Name: preparation and immunostaining of myelinating organotypic cerebellar slice cultures
Uploaded: 2019-03-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures at JoVE.com

ونحن نشكر الدكتور شون فريمان، والدكتورة ناتالي سول-فولون والدكتور توماس رو لتعليقات قيمة على المخطوطة. تم تمويل هذا العمل من INSERM، ICM، والمنح أرسيب R13123DD، R17127DD ANR (إلى ميلادي) والعلاجات الزمالة، SPF20110421435 (إلى ميلادي)، FDT20170437332 (لتم). ونشكر مرفق الثقافة الخليوي سيليس و icm. منصة التصوير ضليع في الرياضيات.

جميع الأعمال التي تنطوي على الحيوانات الامتثال للسياسات المؤسسية والمبادئ التوجيهية التي وضعتها UPMC و INSERM والفرنسية وتوجيه مجلس الجماعة الأوروبية 86/609/EEC.
1-إعداد متوسطة الثقافة والثقافة بإدراج (التدريب العملي على الوقت ≈ 10 – 15 دقيقة)
ملاحظة: تنفيذ هذ?...

<ol>
	<li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+Plasticity+and+Nervous+System+Function.">Myelin Plasticity and Nervous System Function.</a> Annual Review Neuroscience. 41, 61-76 (2018).</li><li>Desmazi&#232;res, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+at+the+nodal+and+perinodal+axonal+domains:+a+basis+for+multiple+sclerosis+pathology.">Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple sclerosis pathology.</a> Multiple Sclerosis Houndmills Basingstoke England. 18, 133-137 (2012).</li><li>Waxman, S. G., Ritchie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+the+myelinated+axon.">Molecular dissection of the myelinated axon.</a> Annals of Neurology. 33, 121-136 (1993).</li><li>F&#252;nfschilling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolytic+oligodendrocytes+maintain+myelin+and+long-term+axonal+integrity.">Glycolytic oligodendrocytes maintain myelin and long-term axonal integrity.</a> Nature. 485, 517-521 (2012).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroglia+metabolically+support+axons+and+contribute+to+neurodegeneration.">Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration.</a> Nature. 487, 443-448 (2012).</li><li>Chang, K. -. J., Redmond, S. A., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+myelination:+implications+for+mechanisms+of+neural+plasticity.">Remodeling myelination: implications for mechanisms of neural plasticity.</a> Nature Neurosciences. 19, 190-197 (2016).</li><li>Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mechanism+of+nervous+system+plasticity:+activity-dependent+myelination.">A new mechanism of nervous system plasticity: activity-dependent myelination.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16, 756-767 (2015).</li><li>Nave, K. -. A., Werner, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+of+the+nervous+system:+mechanisms+and+functions.">Myelination of the nervous system: mechanisms and functions.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 503-533 (2014).</li><li>Nave, K. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+and+support+of+axonal+integrity+by+glia.">Myelination and support of axonal integrity by glia.</a> Nature. 468, 244-252 (2010).</li><li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiological Reviews. 81, 871-927 (2001).</li><li>Kluver, H., Barrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+combined+staining+of+cells+and+fibers+in+the+nervous+system.">A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 12, 400-403 (1953).</li><li>Meier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+observations+on+early+myelination+in+the+human+spinal+cord.+Light+and+electron+microscope+study.">Some observations on early myelination in the human spinal cord. Light and electron microscope study.</a> Brain Research. 104, 21-32 (1976).</li><li>Hori, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SIMPLIFIED+ACID+HEMATEIN+TEST+FOR+PHOSPHOLIPIDS.">A SIMPLIFIED ACID HEMATEIN TEST FOR PHOSPHOLIPIDS.</a> Stain Technology. 38, 221-225 (1963).</li><li>Gallyas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+myelin+by+means+of+physical+development.">Silver staining of myelin by means of physical development.</a> Neurological Research. 1, 203-209 (1979).</li><li>Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje+cell+survival+and+axonal+regeneration+are+age+dependent:+an+in+vitro+study.">Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study.</a> Journal of Neuroscience An Official Journal of the Society of Neuroscience. 17, 3710-3726 (1997).</li><li>Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysolecithin+induces+demyelination+in+vitro+in+a+cerebellar+slice+culture+system.">Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system.</a> Journal of Neuroscience Research. 78, 157-166 (2004).</li><li>Zhang, H., Jarjour, A. A., Boyd, A., Williams, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+nervous+system+remyelination+in+culture--a+tool+for+multiple+sclerosis+research.">Central nervous system remyelination in culture--a tool for multiple sclerosis research.</a> Experimental Neurology. 230, 138-148 (2011).</li><li>Rasband, M. N., Peles, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nodes+of+Ranvier:+Molecular+Assembly+and+Maintenance.">The Nodes of Ranvier: Molecular Assembly and Maintenance.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8, a020495 (2015).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neurosciences Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Hussain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+and+Nestorone+facilitate+axon+remyelination:+a+role+for+progesterone+receptors.">Progesterone and Nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors.</a> Endocrinology. , 3820-3831 (2011).</li><li>Wioland, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epsilon+toxin+from+Clostridium+perfringens+acts+on+oligodendrocytes+without+forming+pores,+and+causes+demyelination.">Epsilon toxin from Clostridium perfringens acts on oligodendrocytes without forming pores, and causes demyelination.</a> Cellular Microbiology. 17, 369-388 (2015).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).</li><li>Medina-Rodr&#237;guez, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+in+vivo+remyelination+with+small+molecules:+a+neuroreparative+pharmacological+treatment+for+Multiple+Sclerosis.">Promoting in vivo remyelination with small molecules: a neuroreparative pharmacological treatment for Multiple Sclerosis.</a> Science Reports. 7, (2017).</li><li>Spassky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+steps+of+oligodendrogenesis:+insights+from+the+study+of+the+plp+lineage+in+the+brain+of+chicks+and+rodents.">The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents.</a> Developmental Neurosciences. 23, 318-326 (2001).</li><li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+green+fluorescent+protein+in+the+oligodendrocyte+lineage:+a+transgenic+mouse+for+developmental+and+physiological+studies.">Expression of the green fluorescent protein in the oligodendrocyte lineage: a transgenic mouse for developmental and physiological studies.</a> Journal of Neuroscience Research. 70, 529-545 (2002).</li><li>Gibson, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+promotes+oligodendrogenesis+and+adaptive+myelination+in+the+mammalian+brain.">Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain.</a> Science. 344, 1252304 (2014).</li><li>Tomassy, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+profiles+of+myelin+distribution+along+single+axons+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex.">Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Science. 344, 319-324 (2014).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+sensitive+optical+coherence+microscopy+for+brain+imaging.">Polarization sensitive optical coherence microscopy for brain imaging.</a> Optics Letters. 41, 2213-2216 (2016).</li><li>Freudiger, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biomedical+imaging+with+high+sensitivity+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science. 322, 1857-1861 (2008).</li><li>Lim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+Schwann+cell+myelination+by+third+harmonic+generation+microscopy.">Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).</li><li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy.">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).</li><li>Arancibia-Carcamo, I. L., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+node+of+Ranvier+in+CNS+pathology.">The node of Ranvier in CNS pathology.</a> Acta Neuropathologia. (Berlin). 128, 161-175 (2014).</li></ol>

هنا، نحن بالتفصيل وضع بروتوكول لإنشاء السابقين فيفو نموذج المقابلة لثقافات شريحة أورجانوتيبيك الدماغ الماوس، تكييفها من قبل أساليب نشر15،،من1619 والمايلين اللاحقة إيمونوستينينج لهذه الاستعدادات. توفر هذه الاستراتيجية إمكانية تصور مكون?...

الخلايا العصبية هي الخلايا عالية الاستقطاب، التي تتكون من حجرة الدهليزي الجذعية التي تتلقى مدخلات من بيئتها، ومحور عصبي يضمن توليد ونشر للنبضات الكهربائية إلى خلايا أخرى. الانتشار السريع، والتسليم في الوقت المناسب للمعلومات أمر أساسي للأداء السليم للجهاز العصبي. في الفقاريات، فإنه يسر مييلينيشن، الذي يتيح زيادة سرعة التوصيل محواري1. المايلين بنية متخصصة التي شكلتها طبقات المضغوطة من غشاء البلازما المتولدة عن إطلاق ميليناتينج، إلا وهي أوليجوديندروسيتيس في الجهاز العصبي المركزي (CNS) وخلايا شوان في الجهاز العصبي المحيطي (PNS). في كل من الجهاز العصبي المركزي والسندات الإذنية، التفاعلات أكسوجليال محرك تشكيل المجالات محواري المتخصصة: رانفييه للعقد وتلك المحيطة بها المجالات، وبارانوديس، وجوكستابارانوديس2. شرائح محواري المعزولة من المايلين، أو إينتيرنوديس، بديل مع رانفييه للعقد، التي تتوافق مع المجالات أونميليناتيد صغيرة أثرت في القنوات عن طريق بوابة الجهد الصوديوم (Naالخامس). بتركيز عال والتنشيط السريع للقنواتت نا في رانفييه للعقد يسمح تجديد إمكانات العمل، وجنبا إلى جنب مع خصائص العزل من اﻷغماد المايلين، وضمان التوصيل الفعال والسريع سالتاتوري العصب دفعة على طول محور عصبي3.
بالإضافة إلى دورها في التعجيل بسرعة التوصيل دافع العصبية، يوفر إطلاق ميليناتينج الدعم الأيضية لمحور عصبي، الحفاظ على سلامتها طويلة الأجل والمشاركة في4،بقاء5. وعلاوة على ذلك، أصبح من الواضح في السنوات الأخيرة أن المايلين هو التضمين بشكل حيوي في جميع مراحل الحياة، وبالتالي يفترض أن يشارك في التنظيم واللدونه لمختلف وظائف الجهاز العصبي. وهكذا قد تمثل تسويات للتوزيع، وعدد وطول، وسمك اﻷغماد المايلين على طول محاور عصبية طريقة جديدة لضبط دقة مختلف شبكات6،،من78. ولذلك اقتناء التطوري المايلين عملية رئيسية للوظائف الحسية والحركية والمعرفية واضطراب التفاعل بين محاور عصبية وإطلاق يتزايد اعتبار المساهمة الإنمائية أو المكتسبة عصبية 9من الأمراض.
وقد اتسمت تشكيل المايلين، مع ميزة معينة على نسبة عالية من الدهون (70%) مقارنة بالبروتينات (30%) وعلى النقيض من الأغشية الخلوية الأخرى10. ومع ذلك، خلافا للدهون المايلين، معظم البروتينات المايلين محددة إلى المايلين، بما في ذلك البروتين الأساسية المايلين (MBP)، بروتيوليبيد البروتين (حزب العمال التقدمي)، 2 '، 3' دوري النوكليوتيدات 3 '-فوسفوديستريس (CNP)، المرتبطة المايلين بروتين سكري (ماج)، بروتين سكري oligodendrocyte المايلين (موج)، بمب-22 و P010. توجد أساليب نسيجية مختلفة وصمة عار المايلين استناداً إلى تكوين الدهن، مثل لوكسول السريع الأزرق11، "السودان الأسود ب"12، بيكر هيماتين حمض أسلوب13، فضلا عن الفضة تلطيخ14. ومع ذلك، هذه النهج لا تسمح دائماً للتباين كافية والقرار لتصور الألياف الفردية. نهج بديل للكشف عن المايلين من خلال إيمونوهيستوتشيميستري الموجهة ضد بروتينات المايلين. مختلف الأجسام المضادة استهداف المستضدات المايلين على حدة مع خصوصية عالية ويمكن استخدامها بشكل روتيني للكشف عن الهياكل ميليناتيد. يمكن كشف تفاعل مستضد الضد كذلك استخدام جسم ثانوية بالإضافة إلى فلوروفوري الموجهة ضد جسم الأولية وتصور مع الفحص المجهري fluorescence كافية. وهنا يصف لنا بروتوكولا عن وصمة عار المايلين على السابقين فيفو شرائح الدماغ، نموذج الذي يسمح المحافظة على حسن هندسة النسيج العصبي. وباﻹضافة إلى ذلك، المنظمة وحجم خلايا بوركنجي (العصبية myelinated الوحيد من المخيخ) جعلها نموذجا كلاسيكي للدراسات الكهربية والمثل مثالية لإجراء دراسات ثابتة أو تصوير العيش.
يتم إنشاء الشرائح الدماغ من الفئران P9 P10، وقت المقابلة إلى بداية مبكرة لخلايا بوركنجي myelination، عملية التي يتحقق معظمها خلال أسبوع واحد السابقين فيفو (6-7 أيام في المختبر، DIV)15. وعلاوة على ذلك، وهذا النموذج تكييف للتحقيق في اضطرابات دملينتينغ مثل التصلب المتعدد (MS)، كما يمكن الناجمين عن demyelination واسعة في الدماغ الشرائح باستخدام مركب ليسوفوسفاتيديلتشوليني ميلينوتوكسيك (أو ليسوليسيثين، LPC)، التي يتبعها16،ريميليناتيون عفوية17. تأخذ مكان من يومين بعد إزالة LPC من المتوسط الثقافة ريميليناتيون الذاتية وهو إكمال علاج بعد أسبوع تقريبا.
الانتهاء من هذا البروتوكول يأخذ أبروكسيماتيفيلي 3 أسابيع، بما في ذلك نصف يوم لإعداد الثقافات شريحة الدماغ وأسبوع للحصول على شرائح myelinated تماما، يليه يومان تصل إلى ذروة demyelination وأسبوع آخر للكاملة ريميليناتيون. وبالإضافة إلى ذلك، يمكن إكمال إيمونوهيستوتشيميستري في 2 يوما. البروتوكول الموصوفة هنا هو يتكيف مع القمامة العادية من 6 الفئران الجراء ويحتاج إلى تكييف فيما يتعلق بعدد الحيوانات التي استخدمت في التجربة المزمعة.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BME medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>41010026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (10X HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14180046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Horse Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;Streptomycin (10.000 IU/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gey&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9779-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose Solution (45%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8769-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysophosphatidylcholine (LPC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L4129-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol (100% ethanol)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>20821.330</td>
			<td>Cooled at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#174; X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>500622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>EuroMEDEX</td>
			<td>ET330-A</td>
			<td>pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>06-896</td>
			<td>Dilution 1/300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AB9348</td>
			<td>Dilution 1/150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>NE1019</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma)</td>
			<td>Gift from Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Dilution 1/5 to 1/10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8809</td>
			<td>Dilution 1/150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34151</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Secondary Antibodies conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue chopper</td>
			<td>McIlwain</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14101-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-straight forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved-fine forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11297-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes (60-mm and 100-mm)</td>
			<td>TPP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-, 6-well culture plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell culture inserts (0,4 &#181;m, 30-mm diameter)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>37&#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-end pipette tips</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>134000CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-bore pipette tips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>2079G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td></td>
			<td>20 or 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filters</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td></td>
			<td>0.22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>RS France</td>
			<td></td>
			<td>76 x 26 x 1.1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>RS France</td>
			<td></td>
			<td>22 x 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Sciences Tissue Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>5511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and immunostaining of myelinating organotypic cerebellar slice cultures

في الجهاز العصبي، هو المايلين بنية غشاء معقدة التي تم إنشاؤها بواسطة ميليناتينج الدبقية الخلايا، هي محاور عصبية انشياثيس وتسهل التوصيل الكهربي السريع. لقد ثبت تحوير المايلين تحدث في الأمراض العصبية المختلفة، حيث أنها مرتبطة بعجز وظيفي. وهنا، نحن نقدم وصفاً مفصلاً للسابقين فيفو النموذجي يتكون من شرائح الدماغ أورجانوتيبيك الماوس، التي يمكن الاحتفاظ بها في الثقافة لعدة أسابيع وكذلك يكون المسمى لتصور المايلين.

أمثلة على إيمونوستينينجس المايلين الممثل في شرائح الدماغ أورجانوتيبيك التي تم الحصول عليها من C57black6 P9 P10 البرية من نوع (WT) (الشكل 2A)، فضلا عن حزب العمال التقدمي-بروتينات فلورية خضراء الفئران المحورة وراثيا (الشكل 2)، جنبا إلى جنب مع خلايا بو?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures at JoVE.com

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

إعداد و Immunostaining أورجانوتيبيك ميليناتينج شريحة الدماغ الثقافات

هنا نقدم طريقة لإعداد أورجانوتيبيك الثقافات شريحة من المخيخ الماوس وغمد المايلين تلطيخ من إيمونوهيستوتشيميستري مناسبة للتحقيق في آليات مييلينيشن وريميلينيشن في الجهاز العصبي المركزي.

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

هذه الطريقة تسمح لدراسة الآلية الأساسية للميل والميل على المستوى الخلوي و tissular. هذه التقنية هي في مفترق طرق بين الثقافات الأولية والنهج في الجسم الحي. وهو نموذج سريع ويمكن الوصول إليها مع الميزة الرئيسية للحفاظ على بنية الأنسجة.ومن خلال هذا الإجراء، ستكون ميلينا تيتو، باحثة ما بعد الدكتوراه، ورامي رونزانو، طالبة دكتوراه من مختبري. للبدء ، أدخل مقصًا صغيرًا بلطف في ماغنوم الفورامين وقطع الجمجمة عن طريق إجراء شق جانبي واحد نحو الجانب ، ثم قطع جميع أنحاء الجمجمة الرأسية. لاسترداد الجزء الظهري من الجمجمة، استخدم ملقطًا مستقيمًا جيدًا لرفع الجزء الظهري من الجمجمة بعناية.ثم أعرض بعناية ملقط بين الجمجمة البطنية والدماغ. الوجه بلطف خارج الدماغ وقطع الأعصاب البصرية وثلاثية التوائم مع مقص صغير. بعد ذلك، قم بدور الرأس أو الجزء الظهري من الجمجمة رأساً على عقب فوق طبق ثقافة الخلايا 60 ملليمتراً الذي يحتوي على وسيطة تشريح الجليد الباردة لمساعدة الدماغ على السقوط بالجاذبية.باستخدام ملقط غرامة، وتوجيه الدماغ مع الجانب الظهري التي تواجه لأعلى والجانب البطني الاستلقاء. تحت المجهر المنظار، استخدم الملاطب الدقيقة والمستقيمة لشل حركة الدماغ على الجانب الأمامي. ثم، فصل الدماغ الخلفي عن بقية الدماغ.قطع الرتق المخيخ تحت المخيخ لفصل المخيخ عن بقية الدماغ الخلفي. مرة واحدة يتم عزل المخيخ، واستخدام غرامة، ملقط مستقيم لتمزيق بعناية بعيدا السحايا. عقد المخيخ بلطف مع غرامة، ملقط منحني ووضعها مع الجانب الظهري حتى على منصة بلاستيكية، عموديا على شفرة الحلاقة المروحية.بعد ذلك ، مع طرف ماص معقمة رقيقة ذات نهاية مُتعلقة بماصة ملليلتر واحدة ، يُبتدّع أي وصول إلى وسيط التشريح حول المخيخ. ثم، مع مروحية الأنسجة، شريحة 300 ميكرومتر سميكة أقسام saggital من المخيخ. بعد ذلك، أضف قطرة من توسط التشريح على المخيخ المقطع بلطف.ثم، مع طرف ماصة خنزير واسعة تعلق على ماصة ملليلتر واحد، ببطء الpirate المخيخ شرائح ونقلها مرة أخرى إلى طبق ثقافة خلية 60 ملليمتر التي تحتوي على الجليد الباردة تشريح المتوسطة. بعد ذلك، استخدمي ملقطين مستقيمين وغرامة لفصل الشرائح الفردية. ثم، مع طرف ماصة خنزير واسعة تعلق على ماصة ملليلتر واحد، نقل ما يصل إلى أربع شرائح مختارة من فيرمي، جنبا إلى جنب مع بعض المتوسطة تشريح على إدراج ثقافة واحدة من لوحة ستة بئر.إزالة أي وصول إلى وسيلة تشريح حول شرائح باستخدام طرف ماصة نهاية رقيقة. لإزالة الغموض، وإزالة جميع المتوسطة الثقافة تحت إدراج الثقافة بعد ستة أيام في المختبر، واستبدالها مع ملليلتر واحد في بئر من قبل تدفئة، والثقافة الطازجة المتوسطة التي تحتوي على 0.5 مليغرام لكل ملليلتر LPC. احتضان لمدة 15 إلى 17 ساعة في 37 درجة مئوية في بيئة ثاني أكسيد الكربون 5٪.بعد الحضانة، وغسل إدراج عن طريق وضعها في طبق بيتري 25 ملليلتر تحتوي على ملليلتر واحد من قبل الدافئة ثقافة المتوسطة. ثم، على الفور نقل إدراج الثقافة في لوحة جديدة، ستة جيدا، تحتوي على الطازجة، قبل الدافئة المتوسطة الثقافة. لبدء الكيمياء المناعية، أولا استخدام ملقط لرفع إدراج الثقافة وإزالة الوسط الثقافة تحتها.ثم، إضافة ملليلترين من 4٪ PFA في 1X PBS، PH 7.4، على إدراج الغشاء لإصلاح شرائح cerebellar. بعد 30 دقيقة، اغسل الشرائح ثلاث مرات بمليلترين من 1x PBS لمدة 10 دقائق لكل غسل. بعد ذلك، تحت المجهر المنظار، باستخدام التكبير 25x إلى 30x، استخدم مشرط أو فرشاة لفصل الشرائح بلطف من إدراج الغشاء.ثم استخدم فرشاة لنقل الشرائح العائمة إلى آبار لوحة 4 جيداً، تحتوي على 1x PBS للحد من استهلاك الأجسام المضادة. ثم، الطامح برنامج تلفزيوني من كل بئر واحتضان شرائح في ما قبل تبريد 100٪ الإيثانول في ناقص 20 درجة مئوية لمدة 15 إلى 20 دقيقة. بعد الحضانة، التعرق الإيثانول 100٪ وغسل شرائح لفترة وجيزة مع 1X برنامج تلفزيوني.ثم، يغسل لهم مرتين في درجة حرارة الغرفة مع 1X برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق كل غسل. لمنع مواقع تثبيت الأجسام المضادة غير محددة، التعرق برنامج تلفزيوني واحتضان الشرائح في حل يحتوي على 1X PBS، 5٪ NGS، و 0.3٪ المنظفات غير الأيونية في درجة حرارة الغرفة لمدة 30 إلى 45 دقيقة. بعد ذلك، أضف الأجسام المضادة الأولية المخففة في محلول الحجب واحتضان الشرائح عند أربع درجات مئوية بين عشية وضحاها.بعد الحضانة بين عشية وضحاها، وغسل شرائح ثلاث مرات مع 1X برنامج تلفزيوني لمدة 10 دقائق كل غسل. ثم إضافة الأجسام المضادة الثانوية، المخففة في محلول الحجب، بنسبة تخفيف واحد إلى 500 واحتضان الشرائح في درجة حرارة الغرفة في الظلام لمدة ثلاث ساعات. بعد الحضانة مع الأجسام المضادة الثانوية، وغسل شرائح ثلاث مرات في 1X PBS في الظلام لمدة 10 دقائق كل غسل.بعد ذلك ، تحت مجهر منظار ، ضع 100 ميكروليترز من PBS 1x على الشريحة ومع فرشاة ، قم بنقل الشرائح إلى PBS وتسطيحها على الشريحة. إزالة أي وصول من برنامج تلفزيوني. وأخيرا، ضع قطرة من المتوسط المتصاعد مباشرة على زلة الغطاء الزجاجي وتغطية شرائح بلطف.لوحظت مناعة Myelin في شرائح cerebellar organotypic ، التي تم الحصول عليها من أيام ما بعد الولادة 9 إلى 10 C57 أسود ستة فئران من النوع البري في 11 يومًا في المختبر مع عقد من ronviae المخصبة في قنوات الصوديوم المسورة الجهد ، محاطة بمجال تقاطع axoglial paranodal. ولوحظت نفس النتائج بالنسبة للفئران المعدلة وراثيا من PLP-GFP. ويتحقق في الغالب myelination من الخلايا parkengy بعد أسبوع واحد في الثقافة.علاج LPC تماما demyelinates الشرائح، والتي remyelinate تلقائيا ويتم النخاع تماما ستة أيام بعد إزالة الغموض. وينبغي أن يستغرق هذا الإجراء 25 دقيقة كحد أقصى. إنها حقاً النقطة الأكثر أهمية.تعتبر ثقافة شريحة Organotypic مناسبة لدراسة التصوير الحية لديناميات التخيل. ويمكن أيضا أن تستخدم لاستهداف تجارب فحص المخدرات. هذه التقنية تسمح سهلة، نهج كمي لدراسة عمليات الثنية وإعادة النعيم.المجربون هي اتباع إجراءات السلامة الأساسية المطبقة على رعاية الحيوان، وفرط وحادة myelination.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

وعضوي النمط الثقافة شريحة الحصين النموذجي لفحص الإصابات متعلق بالخلايا العصبية

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

إعداد شريحة ، التثقيف الأنسجة وتسجيل Luciferase عضوي النمط من النشاط الجيني في نواة ساعة التأقلم

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

عضوي النمط الثقافات شريحة الحصين

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

مخيخي الثقافات عضوي النمط : التحديات والكشف عن أفكارك

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

تسجيل خلية كاملة من إعداد عضوي النمط شريحة من القشرة المخية الحديثة

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

الاشتقاق الثقافات Oligodendrocyte المخصب وOligodendrocyte نيورون / Myelinating المشارك من الثقافات في مرحلة ما بعد الولادة مناديل الفئران

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

الثقافات شريحة عضوي النمط من المخ الأوسط بطني الجنينية : نظام لدراسة التنمية متعلق بالخلايا العصبية الدوبامينية في المختبر</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

على تحليل من الخليوي بركينيي علم الصرف شجيرى في الثقافات شريحة عضوي النمط

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

الثقافات شريحة عضوي النمط لدراسة ديناميات دبقية قليلة التغصن وتكون الميالين

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

وتحليل وعائية عصبية إعادة عرض في Entorhino-الحصين الثقافات شريحة عضوي النمط

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...