subsurface of natural landscapes can enhance the understanding of coupled ...

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

Screening for Endocrine Activity in Water Using Commercially-available In Vitro Transactivation Bioassays

Screening för endokrin aktivitet i vatten med hjälp av kommersiellt tillgängliga<em&gt; In Vitro</em&gt; Transaktiverings Bioanalyser

In vitro transactivation bioassays have shown promise as water quality monitoring tools, however their adoption and widespread application has been ...

A Lipid Extraction and Analysis Method for Characterizing Soil Microbes in Experiments with Many Samples

En lipid extraktions- och analysmetod för karakterisering av markmikrober i experiment med många prov

Microbial communities are important drivers and regulators of ecosystem processes. To understand how management of ecosystems may affect microbial ...

A Simple Planting Technique for Re-establishing Trees Where Frequent Inundation Occurs

En enkel plantering teknik för åter upprättar träd där frekvent översvämning uppstår

Many of the Everglades tree islands have lost elevation over the past century and most of their trees have died such that they are now covered with ...

Sample Preparation Method of Scanning and Transmission Electron Microscope for the Appendages of Woodboring Beetle

Provberedningmetod för skanning och transmissionselektronmikroskop för bihang av träsborre

This report described sample preparation methods that scanning and transmission electron microscope observations, demonstrated by preparing appendages of ...