Name: preparation and immunostaining of myelinating organotypic cerebellar slice cultures
Uploaded: 2019-03-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures at JoVE.com

Nous remercions le Dr Sean Freeman, Dr Nathalie Sol-Foulon et Dr Thomas Roux de précieux commentaires sur le manuscrit. Ce travail a été financé par l’INSERM, ICM, ARSEP subventions R13123DD, ANR R17127DD (d’après JC) et bourses de recherche FRM, SPF20110421435 (d’après JC), FDT20170437332 (à M.T.). Nous remercions les installations de culture de cellule CELIS et l’icm. Plate-forme d’imagerie quant.

Tous les travaux impliquant des animaux respecté les politiques institutionnelles et aux lignes directrices établies par l’UPMC, INSERM et Français et communautaire européen, la Directive 86/609/CEE.
1. préparation du milieu de Culture et de la Culture insère (Hands-on temps ≈ 10 à 15 min)
Remarque : Effectuez cette étape dans une hotte à flux culture en conditions stériles
<ol><li>Préparation de 40 mL de milieu de culture, qui se ...

<ol>
	<li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+Plasticity+and+Nervous+System+Function.">Myelin Plasticity and Nervous System Function.</a> Annual Review Neuroscience. 41, 61-76 (2018).</li><li>Desmazi&#232;res, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+at+the+nodal+and+perinodal+axonal+domains:+a+basis+for+multiple+sclerosis+pathology.">Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple sclerosis pathology.</a> Multiple Sclerosis Houndmills Basingstoke England. 18, 133-137 (2012).</li><li>Waxman, S. G., Ritchie, J. 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M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+promotes+oligodendrogenesis+and+adaptive+myelination+in+the+mammalian+brain.">Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain.</a> Science. 344, 1252304 (2014).</li><li>Tomassy, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+profiles+of+myelin+distribution+along+single+axons+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex.">Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Science. 344, 319-324 (2014).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+sensitive+optical+coherence+microscopy+for+brain+imaging.">Polarization sensitive optical coherence microscopy for brain imaging.</a> Optics Letters. 41, 2213-2216 (2016).</li><li>Freudiger, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biomedical+imaging+with+high+sensitivity+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science. 322, 1857-1861 (2008).</li><li>Lim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+Schwann+cell+myelination+by+third+harmonic+generation+microscopy.">Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).</li><li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy.">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).</li><li>Arancibia-Carcamo, I. L., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+node+of+Ranvier+in+CNS+pathology.">The node of Ranvier in CNS pathology.</a> Acta Neuropathologia. (Berlin). 128, 161-175 (2014).</li></ol>

Ici, nous détaillons un protocole pour générer un ex vivo modèle correspondant aux souris cérébelleux organotypiques, adapté de précédemment méthodes publiées15,16,19 et la myéline ultérieure immunomarquage de ces préparations. Cette stratégie offre la possibilité de visualiser les composants de la myéline avec une haute résolution dans les États sains et pathologiques.
Organotypiqu...

Les neurones sont des cellules hautement polarisées, qui forment un compartiment somato-dendritique qui reçoit les entrées de son environnement et un axone qui assure la génération et la propagation des impulsions électriques à d’autres cellules. Propagation rapide et en temps opportun de l’information est essentielle au bon fonctionnement du système nerveux. Chez les vertébrés, elle est facilitée par la myélinisation, qui permet d’augmenter la vitesse de conduction axonale1. La myéline est une structure spécialisée, formée par des couches compactées de membrane de plasma généré par les cellules gliales myélinisantes, à savoir les oligodendrocytes dans le système nerveux central (CNS) et les cellules de Schwann dans le système nerveux périphérique (PNS). Aussi bien dans le SNC et des billets à ordre, des interactions axoglial conduire la formation de domaines axonales spécialisés : les nœuds de Ranvier et leurs domaines, paranodes et juxtaparanodes environs2. Les segments axones isolés par la myéline ou entrenoeuds, alternent avec les nœuds de Ranvier, qui correspondent aux petits domaines amyélinisés enrichis dans les canaux sodiques voltage-dépendants (Nav). La forte concentration et l’activation rapide des canauxv Na aux nœuds de Ranvier permettent la régénération des potentiels d’action et ainsi que les propriétés isolantes de la gaine de myéline, assurer la conduction saltatoire rapide et efficace de la influx nerveux le long de l' axone3.
Outre son rôle dans l’accélération de la vitesse de conduction de l’influx nerveux, cellules gliales myélinisantes fournit soutien métabolique à l’axone, la préservation de son intégrité à long terme et de participer à sa survie,4,à5. En outre, il est devenu évident dans ces dernières années que la myéline est modulée dynamiquement tout au long de la vie, sans doute participant ainsi à la régulation et la plasticité des diverses fonctions du système nerveux. Réglages de la distribution, nombre, longueur et épaisseur des gaines de myéline le long des axones peuvent ainsi représenter une nouvelle manière de régler finement les différents réseaux6,7,8. Par conséquent, l’acquisition évolutive de la myéline est un processus essentiel pour les fonctions sensorielles, motrices et cognitives et la perturbation de l’interaction entre les axones et cellules gliales est plus en plus considérée comme faisant partie de développement ou acquises neurologique les maladies9.
Composition de la myéline a été caractérisée, avec la particularité d’une grande proportion de lipides (70 %) par rapport aux protéines (30 %) Contrairement à d’autres membranes cellulaires10. Cependant, contrairement aux lipides de la myéline, la plupart des protéines de la myéline sont spécifique à la myéline, dont la protéine basique de la myéline (MBP), protéine protéolipidique (PLP), 2', glycoprotéine de 3'-nucléotide cyclique 3'-phosphodiestérase (CNP), associée à la myéline (MAG), glycoprotéine myéline oligodendrocyte (MOG), PMP-22 et P010. Diverses méthodes histologiques sur la tache de la myéline existent selon sa composition lipidique, tel que Luxol rapide bleu11, Soudan noir B12, Baker hématine acide méthode13, ainsi que14de coloration à l’argent. Néanmoins, ces approches ne permettent pas toujours un contraste adéquat et la résolution pour visualiser des fibres individuelles. Une autre approche pour détecter la myéline est par immunohistochimie dirigé contre les protéines de la myéline. Différents anticorps ciblent les antigènes spécifiques de la myéline avec une grande spécificité et peuvent être utilisés régulièrement pour détecter les structures myélinisées. L’interaction d’anticorps-antigène peut être révélée davantage à l’aide d’un anticorps secondaire couplé à un fluorophore dirigées contre l’anticorps primaire et visualisé à l’aide de la microscopie en fluorescence adéquate. Nous décrivons ici un protocole immunochimique pour souiller la myéline sur ex vivo tranches de cervelet, un modèle qui permet une bonne conservation de l’architecture du tissu nerveux. En outre, l’organisation et la taille des cellules de Purkinje (le seul neurone myélinisée du cervelet) rendent un modèle classique pour des études électrophysiologiques et ils sont de même idéales pour réaliser des études fixes ou d’images en direct.
Les tranches de cervelet sont générés à partir de souris P9-P10, un temps correspondant à l’apparition précoce de cellules de Purkinje myélinisation, un processus qui est principalement réalisé en une semaine ex vivo (6-7 jours in vitro, DIV)15. En outre, ce modèle est adapté pour enquêter sur les troubles démyélinisantes chronique comme la sclérose en plaques (MS), car une démyélinisation étendue peut être induite en tranches de cervelet à l’aide de la lysophosphatidylcholine composée de myelinotoxic (ou lysolécithine, LPC), qui est suivie par une remyélinisation spontanée16,17. Remyélinisation endogène a lieu deux jours après l’enlèvement de la LPC milieu de culture et est presque complète un traitement de post de la semaine.
L’achèvement du présent protocole prend environ 3 semaines, dont une demi-journée pour la préparation de cultures de tranches cérébelleux, une semaine pour obtenir des tranches entièrement myélinisées, suivis de 2 jours pour atteindre le sommet de démyélinisation et une autre semaine pour leur plein remyélinisation. En outre, l’immunohistochimie peut être complété en 2 jours. Le protocole décrit ici est adapté à une portée standard de 6 chiots de souris et doit être adaptée au sujet du nombre d’animaux utilisés pour l’expérience prévue.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BME medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>41010026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (10X HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14180046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Horse Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;Streptomycin (10.000 IU/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gey&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9779-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose Solution (45%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8769-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysophosphatidylcholine (LPC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L4129-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol (100% ethanol)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>20821.330</td>
			<td>Cooled at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#174; X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>500622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>EuroMEDEX</td>
			<td>ET330-A</td>
			<td>pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>06-896</td>
			<td>Dilution 1/300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AB9348</td>
			<td>Dilution 1/150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>NE1019</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma)</td>
			<td>Gift from Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Dilution 1/5 to 1/10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8809</td>
			<td>Dilution 1/150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34151</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Secondary Antibodies conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue chopper</td>
			<td>McIlwain</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14101-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-straight forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved-fine forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11297-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes (60-mm and 100-mm)</td>
			<td>TPP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-, 6-well culture plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell culture inserts (0,4 &#181;m, 30-mm diameter)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>37&#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-end pipette tips</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>134000CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-bore pipette tips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>2079G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td></td>
			<td>20 or 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filters</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td></td>
			<td>0.22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>RS France</td>
			<td></td>
			<td>76 x 26 x 1.1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>RS France</td>
			<td></td>
			<td>22 x 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Sciences Tissue Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>5511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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preparation and immunostaining of myelinating organotypic cerebellar slice cultures

Dans le système nerveux, la myéline est une structure complexe membranaire générée par myélinisantes glial cells, les axones des cellules et facilite la conduction électrique rapide. Altération de la myéline s’est avérée de se produire dans diverses maladies neurologiques, où elle est associée à des déficits fonctionnels. Ici, nous fournir une description détaillée d’un ex vivo modèle composé de tranches de cervelet organotypique souris, qui peuvent être maintenues en culture pour plusieurs semaines et encore être étiquetés de manière à visualiser la myéline.

Exemples de myéline représentant immunostainings en tranches de cervelet organotypique provenant de P9-P10 C57black6 sauvage (WT) (Figure 2 a), ainsi que les souris transgéniques PLP-GFP (Figure 2 b), ainsi que la coloration des cellules de Purkinje. Myéliniser de la substance blanche cérébelleuses tranches pistes région des tranches vers la périphérie de la folia et myélinisation des cellules de Purkinje est principale...

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Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Préparation et Immunostaining des cérébelleux Myélinisantes Organotypiques

Nous présentons ici une méthode pour préparer organotypique cultures tranche de cervelet de souris et de la gaine de myéline, la coloration par immunohistochimie approprié pour enquêter sur les mécanismes de la myélinisation et remyélinisation du système nerveux central.

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Cette méthode permet d’étudier le mécanisme de base de la myélinisation et de la remyélination au niveau cellulaire et tissulaire. Cette technique est à la croisée des chemins entre les cultures primaires et les approches in vivo. Il s’agit d’un modèle rapide et accessible avec le principal avantage de préserver l’architecture tissulaire.Melina Thetiot, chercheuse postdoctorale et Rémi Ronzano, doctorant de mon laboratoire, démontreront la procédure. Pour commencer, insérez doucement un petit ciseaux dans le magnum foramen et coupez le crâne en faisant une incision latérale vers le côté, puis coupez tout autour du crâne de la tête. Pour récupérer la partie dorsale du crâne, utilisez une fine force droite pour soulever soigneusement la partie dorsale du crâne.Introduisez ensuite soigneusement les forceps entre le crâne ventral et le cerveau. Retournez doucement le cerveau et coupez les nerfs optiques et trigeminaux avec de petits ciseaux. Ensuite, tournez la tête ou la partie dorsale du crâne à l’envers juste au-dessus d’un plat de culture cellulaire de 60 millimètres contenant un milieu de dissection glacée pour aider le cerveau à tomber par gravité.À l’aide de forceps fins, orienter le cerveau avec le côté dorsal orienté vers le haut et le côté ventral couché. Sous le microscope binoculaire, utilisez les forceps fins et droits pour immobiliser le cerveau du côté du cerveau antérieur. Ensuite, séparez le cerveau postérieur du reste du cerveau.Couper les péduncles cerebellar sous le cervelet pour séparer le cervelet du reste du cerveau postérieur. Une fois que le cervelet est isolé, utilisez des forceps fins et droits pour arracher soigneusement les méninges. Tenez doucement le cervelet avec les forceps fins et incurvés et placez-le avec le côté dorsal vers le haut sur la plate-forme en plastique, perpendiculairement à la lame de rasoir d’hélicoptère.Ensuite, avec une pointe stérile et mince de pipette d’extrémité attachée à une pipette d’un millilitre, aspirez n’importe quel accès du milieu de dissection autour du cervelet. Puis, à l’aide d’un hachoir à tissus, trancher 300 sections saggitales épaisses de micromètre du cervelet. Ensuite, ajouter délicatement une goutte de milieu de dissection sur le cervelet tranché.Puis, avec une large pointe de pipette de sanglier fixée à la pipette d’un millilitre, aspirez lentement le cervelet tranché et transférez-le de nouveau dans le plat de culture cellulaire de 60 millimètres contenant le milieu de dissection froide de glace. Ensuite, utilisez deux forceps fins et droits pour séparer les tranches individuelles. Ensuite, avec une large pointe de pipette de sanglier fixée à la pipette d’un millilitre, transférer jusqu’à quatre tranches sélectionnées du vermis, ainsi qu’un milieu de dissection sur un insert de culture d’une plaque de six puits.Retirez tout accès de milieu de dissection autour des tranches à l’aide d’une pointe de pipette à extrémité mince. Pour la démyélinisation, retirez tout milieu de culture sous les inserts de culture après six jours in vitro, et remplacez-le par un millilitre par puits du milieu de culture frais préchauffé contenant 0,5 milligramme par millilitre de LPC. Incuber pendant 15 à 17 heures à 37 degrés Celsius dans un environnement de dioxyde de carbone de 5 %.Après l’incubation, laver les inserts en les plaçant dans une boîte petri de 25 millilitres contenant un millilitre de milieu de culture préchauffé. Ensuite, transférez immédiatement les inserts de culture dans une nouvelle assiette de six puits, contenant un milieu de culture frais et préchauffé. Pour commencer l’immunohistochimie, utilisez d’abord des forceps pour soulever des inserts de culture et enlever le milieu de culture sous eux.Ensuite, ajouter deux millilitres de 4%PFA en 1x PBS, ph 7.4, sur les inserts membranaires pour fixer les tranches cerebellar. Après 30 minutes, laver les tranches trois fois avec deux millilitres de 1x PBS pendant 10 minutes chaque lavage. Ensuite, sous le microscope binoculaire, à l’aide d’un grossissement de 25 x 30 x, utilisez un scalpel ou une brosse pour détacher doucement les tranches des inserts membranaires.Ensuite, utilisez une brosse pour transférer les tranches flottantes dans les puits d’une plaque de quatre puits, contenant 1x PBS pour limiter la consommation d’anticorps. Ensuite, aspirez le PBS de chaque puits et incubez les tranches dans de l’éthanol pré-refroidi à 100 % à moins 20 degrés Celsius pendant 15 à 20 minutes. Après l’incubation, aspirer l’éthanol à 100% et laver brièvement les tranches avec 1x PBS.Ensuite, lavez-les deux fois à température ambiante avec 1x PBS pendant 10 minutes chaque lavage. Pour bloquer les sites de fixation d’anticorps non spécifiques, aspirez le PBS et incubez les tranches dans une solution contenant 1x PBS, 5%NGS et 0,3% détergent non ionique à température ambiante pendant 30 à 45 minutes. Ensuite, ajoutez des anticorps primaires dilués dans la solution de blocage et incubez les tranches à quatre degrés Celsius pendant la nuit.Après l’incubation pendant la nuit, laver les tranches trois fois avec 1x PBS pendant 10 minutes chaque lavage. Ajouter ensuite les anticorps secondaires, dilués dans la solution de blocage, à un rapport de dilution de 1 à 500 et incuber les tranches à température ambiante dans l’obscurité pendant trois heures. Après incubation avec l’anticorps secondaire, laver les tranches trois fois en 1x PBS dans l’obscurité pendant 10 minutes chaque lavage.Ensuite, sous un microscope binoculaire, placez 100 microlètes de 1x PBS sur la lame et à l’aide d’une brosse, transférez les tranches dans le PBS et aplatissez-les sur la lame. Supprimez tout accès à PBS. Enfin, placez une goutte de milieu de montage directement sur le bordereau de couverture en verre et couvrez doucement les tranches.Des immunostainings de myéline dans les tranches organotypiques de cerebellar, obtenus des jours postnatals 9 à 10 C57 noir six souris sauvages de type ont été observés à 11 jours in vitro avec des nœuds de ronviae enrichis en canaux de sodium fermés de tension, flanqués par le domaine axoglial paranodal de jonction. Les mêmes résultats ont été observés pour les souris transgéniques PLP-GFP. La myélinisation des cellules de parkengy est principalement réalisée après une semaine dans la culture.Le traitement de LPC démyélise complètement les tranches, qui remyelinate spontanément et sont entièrement myélinated six jours après démyélinisation. Cette procédure devrait prendre 25 minutes maximum. C’est vraiment le point le plus critique.La culture organotypique des tranches convient à l’étude en direct de la dynamique de myélinisation. Il peut également être utilisé pour cibler des expériences de dépistage de drogues. Cette technique permet une approche facile et quantitative pour étudier les processus de myélinisation et de remylination.Les expérimentateurs doivent suivre les procédures de sécurité de base qui s’appliquent au bien-être des animaux, à la myélinisation excessive et pointue.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Le modèle organotypiques d&#39;hippocampe Culture Slice d&#39;examen des lésions neuronales

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Recherche

Neurosciences

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

Préparation Trancher, culture de tissus organotypiques et enregistrement de la luciférase de l&#39;activité des gènes d&#39;horloge dans le noyau suprachiasmatique

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Cultures organotypiques d&#39;hippocampe Slice

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Cultures organotypiques cérébelleuse: Défis apoptotiques et détection

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Dérivation des cultures enrichies en oligodendrocytes et Oligodendrocyte / Neuron myélinisantes co-cultures de post-natal tissus murins

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

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Cultures organotypique de mésencéphale ventral embryonnaire: Un système pour étudier le développement neuronal dopaminergique In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

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L&#39;analyse de la morphologie de Purkinje cellules dendritiques dans les cultures organotypique

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Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Cultures organotypique de tranche d&#39;étudier Oligodendrocyte Dynamics et myélinisation

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L&#39;analyse de neurovasculaire Rénovation dans Entorhino-hippocampe cultures organotypique de tranche

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