Name: preparation and immunostaining of myelinating organotypic cerebellar slice cultures
Uploaded: 2019-03-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures at JoVE.com

Wij danken Dr. Sean Freeman, Dr. Nathalie Sol-Foulon en Dr. Thomas Roux voor waardevolle opmerkingen over het manuscript. Dit werk werd gefinancierd door INSERM, ICM, ARSEP subsidies R13123DD, R17127DD van de ANR (tot A.D.) en FRM fellowship, SPF20110421435 (tot A.D.), FDT20170437332 (naar M.T.). Wij danken de CELIS faciliteit voor de cultuur van de cel en de icm. Quant imaging platform.

Alle werkzaamheden waarbij dieren worden institutionele beleidslijnen en door de UPMC, INSERM en de Franse en Europese gemeenschapsrichtlijn 86/609/EEG vastgestelde richtsnoeren nageleefd.
1. voorbereiding van de voedingsbodem en cultuur wordt ingevoegd (Hands-on tijd ≈ 10-15 min)
Opmerking: Voer deze stap uit in een stroom cultuur kap onder steriele omstandigheden
<ol><li>Bereiden van 40 mL gestolde voedingsbodem, die uit 50 bestaat % BME, 25% ...

<ol>
	<li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+Plasticity+and+Nervous+System+Function.">Myelin Plasticity and Nervous System Function.</a> Annual Review Neuroscience. 41, 61-76 (2018).</li><li>Desmazi&#232;res, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+at+the+nodal+and+perinodal+axonal+domains:+a+basis+for+multiple+sclerosis+pathology.">Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple sclerosis pathology.</a> Multiple Sclerosis Houndmills Basingstoke England. 18, 133-137 (2012).</li><li>Waxman, S. G., Ritchie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+the+myelinated+axon.">Molecular dissection of the myelinated axon.</a> Annals of Neurology. 33, 121-136 (1993).</li><li>F&#252;nfschilling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolytic+oligodendrocytes+maintain+myelin+and+long-term+axonal+integrity.">Glycolytic oligodendrocytes maintain myelin and long-term axonal integrity.</a> Nature. 485, 517-521 (2012).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroglia+metabolically+support+axons+and+contribute+to+neurodegeneration.">Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration.</a> Nature. 487, 443-448 (2012).</li><li>Chang, K. -. J., Redmond, S. A., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+myelination:+implications+for+mechanisms+of+neural+plasticity.">Remodeling myelination: implications for mechanisms of neural plasticity.</a> Nature Neurosciences. 19, 190-197 (2016).</li><li>Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mechanism+of+nervous+system+plasticity:+activity-dependent+myelination.">A new mechanism of nervous system plasticity: activity-dependent myelination.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16, 756-767 (2015).</li><li>Nave, K. -. A., Werner, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+of+the+nervous+system:+mechanisms+and+functions.">Myelination of the nervous system: mechanisms and functions.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 503-533 (2014).</li><li>Nave, K. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+and+support+of+axonal+integrity+by+glia.">Myelination and support of axonal integrity by glia.</a> Nature. 468, 244-252 (2010).</li><li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiological Reviews. 81, 871-927 (2001).</li><li>Kluver, H., Barrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+combined+staining+of+cells+and+fibers+in+the+nervous+system.">A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 12, 400-403 (1953).</li><li>Meier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+observations+on+early+myelination+in+the+human+spinal+cord.+Light+and+electron+microscope+study.">Some observations on early myelination in the human spinal cord. Light and electron microscope study.</a> Brain Research. 104, 21-32 (1976).</li><li>Hori, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SIMPLIFIED+ACID+HEMATEIN+TEST+FOR+PHOSPHOLIPIDS.">A SIMPLIFIED ACID HEMATEIN TEST FOR PHOSPHOLIPIDS.</a> Stain Technology. 38, 221-225 (1963).</li><li>Gallyas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+myelin+by+means+of+physical+development.">Silver staining of myelin by means of physical development.</a> Neurological Research. 1, 203-209 (1979).</li><li>Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje+cell+survival+and+axonal+regeneration+are+age+dependent:+an+in+vitro+study.">Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study.</a> Journal of Neuroscience An Official Journal of the Society of Neuroscience. 17, 3710-3726 (1997).</li><li>Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysolecithin+induces+demyelination+in+vitro+in+a+cerebellar+slice+culture+system.">Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system.</a> Journal of Neuroscience Research. 78, 157-166 (2004).</li><li>Zhang, H., Jarjour, A. A., Boyd, A., Williams, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+nervous+system+remyelination+in+culture--a+tool+for+multiple+sclerosis+research.">Central nervous system remyelination in culture--a tool for multiple sclerosis research.</a> Experimental Neurology. 230, 138-148 (2011).</li><li>Rasband, M. N., Peles, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nodes+of+Ranvier:+Molecular+Assembly+and+Maintenance.">The Nodes of Ranvier: Molecular Assembly and Maintenance.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8, a020495 (2015).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neurosciences Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Hussain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+and+Nestorone+facilitate+axon+remyelination:+a+role+for+progesterone+receptors.">Progesterone and Nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors.</a> Endocrinology. , 3820-3831 (2011).</li><li>Wioland, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epsilon+toxin+from+Clostridium+perfringens+acts+on+oligodendrocytes+without+forming+pores,+and+causes+demyelination.">Epsilon toxin from Clostridium perfringens acts on oligodendrocytes without forming pores, and causes demyelination.</a> Cellular Microbiology. 17, 369-388 (2015).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).</li><li>Medina-Rodr&#237;guez, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+in+vivo+remyelination+with+small+molecules:+a+neuroreparative+pharmacological+treatment+for+Multiple+Sclerosis.">Promoting in vivo remyelination with small molecules: a neuroreparative pharmacological treatment for Multiple Sclerosis.</a> Science Reports. 7, (2017).</li><li>Spassky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+steps+of+oligodendrogenesis:+insights+from+the+study+of+the+plp+lineage+in+the+brain+of+chicks+and+rodents.">The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents.</a> Developmental Neurosciences. 23, 318-326 (2001).</li><li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+green+fluorescent+protein+in+the+oligodendrocyte+lineage:+a+transgenic+mouse+for+developmental+and+physiological+studies.">Expression of the green fluorescent protein in the oligodendrocyte lineage: a transgenic mouse for developmental and physiological studies.</a> Journal of Neuroscience Research. 70, 529-545 (2002).</li><li>Gibson, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+promotes+oligodendrogenesis+and+adaptive+myelination+in+the+mammalian+brain.">Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain.</a> Science. 344, 1252304 (2014).</li><li>Tomassy, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+profiles+of+myelin+distribution+along+single+axons+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex.">Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Science. 344, 319-324 (2014).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+sensitive+optical+coherence+microscopy+for+brain+imaging.">Polarization sensitive optical coherence microscopy for brain imaging.</a> Optics Letters. 41, 2213-2216 (2016).</li><li>Freudiger, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biomedical+imaging+with+high+sensitivity+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science. 322, 1857-1861 (2008).</li><li>Lim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+Schwann+cell+myelination+by+third+harmonic+generation+microscopy.">Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).</li><li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy.">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).</li><li>Arancibia-Carcamo, I. L., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+node+of+Ranvier+in+CNS+pathology.">The node of Ranvier in CNS pathology.</a> Acta Neuropathologia. (Berlin). 128, 161-175 (2014).</li></ol>

Hier, we detail een protocol voor het genereren van een ex vivo model overeenkomt met de muis cerebellaire organotypic segment culturen, aangepast van eerder gepubliceerde methoden15,16,19 en de daaropvolgende myeline immunokleuring van deze preparaten. Deze strategie biedt de mogelijkheid om te visualiseren van myeline onderdelen met een hoge resolutie in zowel gezonde en pathologische staten.
Cerebe...

Neuronen zijn zeer gepolariseerde cellen, die bestaan uit een compartiment somato-dendritische die ingangen ontvangt van haar omgeving en een axon die zorgt voor de generatie en de verspreiding van elektrische impulsen naar andere cellen. Snelle voortplanting en tijdige levering van informatie is essentieel voor de goede werking van het zenuwstelsel. In gewervelde dieren, wordt het door de myelinisering, waardoor verhoging van axonale geleiding snelheid1vergemakkelijkt. Myeline is een gespecialiseerde structuur gevormd door samengeperste lagen van plasmamembraan gegenereerd door de myelinating-glia, namelijk oligodendrocyten in het centrale zenuwstelsel (CNS) en Schwann cellen in het perifere zenuwstelsel (PNS). Zowel in het centraal zenuwstelsel en de PNS, axoglial interacties rijden de vorming van gespecialiseerde axonale domeinen: de knooppunten van Ranvier en hun omliggende domeinen, de paranodes en juxtaparanodes2. De axonale segmenten geïsoleerd door myeline of groeispurt, afgewisseld met de knopen van Ranvier, die overeenkomen met kleine unmyelinated domeinen verrijkt in spanning-gated natrium kanalen (nbv). De hoge concentratie en het snelle activering van nbv kanalen op de knooppunten van Ranvier toestaan de regeneratie van de actie potentieel, en samen met de isolerende eigenschappen van de myeline omhulsels, zorgen voor de geleiding van het efficiënte en snelle saltatory van de zenuw impuls langs de axon3.
Naast haar rol bij het versnellen van de snelheid van de geleiding van de zenuw impuls, ondersteunt myelinating glia metabole de axon, behoud van de lange termijn integriteit en deelnemen aan haar overleving4,5. Bovendien, het is duidelijk geworden in de afgelopen jaren dat die myeline is dynamisch gemoduleerd gedurende het hele leven, dus vermoedelijk deel te nemen aan de verordening en de plasticiteit van de verschillende functies van het zenuwstelsel. Aanpassingen van de distributie, aantal, lengte en dikte van myeline omhulsels langs axonen kunnen dus een nieuwe manier om te fijn afstemmen van verschillende netwerken6,-7,8vormen. Dus, de evolutionaire verwerving van myeline is een belangrijke proces voor sensorische, motorische en cognitieve functies en de verstoring van de interactie tussen axonen en glia is steeds meer beschouwd als een bijdrage tot de ontwikkeling of verworven neurologische ziekten9.
Myeline samenstelling heeft gekenmerkt, met de specifieke functie van een hoog percentage van lipiden (70%) in vergelijking met eiwitten (30%) in tegenstelling tot andere cellulaire membranen10. In tegenstelling tot de myeline lipiden zijn meeste van myeline eiwitten echter specifiek voor myeline, met inbegrip van myeline basic protein (MBP), proteolipid eiwit (PLP), 2', 3'-cyclische nucleotide 3'-fosfodiësterase (NPM), myeline-geassocieerde glycoproteïne (MAG), myeline-Oligodendrocyt glycoproteïne (MOG), PMP-22 en P010. Verschillende histologische methoden om vlek myeline bestaan op basis van de samenstelling van lipide, zoals snel blauwe Luxol11, Soedan zwart B12, Baker's zuur hematin methode13, evenals zilver14kleuring. Deze benaderingen doen echter niet altijd mogelijk voor een voldoende contrast en resolutie te visualiseren van individuele vezels. Een alternatieve benadering voor het detecteren van myeline is door middel van immunohistochemistry gericht tegen myeline eiwitten. Verschillende antilichamen richten van de myeline-specifieke antigenen met een hoge specificiteit en kunnen routinematig worden gebruikt voor het detecteren van myelinated structuren. De antilichaam-antigeen interactie kan verder worden onthuld met behulp van een secundair antilichaam gekoppeld aan een fluorophore gericht tegen het primaire antilichaam en gevisualiseerd met voldoende fluorescentie microscopie. Hier beschrijven we een immunochemical protocol om vlekken van myeline op ex vivo cerebellaire segmenten, een model dat voor een goede bewaring van de architectuur van zenuwweefsel zorgt. Bovendien, de organisatie en de grootte van het Purkinje-cellen (de enige myelinated neuron van het cerebellum) laten een klassiek model voor elektrofysiologische studies en ze zijn ook ideaal vast of live-imaging studies te verrichten.
De cerebellaire segmenten worden gegenereerd uit P9-P10 muizen, een tijd die overeenkomt met de vroege begin van Purkinje cel myelinisering, een proces dat meestal door één week ex vivo (6-7 dagen in vitro DIV)15 bereikt wordt. Bovendien, dit model is aangepast aan het onderzoeken van demyeliniserende aandoeningen zoals multiple sclerose (MS), zoals een uitgebreide demyelinisatie kan worden opgewekt in cerebellaire plakjes met behulp van de myelinotoxic-samengestelde lysophosphatidylcholine (of lysolecithin, LPC), die wordt gevolgd door een spontane remyelination16,17. Endogene remyelination plaatsvindt van twee dagen na de LPC verwijdering uit het kweekmedium en is bijna een week na de behandeling te voltooien.
De voltooiing van dit protocol duurt ongeveer 3 weken, met inbegrip van een halve dag voor cerebellaire segment culturen voorbereiding, een week voor volledig myelinated segmenten, gevolgd door 2 dagen te bereiken van het hoogtepunt van demyelinisatie en nog een week voor hun volledige remyelination. Immunohistochemistry kan bovendien worden uitgevoerd in 2 dagen. Het protocol hier beschreven is aangepast aan een standaard nest van 6 muizen pups en moet worden aangepast met betrekking tot het aantal dieren die worden gebruikt voor de geplande experiment.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BME medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>41010026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (10X HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14180046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Horse Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;Streptomycin (10.000 IU/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gey&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9779-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose Solution (45%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8769-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysophosphatidylcholine (LPC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L4129-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol (100% ethanol)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>20821.330</td>
			<td>Cooled at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#174; X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>500622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>EuroMEDEX</td>
			<td>ET330-A</td>
			<td>pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>06-896</td>
			<td>Dilution 1/300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AB9348</td>
			<td>Dilution 1/150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>NE1019</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma)</td>
			<td>Gift from Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Dilution 1/5 to 1/10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8809</td>
			<td>Dilution 1/150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34151</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Secondary Antibodies conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue chopper</td>
			<td>McIlwain</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14101-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-straight forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved-fine forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11297-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes (60-mm and 100-mm)</td>
			<td>TPP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-, 6-well culture plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell culture inserts (0,4 &#181;m, 30-mm diameter)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>37&#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-end pipette tips</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>134000CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-bore pipette tips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>2079G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td></td>
			<td>20 or 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filters</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td></td>
			<td>0.22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>RS France</td>
			<td></td>
			<td>76 x 26 x 1.1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>RS France</td>
			<td></td>
			<td>22 x 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Sciences Tissue Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>5511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and immunostaining of myelinating organotypic cerebellar slice cultures

In het zenuwstelsel, de myeline is een complexe membraan structuur gegenereerd door myelinating gliale cellen, welke ensheathes axonen en vergemakkelijkt de snelle elektrische geleiding. Myeline wijziging heeft aangetoond dat het optreden in diverse neurologische aandoeningen, waar het wordt geassocieerd met functionele tekorten. Hier, wij bieden een gedetailleerde beschrijving van een ex vivo model bestaande uit muis organotypic cerebellaire segmenten, die kunnen worden gehandhaafd in cultuur voor verscheidene weken en verder worden aangeduid om te visualiseren van myeline.

Voorbeelden van representatieve myeline immunostainings in organotypic cerebellaire plakjes verkregen P9-P10 C57black6 wild-type (WT) (figuur 2A), evenals PLP-GFP transgene muizen (figuur 2B), samen met Purkinje cellen kleuring. Cerebellaire segmenten myelinate van de witte stof tracks regio van de segmenten naar de periferie van de folia en myelinisering van de cellen Purkinje gebeurt meestal na 6 tot en met 7 DIV. Bij 7 DIV is ...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures at JoVE.com

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Voorbereiding en immunokleuring van Myelinating Organotypic cerebellaire segment culturen

Hier presenteren we een methode ter voorbereiding organotypic segment culturen van muis cerebellum en myelineschede kleuring door immunohistochemistry geschikt voor onderzoek naar mechanismen van myelinisering en remyelination in het centrale zenuwstelsel.

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Deze methode maakt het mogelijk om het basismechanisme van myelinatie en remyelinatie op cellulair en tissulair niveau te bestuderen. Deze techniek bevindt zich op het kruispunt tussen primaire culturen en in vivo benaderingen. Het is een snel en toegankelijk model met als belangrijkste voordeel van het behoud van de weefselarchitectuur.Het aantonen van de procedure zal Worden Melina Thetiot, een postdoctoraal onderzoeker en Remi Ronzano, een promovendus uit mijn laboratorium. Om te beginnen, steek een kleine schaar zachtjes in de foramen magnum en snijd de schedel door het maken van een laterale incisie naar de zijkant, en snijd dan rondom het hoofd schedel. Om het dorsale deel van de schedel op te halen, gebruik een fijne, rechte tang om het dorsale deel van de schedel zorgvuldig op te tillen.Introduceer vervolgens voorzichtig de tangen tussen de ventrale schedel en de hersenen. Draai voorzichtig de hersenen uit en snijd de optische en trigeminuszenuwen met een kleine schaar. Draai vervolgens het hoofd of het dorsale deel van de schedel ondersteboven net boven een 60 millimeter celcultuurschotel met ijskoud dissectiemedium om de hersenen te helpen dalen door de zwaartekracht.Met behulp van fijne tangen, oriënteren van de hersenen met de rug kant naar boven en de ventrale kant liggen. Onder de verrekijker microscoop, gebruik maken van de fijne, rechte tangen om de hersenen immobiliseren aan de voorhersenen kant. Scheid vervolgens de achterhersenen van de rest van de hersenen.Snijd de cerebellar peduncles onder het cerebellum om het cerebellum te scheiden van de rest van de achterhersenen. Zodra het cerebellum is geïsoleerd, gebruik dan fijne, rechte tangen om de hersenvliezen voorzichtig weg te scheuren. Houd het cerebellum voorzichtig vast met de fijne, gebogen tangen en plaats het met de rugzijde op het plastic platform, loodrecht op het scheermesje van de haker.Vervolgens, met een steriele, dunne eind pipet tip bevestigd aan een een milliliter pipet, aspirate elke toegang van dissectie medium rond het cerebellum. Dan, met een weefsel chopper, slice 300 micrometer dikke saggital secties van het cerebellum. Voeg vervolgens voorzichtig een druppel dissectiemedium toe aan het gesneden cerebellum.Dan, met een breed zwijn pipet tip bevestigd aan de een milliliter pipet, langzaam aanzuigen van de gesneden cerebellum en breng het terug in de 60 millimeter cel cultuur schotel met ijskoud dissectie medium. Gebruik vervolgens twee fijne, rechte tangen om afzonderlijke segmenten te scheiden. Dan, met een breed zwijn pipet tip bevestigd aan de een milliliter pipet, overdracht tot vier geselecteerde plakjes van de vermis, samen met een aantal dissectie medium op een cultuur insert van een zes put plaat.Verwijder elke toegang van dissectie medium rond de plakjes met behulp van een dunne einde pipet tip. Voor demyelinatie, verwijder alle cultuur medium onder de cultuur inserts na zes dagen in vitro, en vervang het met een milliliter per put van de voorverwarmde, verse cultuur medium met 0,5 milligram per milliliter LPC. Incubeer gedurende 15 tot 17 uur bij 37 graden Celsius in 5% koolstofdioxide milieu.Na incubatie, was de inzetstukken door ze te plaatsen in een 25 milliliter petrischaal met een milliliter van voorverwarmd kweekmedium. Breng vervolgens onmiddellijk de cultuurmesels over in een nieuwe, zes putplaat, met vers, voorverwarmd cultuurmedium. Om te beginnen met immunohistochemie, gebruik eerst tangen om cultuur inserts lift en verwijder de cultuur medium eronder.Voeg vervolgens twee milliliter van 4%PFA in 1x PBS, ph 7.4, toe aan de membraanwisselplaten om de cerebellar-plakjes te bevestigen. Na 30 minuten, was de plakjes drie keer met twee milliliter van 1x PBS gedurende 10 minuten per wasbeurt. Vervolgens, onder de verrekijker microscoop, met behulp van een 25x tot 30x vergroting, gebruik maken van een scalpel of een borstel om voorzichtig los te maken van de plakjes van het membraan inserts.Gebruik vervolgens een borstel om de drijvende plakjes over te brengen in de putten van een vier putplaat, met 1x PBS om het antilichaamverbruik te beperken. Vervolgens, aspirate de PBS van elke put en de plakjes in voorgekoelde 100% ethanol bij min 20 graden Celsius gedurende 15 tot 20 minuten uitbroeden. Na incubatie, aspirate de 100%ethanol en was de plakjes kort met 1x PBS.Was ze vervolgens twee keer op kamertemperatuur met 1x PBS gedurende 10 minuten per wasbeurt. Om niet-specifieke antilichaamfixatieplaatsen te blokkeren, de PBS aan te trekken en de plakjes uit te broeden in een oplossing die 1x PBS, 5%NGS en 0,3% niet-ionisch wasmiddel gedurende 30 tot 45 minuten bij kamertemperatuur bevat. Voeg vervolgens primaire antilichamen verdund in de blokkerende oplossing en inculbaat van de plakjes op vier graden Celsius 's nachts.Na nachtelijke incubatie, was de plakjes drie keer met 1x PBS gedurende 10 minuten per wasbeurt. Voeg vervolgens de secundaire antilichamen, verdund in de blokkeringsoplossing, bij één tot 500 verdunningsverhouding toe en broed de plakjes bij kamertemperatuur in het donker gedurende drie uur uit. Na incubatie met het secundaire antilichaam, was de plakjes drie keer in 1x PBS in het donker gedurende 10 minuten elke wasbeurt.Plaats vervolgens onder een verrekijkermicroscoop 100 microleters van 1x PBS op de glijbaan en breng met een borstel de plakjes over in de PBS en vlak ze af op de glijbaan. Verwijder elke toegang tot PBS. Tot slot, plaats een druppel montagemedium direct op de glazen deksel slip en voorzichtig de plakjes te bedekken.Myeline immunostainings in organotypic cerebellar plakjes, verkregen uit postnatale dagen 9 tot 10 C57 zwarte zes wilde type muizen werden waargenomen op 11 dagen in vitro met knooppunten van ronviae verrijkt in spanning gated natrium kanalen, geflankeerd door het paranodal axoglial knooppunt domein. Dezelfde resultaten werden waargenomen voor PLP-GFP transgene muizen. Myelinatie van de parkengy cellen wordt meestal bereikt na een week in de cultuur.LPC-behandeling demyelineert de plakjes volledig, die spontaan remyelineren en zes dagen na demyelinatie volledig zijn gemyelineerd. Deze procedure moet maximaal 25 minuten duren. Het is echt het meest kritieke punt.Organotypic slice cultuur zijn geschikt voor live imaging studie van myeminatie dynamiek. Het kan ook worden gebruikt voor het richten van drugs screening experimenten. Deze techniek maakt een eenvoudige, kwantitatieve benadering mogelijk om myelinatie- en remyelinatieprocessen te bestuderen.De onderzoekers moeten de basisveiligheidsprocedures volgen die op dierenwelzijn, bovenmatig en scherp myelinatie van toepassing zijn.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

De organotypische hippocampus Slice Cultuur Model is voor de behandeling Neuronale Letsel

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

Slice Voorbereiding, organotypische Tissue kweken en Luciferase Opname van Klok gen-activiteit in de suprachiasmatische kern

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Organotypische hippocampus Slice culturen

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypische Cerebellaire culturen: apoptotische uitdagingen en Detectie

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

Hele Cell Opnemen van een organotypische Slice Voorbereiding van de neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Afleiding van Verrijkt oligodendrocyt Culturen en oligodendrocyt / Neuron Myelinating co-culturen van Post-natale Murine Tissues

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypische Slice culturen van embryonale ventrale middenhersenen: Een systeem om Dopaminerge Neuronale Development Study In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

De Analyse van de Purkinje cel dendritische morfologie in organotypische slice culturen

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Organotypische Slice culturen om te studeren Oligodendrocyte Dynamics en Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

De Analyse van Neurovascular Verbouwing in Entorhino-hippocampus Organotypische Slice Culturen

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...