Name: preparation and immunostaining of myelinating organotypic cerebellar slice cultures
Uploaded: 2019-03-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures at JoVE.com

Vi takker Dr. Sean Freeman, Dr. Nathalie Sol-Foulon og Dr. Thomas Roux for værdifulde kommentarer til manuskriptet. Dette arbejde blev finansieret af INSERM, ICM, ARSEP tilskud R13123DD, ANR R17127DD (til e.kr.) og FRM fellowship, SPF20110421435 (til e.kr.), FDT20170437332 (til M.T.). Vi takker CELIS celle kultur facilitet og icm. Quant imaging platform.

Alt arbejde, der involverer dyr overholdt institutionelle politikker og retningslinier som den UPMC, INSERM og de franske og europæiske EF Rådets direktiv 86/609/EØF.
1. forberedelse af dyrkningsmediet og kultur indsætter (Hands-on tid ≈ 10 – 15 min)
Bemærk: Udføre dette trin i et flow kultur hood under sterile betingelser
<ol><li>Forberede 40 mL af næringssubstratet, som består af 50% BME, 25% Hank afbalanceret saltopløsning (1 x), 2...

<ol>
	<li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+Plasticity+and+Nervous+System+Function.">Myelin Plasticity and Nervous System Function.</a> Annual Review Neuroscience. 41, 61-76 (2018).</li><li>Desmazi&#232;res, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+at+the+nodal+and+perinodal+axonal+domains:+a+basis+for+multiple+sclerosis+pathology.">Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple sclerosis pathology.</a> Multiple Sclerosis Houndmills Basingstoke England. 18, 133-137 (2012).</li><li>Waxman, S. G., Ritchie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+the+myelinated+axon.">Molecular dissection of the myelinated axon.</a> Annals of Neurology. 33, 121-136 (1993).</li><li>F&#252;nfschilling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolytic+oligodendrocytes+maintain+myelin+and+long-term+axonal+integrity.">Glycolytic oligodendrocytes maintain myelin and long-term axonal integrity.</a> Nature. 485, 517-521 (2012).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroglia+metabolically+support+axons+and+contribute+to+neurodegeneration.">Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration.</a> Nature. 487, 443-448 (2012).</li><li>Chang, K. -. J., Redmond, S. A., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+myelination:+implications+for+mechanisms+of+neural+plasticity.">Remodeling myelination: implications for mechanisms of neural plasticity.</a> Nature Neurosciences. 19, 190-197 (2016).</li><li>Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mechanism+of+nervous+system+plasticity:+activity-dependent+myelination.">A new mechanism of nervous system plasticity: activity-dependent myelination.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16, 756-767 (2015).</li><li>Nave, K. -. A., Werner, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+of+the+nervous+system:+mechanisms+and+functions.">Myelination of the nervous system: mechanisms and functions.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 503-533 (2014).</li><li>Nave, K. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+and+support+of+axonal+integrity+by+glia.">Myelination and support of axonal integrity by glia.</a> Nature. 468, 244-252 (2010).</li><li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiological Reviews. 81, 871-927 (2001).</li><li>Kluver, H., Barrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+combined+staining+of+cells+and+fibers+in+the+nervous+system.">A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 12, 400-403 (1953).</li><li>Meier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+observations+on+early+myelination+in+the+human+spinal+cord.+Light+and+electron+microscope+study.">Some observations on early myelination in the human spinal cord. Light and electron microscope study.</a> Brain Research. 104, 21-32 (1976).</li><li>Hori, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SIMPLIFIED+ACID+HEMATEIN+TEST+FOR+PHOSPHOLIPIDS.">A SIMPLIFIED ACID HEMATEIN TEST FOR PHOSPHOLIPIDS.</a> Stain Technology. 38, 221-225 (1963).</li><li>Gallyas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+myelin+by+means+of+physical+development.">Silver staining of myelin by means of physical development.</a> Neurological Research. 1, 203-209 (1979).</li><li>Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje+cell+survival+and+axonal+regeneration+are+age+dependent:+an+in+vitro+study.">Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study.</a> Journal of Neuroscience An Official Journal of the Society of Neuroscience. 17, 3710-3726 (1997).</li><li>Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysolecithin+induces+demyelination+in+vitro+in+a+cerebellar+slice+culture+system.">Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system.</a> Journal of Neuroscience Research. 78, 157-166 (2004).</li><li>Zhang, H., Jarjour, A. A., Boyd, A., Williams, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+nervous+system+remyelination+in+culture--a+tool+for+multiple+sclerosis+research.">Central nervous system remyelination in culture--a tool for multiple sclerosis research.</a> Experimental Neurology. 230, 138-148 (2011).</li><li>Rasband, M. N., Peles, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nodes+of+Ranvier:+Molecular+Assembly+and+Maintenance.">The Nodes of Ranvier: Molecular Assembly and Maintenance.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8, a020495 (2015).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neurosciences Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Hussain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+and+Nestorone+facilitate+axon+remyelination:+a+role+for+progesterone+receptors.">Progesterone and Nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors.</a> Endocrinology. , 3820-3831 (2011).</li><li>Wioland, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epsilon+toxin+from+Clostridium+perfringens+acts+on+oligodendrocytes+without+forming+pores,+and+causes+demyelination.">Epsilon toxin from Clostridium perfringens acts on oligodendrocytes without forming pores, and causes demyelination.</a> Cellular Microbiology. 17, 369-388 (2015).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).</li><li>Medina-Rodr&#237;guez, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+in+vivo+remyelination+with+small+molecules:+a+neuroreparative+pharmacological+treatment+for+Multiple+Sclerosis.">Promoting in vivo remyelination with small molecules: a neuroreparative pharmacological treatment for Multiple Sclerosis.</a> Science Reports. 7, (2017).</li><li>Spassky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+steps+of+oligodendrogenesis:+insights+from+the+study+of+the+plp+lineage+in+the+brain+of+chicks+and+rodents.">The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents.</a> Developmental Neurosciences. 23, 318-326 (2001).</li><li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+green+fluorescent+protein+in+the+oligodendrocyte+lineage:+a+transgenic+mouse+for+developmental+and+physiological+studies.">Expression of the green fluorescent protein in the oligodendrocyte lineage: a transgenic mouse for developmental and physiological studies.</a> Journal of Neuroscience Research. 70, 529-545 (2002).</li><li>Gibson, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+promotes+oligodendrogenesis+and+adaptive+myelination+in+the+mammalian+brain.">Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain.</a> Science. 344, 1252304 (2014).</li><li>Tomassy, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+profiles+of+myelin+distribution+along+single+axons+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex.">Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Science. 344, 319-324 (2014).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+sensitive+optical+coherence+microscopy+for+brain+imaging.">Polarization sensitive optical coherence microscopy for brain imaging.</a> Optics Letters. 41, 2213-2216 (2016).</li><li>Freudiger, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biomedical+imaging+with+high+sensitivity+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science. 322, 1857-1861 (2008).</li><li>Lim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+Schwann+cell+myelination+by+third+harmonic+generation+microscopy.">Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).</li><li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy.">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).</li><li>Arancibia-Carcamo, I. L., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+node+of+Ranvier+in+CNS+pathology.">The node of Ranvier in CNS pathology.</a> Acta Neuropathologia. (Berlin). 128, 161-175 (2014).</li></ol>

Her, vi detalje en protokol til at generere en ex vivo model svarer til musen cerebellare organotypic skive kulturer, tilpasset fra tidligere publicerede metoder15,16,19 , og den efterfølgende myelin immunfarvning af disse præparater. Denne strategi tilbyder mulighed for at visualisere myelin komponenter med en høj opløsning i både sunde og patologiske stater.
Cerebellare organotypic skive kultur...

Neuroner er særdeles polariseret celler, der omfatter en somato-dendritiske rum, der modtager input fra sine omgivelser og et axon, som sikrer, at den generation og udbredelsen af elektriske impulser til andre celler. Hurtige formering og rettidig levering af oplysninger er afgørende for et velfungerende nervesystem. I hvirveldyr, er det lettere ved myelination, som giver mulighed for øget cytoskeletale overledning hastighed1. Myelin er en specialiseret struktur dannes af sammenpresset lag af plasma membran genereret af myelinating glia, nemlig oligodendrocytes i centralnervesystemet (CNS) og Schwann celler i det perifere nervesystem (PNS). Både i CNS og PNS, axoglial interaktioner drive dannelsen af specialiserede cytoskeletale domæner: noder af Ranvier og deres omgivende domæner, paranodes og juxtaparanodes2. De cytoskeletale segmenter isoleret af myelin, eller stængelled, suppleant med noder af Ranvier, som svarer til små unmyelinated domæner beriget med spænding-gated natrium kanaler (Nav). Høj koncentration og hurtig aktivering af Nav kanaler på noder af Ranvier tillade regenerering af handling potentialer, og sammen med de isolerende egenskaber af myelin skeder, sikre effektiv og hurtig saltatory overledning af den nerve impuls langs axon3.
Ud over sin rolle i accelererende nerve impuls overledning hastighed, giver myelinating glia metaboliske støtte til axon, bevare dens langsigtede integritet og deltage i dets overlevelse4,5. Derudover er det blevet klart i de seneste år at myelin dynamisk moduleres hele livet, således formentlig deltager i forordningen og plasticitet af forskellige nervesystem funktioner. Justeringer af fordeling, antal, længde og tykkelse af myelin skeder langs axoner kan således repræsenterer en roman fint tune forskellige netværk6,7,8. Derfor, den evolutionære erhvervelse af myelin er en central proces for sensoriske, motoriske og kognitive funktioner og den undertrykkelse af netbårne af samspillet mellem axoner og glia er i stigende grad betragtes som et bidrag til den udviklingsmæssige eller erhvervede neurologiske sygdomme9.
Myelin sammensætning er blevet karakteriseret, med det specifikke ved en høj andel af lipider (70%) i forhold til proteiner (30%) i modsætning til andre cellulære membraner10. Men i modsætning til myelin lipider, de fleste af myelin proteiner er specifikke for myelin, herunder myelin grundlæggende protein (MBPS), proteolipid protein (PLP), 2', 3'-cyklisk nukleotid 3'-phosphodiesterase (CNP), myelin-associerede glycoprotein (MAG), myelin-oligodendrocyte glycoprotein (MOG), PMP-22 og P010. Forskellige histologiske metoder at plette myelin findes baseret på lipid sammensætning, såsom Luxol hurtigt blå11, Sudan Black B12, Bakers syre hematin metode13, samt sølvfarvning14. Ikke desto mindre mulighed disse metoder ikke altid for en passende kontrast og opløsning til at visualisere enkelte fibre. En alternativ fremgangsmåde til at registrere myelin er gennem Immunhistokemi rettet mod myelin proteiner. Forskellige antistoffer rettet mod myelin-specifikke antigener med en høj specificitet og kan bruges rutinemæssigt til at opdage myelinerede strukturer. Antigen-antistof interaktion kan afsløres yderligere, ved hjælp af en sekundær antistof koblet til en fluorophore rettet mod de primære antistof og visualiseret med passende Fluorescens mikroskopi. Her, beskriver vi en immunokemisk protokol for at plette myelin på ex vivo cerebellare skiver, en model, som giver mulighed for en god konservering af nervevæv arkitektur. Derudover organisation og størrelse af Purkinje celler (den eneste myelinerede neuron af lillehjernen) gør dem et klassisk model for elektrofysiologiske undersøgelser og de er ligeledes ideel til at udføre fast eller live imaging studier.
De cerebellare skiver er genereret fra P9-P10 mus, gangen svarer til den tidlige start af Purkinje celle myelination, en proces, der opnås for det meste af en uge ex vivo (6-7 dage in vitro DIV)15. Endvidere, denne model er tilpasset til at undersøge demyeliniserende lidelser som multipel sklerose (MS), som en omfattende demyelinering kan være fremkaldt i cerebellare skiver ved hjælp af myelinotoxic sammensatte lysophosphatidylcholine (eller lysolecithin, LPC), som er efterfulgt af en spontan remyelination16,17. Endogene remyelination finder sted fra to dage efter LPC fjernelse af næringssubstratet og er næsten komplet efterbehandling en uge.
Gennemførelsen af denne protokol tager ca 3 uger, herunder en halv dag til cerebellare skive kulturer forberedelse, en uge til at opnå fuldt myelinerede skiver, efterfulgt af 2 dage at nå toppen af demyelinering og endnu en uge for deres fulde remyelination. Derudover kan Immunhistokemi være afsluttet i 2 dage. Protokollen beskrevet her er tilpasset et standard kuld af 6 mus unger og tilpasses med hensyn til antallet af dyr, der anvendes til de planlagte eksperiment.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BME medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>41010026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (10X HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14180046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Horse Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;Streptomycin (10.000 IU/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gey&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9779-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose Solution (45%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8769-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysophosphatidylcholine (LPC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L4129-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol (100% ethanol)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>20821.330</td>
			<td>Cooled at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#174; X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>500622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>EuroMEDEX</td>
			<td>ET330-A</td>
			<td>pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>06-896</td>
			<td>Dilution 1/300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AB9348</td>
			<td>Dilution 1/150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>NE1019</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma)</td>
			<td>Gift from Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Dilution 1/5 to 1/10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8809</td>
			<td>Dilution 1/150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34151</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Secondary Antibodies conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue chopper</td>
			<td>McIlwain</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14101-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-straight forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved-fine forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11297-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes (60-mm and 100-mm)</td>
			<td>TPP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-, 6-well culture plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell culture inserts (0,4 &#181;m, 30-mm diameter)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>37&#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-end pipette tips</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>134000CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-bore pipette tips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>2079G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td></td>
			<td>20 or 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filters</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td></td>
			<td>0.22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>RS France</td>
			<td></td>
			<td>76 x 26 x 1.1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>RS France</td>
			<td></td>
			<td>22 x 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Sciences Tissue Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>5511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and immunostaining of myelinating organotypic cerebellar slice cultures

I nervesystemet er myelin en kompleks membran struktur genereret af myelinating glial celler, hvilket ensheathes axoner og letter hurtigt elektriske overledning. Myelin ændring har vist sig at forekomme i forskellige neurologiske sygdomme, hvor det er forbundet med funktionelle mangler. Her vi give en detaljeret beskrivelse af en ex vivo model bestående af mus organotypic cerebellare skiver, som kan opretholdes i kultur i flere uger og yderligere være mærket for at visualisere myelin.

Eksempler på repræsentative myelin immunostainings i organotypic cerebellare skiver fremstillet af P9-P10 C57black6 wild-type (WT) (figur 2A), samt PLP-normal god landbrugspraksis Transgene mus (figur 2B), sammen med Purkinje celler farvning. Cerebellare skiver myelinate fra den hvide substans spor region af skiver mod periferien af folia og myelination af cellerne, Purkinje opnås oftest efter 6-7 DIV. På 7 DIV er induktion a...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures at JoVE.com

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Forberedelse og immunfarvning af Myelinating Organotypic cerebellare skive kulturer

Her vil vi præsentere en metode til at forberede organotypic skive kulturer fra mus lillehjernen og myelinskeden farvning af Immunhistokemi egnet til at undersøge mekanismerne i myelination og remyelination i det centrale nervesystem.

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Denne metode gør det muligt at studere den grundlæggende mekanisme af myelination og remyelination på celle- og tissularniveau. Denne teknik er på krydsvej mellem primære kulturer og in vivo tilgange. Det er en hurtig og tilgængelig model med den største fordel ved at bevare vævsarkitekturen.Demonstration af proceduren vil være Melina Thetiot, en postdoc forsker og Remi Ronzano, en ph.d.-studerende fra mit laboratorium. Til at begynde, indsætte en lille saks forsigtigt ind i foramen magnum og skære kraniet ved at gøre en lateral snit mod siden, og derefter skæres rundt om hovedet kraniet. For at hente den dorsale del af kraniet, skal du bruge en fin, lige kraft, så du forsigtigt løfter den dorsale del af kraniet.Derefter omhyggeligt indføre scerene mellem ventrale kraniet og hjernen. Forsigtigt flip ud hjernen og skære optiske og trigeminusnerver med lille saks. Drej derefter hovedet eller den dorsale del af kraniet på hovedet lige over en 60 millimeter cellekulturskål, der indeholder iskold dissektionsmedium for at hjælpe hjernen til at falde af tyngdekraften.Brug fine scener, orientere hjernen med dorsal side vender opad og ventrale side liggende. Under kikkertmikroskopet skal du bruge de fine, lige kraftbecer til at immobilisere hjernen på forhjernen. Derefter adskille baghjernen fra resten af hjernen.Skær cerebellar stilke under lillehjernen for at adskille lillehjernen fra resten af baghjernen. Når lillehjernen er isoleret, skal du bruge fine, lige kraftang til omhyggeligt at rive væk meninges. Hold lillehjernen forsigtigt med de fine, buede snævler og placer den med dorsalsiden op på plastplatformen, vinkelret på hakkerens barberblad.Dernæst, med en steril, tynd ende pipette spids fastgjort til en en milliliter pipette, aspirere enhver adgang til dissektion medium omkring lillehjernen. Derefter, med en væv chopper, skive 300 mikrometer tykke saggital dele af lillehjernen. Dernæst tilsættes en dråbe dissektion medium på den skivede lillehjernen forsigtigt.Derefter, med en bred orne pipette spids fastgjort til den ene milliliter pipette, langsomt aspirere den skivede lillehjernen og overføre den tilbage i 60 millimeter cellekultur fad indeholder iskold dissektion medium. Brug derefter to fine, lige kraftperne til at adskille de enkelte skiver. Derefter, med en bred orne pipette spids fastgjort til den ene milliliter pipette, overføre op til fire udvalgte skiver fra vermis, sammen med nogle dissektion medium på en kultur indsætte af en seks godt plade.Fjern enhver adgang til dissektion medium omkring skiver ved hjælp af en tynd ende pipette spids. Ved demyelinisering fjernes al kulturmedium under kulturindsatsen efter seks dages in vitro, og den erstattes med en milliliter pr. brønd af det forvarmte, friske kulturmedium, der indeholder 0,5 mg pr. milliliter LPC. Inkuber i 15 til 17 timer ved 37 grader Celsius i 5% kuldioxid miljø.Efter inkubationen vaskes skærene ved at anbringe dem i en 25 milliliter petriskål med en milliliter forvarmt kulturmedium. Derefter straks overføre kultur skær i en ny, seks godt plade, der indeholder friske, forvardte kultur medium. Til at begynde immunohistochemistry, første brug hændel til at løfte kultur skær og fjerne kulturmediet under dem.Derefter tilsættes to milliliter 4% PFA i 1x PBS, ph 7.4, på membranindsatserne for at fastgøre cerebellar skiverne. Efter 30 minutter vaskes skiverne tre gange med to milliliter 1x PBS i 10 minutter hver vask. Dernæst under kikkertmikroskopet, ved hjælp af en 25x til 30x forstørrelse, skal du bruge en skalpel eller en pensel til forsigtigt at løsne skiverne fra membranen skær.Brug derefter en børste til at overføre de flydende skiver til brøndene på en fire brøndplade, der indeholder 1x PBS for at begrænse antistofforbruget. Derefter indsugning PBS fra hver brønd og inkubere skiverne i forkølet 100% ethanol ved minus 20 grader Celsius i 15 til 20 minutter. Efter inkubation, aspirere 100% ethanol og vask skiverne kort med 1x PBS.Vask dem derefter to gange ved stuetemperatur med 1x PBS i 10 minutter hver vask. For at blokere ikke-specifikke antistoffikseringssteder skal PBS aspirere og indkube skiverne i en opløsning, der indeholder 1x PBS, 5%NGS og 0,3%nonionisk rengøringsmiddel ved stuetemperatur i 30 til 45 minutter. Dernæst tilsættes primære antistoffer fortyndet i blokerende opløsning og inkubere skiverne ved fire grader Celsius natten over.Efter inkubation natten vaskes skiverne tre gange med 1x PBS i 10 minutter hver vask. Derefter tilsættes de sekundære antistoffer, fortyndet i blokeringsopløsningen, ved et til 500 fortyndingsforhold og inkubere skiverne ved stuetemperatur i mørke i tre timer. Efter inkubation med det sekundære antistof vaskes skiverne tre gange i 1x PBS i mørke i 10 minutter hver vask.Dernæst under et kikkertmikroskop skal du placere 100 mikroleter af 1x PBS på diaset og med en pensel overføre skiverne til PBS og flade dem på diaset. Fjern enhver adgang til PBS. Til sidst skal du placere en dråbe monteringsmedium direkte på glasdækslet og forsigtigt dække skiverne.Myelin immunostainings i organotypiske cerebellar skiver, fremstillet af post natal dage 9 til 10 C57 sorte seks vilde type mus blev observeret på 11 dage in vitro med knudepunkter af ronviae beriget med spænding gated natrium kanaler, flankeret af paranodal aksulalt krydset domæne. Der blev observeret samme resultater for TRANSP-GFP transgene mus. Myelination af parkengy celler er for det meste opnås efter en uge i kultur.LPC behandling fuldt afmyelinates skiverne, som remyelinate spontant og er fuldt myelinerede seks dage efter demyelinisering. Denne procedure bør tage højst 25 minutter. Det er virkelig det mest kritiske punkt.Organotypic skive kultur er egnet til levende billeddannelse undersøgelse af myelination dynamik. Det kan også bruges til at målrette narkotika screening eksperimenter. Denne teknik giver mulighed for en nem, kvantitativ tilgang til at studere myelination og remyelination processer.Eksperimentatorerne skal følge de grundlæggende sikkerhedsprocedurer, der gælder for dyrevelfærd, overdreven og skarp myelinisering.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypiske Slice Kulturer af Embryonale ventrale midthjernen: et system til undersøgelse Dopaminerge Neuronal Udvikling In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Organotypiske skivekulturer at studere oligodendrocyt Dynamics og myelinering

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Analysen af ​​neurovaskulære Remodeling i Entorhino-hippocampus organotypisk skivekulturer

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...