Name: preparation and immunostaining of myelinating organotypic cerebellar slice cultures
Uploaded: 2019-03-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures at JoVE.com

אנו מודים ד ר שון פרימן, ד ר נטלי סול-Foulon, ד ר תומס רו להערות יקר על כתב היד. עבודה זו מומן על ידי INSERM, ICM, מענקים ARSEP R13123DD, R17127DD ANR (כדי לספירה) ואחווה עקרות, SPF20110421435 (כדי לספירה) FDT20170437332 (ל. מ. ת). אנו מודים המתקן תרבות תא CELIS, את icm. פלטפורמת הדמיה חשבים.

כל העבודה המערבות בעלי חיים תאמו מדיניות מוסדית המנחים שקבע את UPMC, INSERM ואת צרפתית הקהילה האירופית םיאנתל 86/609/EEC.
1. הכנת בינוני תרבות ותרבות מוסיף (תרגולים זמן ≈ 10-15 דקות)
הערה: לבצע שלב זה בשכונה תרבות זרימה בתנאים סטריליים
<ol><li>להכין 40 מ של תרבות בינו...

<ol>
	<li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+Plasticity+and+Nervous+System+Function.">Myelin Plasticity and Nervous System Function.</a> Annual Review Neuroscience. 41, 61-76 (2018).</li><li>Desmazi&#232;res, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+at+the+nodal+and+perinodal+axonal+domains:+a+basis+for+multiple+sclerosis+pathology.">Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple sclerosis pathology.</a> Multiple Sclerosis Houndmills Basingstoke England. 18, 133-137 (2012).</li><li>Waxman, S. G., Ritchie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+the+myelinated+axon.">Molecular dissection of the myelinated axon.</a> Annals of Neurology. 33, 121-136 (1993).</li><li>F&#252;nfschilling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolytic+oligodendrocytes+maintain+myelin+and+long-term+axonal+integrity.">Glycolytic oligodendrocytes maintain myelin and long-term axonal integrity.</a> Nature. 485, 517-521 (2012).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroglia+metabolically+support+axons+and+contribute+to+neurodegeneration.">Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration.</a> Nature. 487, 443-448 (2012).</li><li>Chang, K. -. J., Redmond, S. A., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+myelination:+implications+for+mechanisms+of+neural+plasticity.">Remodeling myelination: implications for mechanisms of neural plasticity.</a> Nature Neurosciences. 19, 190-197 (2016).</li><li>Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mechanism+of+nervous+system+plasticity:+activity-dependent+myelination.">A new mechanism of nervous system plasticity: activity-dependent myelination.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16, 756-767 (2015).</li><li>Nave, K. -. A., Werner, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+of+the+nervous+system:+mechanisms+and+functions.">Myelination of the nervous system: mechanisms and functions.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 503-533 (2014).</li><li>Nave, K. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+and+support+of+axonal+integrity+by+glia.">Myelination and support of axonal integrity by glia.</a> Nature. 468, 244-252 (2010).</li><li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiological Reviews. 81, 871-927 (2001).</li><li>Kluver, H., Barrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+combined+staining+of+cells+and+fibers+in+the+nervous+system.">A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 12, 400-403 (1953).</li><li>Meier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+observations+on+early+myelination+in+the+human+spinal+cord.+Light+and+electron+microscope+study.">Some observations on early myelination in the human spinal cord. Light and electron microscope study.</a> Brain Research. 104, 21-32 (1976).</li><li>Hori, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SIMPLIFIED+ACID+HEMATEIN+TEST+FOR+PHOSPHOLIPIDS.">A SIMPLIFIED ACID HEMATEIN TEST FOR PHOSPHOLIPIDS.</a> Stain Technology. 38, 221-225 (1963).</li><li>Gallyas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+myelin+by+means+of+physical+development.">Silver staining of myelin by means of physical development.</a> Neurological Research. 1, 203-209 (1979).</li><li>Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje+cell+survival+and+axonal+regeneration+are+age+dependent:+an+in+vitro+study.">Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study.</a> Journal of Neuroscience An Official Journal of the Society of Neuroscience. 17, 3710-3726 (1997).</li><li>Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysolecithin+induces+demyelination+in+vitro+in+a+cerebellar+slice+culture+system.">Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system.</a> Journal of Neuroscience Research. 78, 157-166 (2004).</li><li>Zhang, H., Jarjour, A. A., Boyd, A., Williams, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+nervous+system+remyelination+in+culture--a+tool+for+multiple+sclerosis+research.">Central nervous system remyelination in culture--a tool for multiple sclerosis research.</a> Experimental Neurology. 230, 138-148 (2011).</li><li>Rasband, M. N., Peles, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nodes+of+Ranvier:+Molecular+Assembly+and+Maintenance.">The Nodes of Ranvier: Molecular Assembly and Maintenance.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8, a020495 (2015).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neurosciences Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Hussain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+and+Nestorone+facilitate+axon+remyelination:+a+role+for+progesterone+receptors.">Progesterone and Nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors.</a> Endocrinology. , 3820-3831 (2011).</li><li>Wioland, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epsilon+toxin+from+Clostridium+perfringens+acts+on+oligodendrocytes+without+forming+pores,+and+causes+demyelination.">Epsilon toxin from Clostridium perfringens acts on oligodendrocytes without forming pores, and causes demyelination.</a> Cellular Microbiology. 17, 369-388 (2015).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).</li><li>Medina-Rodr&#237;guez, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+in+vivo+remyelination+with+small+molecules:+a+neuroreparative+pharmacological+treatment+for+Multiple+Sclerosis.">Promoting in vivo remyelination with small molecules: a neuroreparative pharmacological treatment for Multiple Sclerosis.</a> Science Reports. 7, (2017).</li><li>Spassky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+steps+of+oligodendrogenesis:+insights+from+the+study+of+the+plp+lineage+in+the+brain+of+chicks+and+rodents.">The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents.</a> Developmental Neurosciences. 23, 318-326 (2001).</li><li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+green+fluorescent+protein+in+the+oligodendrocyte+lineage:+a+transgenic+mouse+for+developmental+and+physiological+studies.">Expression of the green fluorescent protein in the oligodendrocyte lineage: a transgenic mouse for developmental and physiological studies.</a> Journal of Neuroscience Research. 70, 529-545 (2002).</li><li>Gibson, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+promotes+oligodendrogenesis+and+adaptive+myelination+in+the+mammalian+brain.">Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain.</a> Science. 344, 1252304 (2014).</li><li>Tomassy, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+profiles+of+myelin+distribution+along+single+axons+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex.">Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Science. 344, 319-324 (2014).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+sensitive+optical+coherence+microscopy+for+brain+imaging.">Polarization sensitive optical coherence microscopy for brain imaging.</a> Optics Letters. 41, 2213-2216 (2016).</li><li>Freudiger, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biomedical+imaging+with+high+sensitivity+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science. 322, 1857-1861 (2008).</li><li>Lim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+Schwann+cell+myelination+by+third+harmonic+generation+microscopy.">Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).</li><li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy.">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).</li><li>Arancibia-Carcamo, I. L., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+node+of+Ranvier+in+CNS+pathology.">The node of Ranvier in CNS pathology.</a> Acta Neuropathologia. (Berlin). 128, 161-175 (2014).</li></ol>

כאן, אנחנו פירוט פרוטוקול ליצירת אקסית vivo מודל המתאים התרבויות פרוסה organotypic אסטרוציטומה העכבר, המותאם ממשחק בעבר שיטות שפורסמו15,16,19 ו את המיאלין עוקבות immunostaining של ההכנות הללו. אסטרטגיה זו מציעה את האפשרות לדמיין המיאלין רכיבים עם ברזולוצ...

הנוירונים הם תאים מאוד מקוטב, המהווים תא somato-דנדריטים שמקבל קלט מן הסביבה של האקסון המבטיחה את יצירתם והובלתם של דחפים חשמליים לתאים אחרים. התפשטות מהירה ומדויקת של מידע חיוני לתפקוד תקין של מערכת העצבים. גולגולת, זה בהנחייתם של myelination, אשר מאפשר הגדלת מהירות הולכה עצב1. המיאלין הוא מבנה מיוחדים הנוצרת על-ידי שכבות הדחוס של קרום פלזמה שנוצר על ידי myelinating עכשיו, דונלד, כלומר oligodendrocytes להפוך במערכת העצבים המרכזית (CNS) ותאי שוואן במערכת העצבים ההיקפית (מערכת העצבים ההיקפית). גם מערכת העצבים וגם את מערכת העצבים ההיקפית, axoglial אינטראקציות לנהוג היווצרות של תחומים עצב מיוחדים: את Ranvier של צמתי ו שלהם שמסביב תחומים, paranodes ו juxtaparanodes2. הקטעים עצב מבודדים על ידי המיאלין, או פרקי הגבעולים, לסירוגין עם Ranvier של צמתים, המקבילים לתחומים unmyelinated קטן מועשר בערוצים ממותגת מתח נתרן (Nav). ריכוז גבוה של הפעלה מהירה של ערוציv נה Ranvier של צמתי לאפשר לרגנרציה של פוטנציאל פעולה, ויחד עם המאפיינים בידוד של עטיפות המיאלין, להבטיח את הולכה saltatory מהיר ויעיל של הדחף העצבי לאורך האקסון3.
בנוסף לתפקידה ב מאיצה את מהירות הולכה של הדחף העצבי, עכשיו, דונלד myelinating מספק תמיכה מטבולית הדנדריטי לאקסון, שמירה על שלמותה לטווח ארוך והשתתפות שלה4,של הישרדות5. יתר על כן, כבר ברור בבשנים האחרונות שהמיאלין הזה הוא מווסת באופן דינמי לאורך החיים, ולכן יש להניח המשתתפים תקנה הפלסטיות של פונקציות שונות של מערכת העצבים. התאמות של ההתפלגות, מספר, האורך, עובי של עטיפות המיאלין לאורך אקסונים ובכך עשוי לייצג דרך מקורית לכוון דק שונים רשתות6,7,8. לכן, רכישת המיאלין האבולוציוני הוא תהליך מפתח עבור פונקציות חושית, מוטורי, קוגניטיבי, ההפרעות של אינטראקציה בין אקסונים עכשיו, דונלד יותר ויותר נחשב לתרום התפתחותי או רכשה נוירולוגיות מחלות9.
קומפוזיציה מיאלין מלווה, עם תכונה ספציפית של שיעור גבוה של שומנים (70%) בהשוואה חלבונים (30%) בניגוד ממברנות הסלולר10. עם זאת, בניגוד המיאלין שומנים, רוב החלבונים המיאלין הן ספציפיות המיאלין, כולל חלבון המיאלין הבסיסי (MBP), חלבון proteolipid (פיפ), 2', נוקלאוטיד 3'-מחזורית 3'-phosphodiesterase (CNP), הקשורים המיאלין גליקופרוטאין (מג), מיאלין-אוליגודנדרוציטים גליקופרוטאין (ש א), PMP-22, P010. שיטות שונות היסטולוגית כתם המיאלין קיים המבוסס על הרכב השומנים שלה, כגון Luxol מהר כחול11, סודאן שחור B12, של בייקר חומצה ותקיזו את דמה שיטת13, וכן כסף מכתים14. למרות זאת, גישות אלה אינם תמיד מאפשרים עבור ניגודיות הולמת וגם רזולוציה להמחיש סיבים בודדים. גישה חלופית לזהות המיאלין היא דרך אימונוהיסטוכימיה נגד חלבונים מיאלין. נוגדנים שונים יעד ספציפי המיאלין אנטיגנים עם ירידה לפרטים גבוה והוא יכול לשמש באופן שגרתי כדי לזהות מבנים סיבי העצב. האינטראקציה נוגדן-אנטיגן אשר ניתן עוד יותר לגילוי באמצעות נוגדנים משניים מצמידים fluorophore נגד נוגדן ראשוני, דמיינו פלורסצנטיות נאותה מיקרוסקופ. כאן, אנו מתארים את פרוטוקול immunochemical כתם מיאלין ב- ex-vivo אסטרוציטומה פרוסות, מודל המאפשר לשימור טוב הארכיטקטורה רקמות עצבים. בנוסף, הארגון ואת גודל של תאי Purkinje (הנוירון סיבי העצב הבלעדית של הצרבלום) לגרום להם מודל קלאסי ללימודי אלקטרופיזיולוגיות, הם אידיאליים באופן דומה לביצוע מחקרים קבוע או הדמיה לחיות.
הפרוסות אסטרוציטומה נוצרים מן P9-P10 עכברים, זמן המתאים תחילת מוקדם Purkinje תא myelination, תהליך זה מושגת בעיקר בשבוע אחד ex-vivo (6-7 ימים במבחנה, DIV)15. יתר על כן, המודל הזה הוא מותאם כדי לחקור את המיאלין הפרעות כגון טרשת נפוצה (MS), כפי demyelination נרחבת יכולה להיגרם אסטרוציטומה פרוסות באמצעות myelinotoxic המורכב lysophosphatidylcholine (או lysolecithin, LPC), אשר ואחריו16,remyelination ספונטנית17. Remyelination אנדוגני מתקיים בין יומיים לאחר הסרת LPC של המדיום תרבות והוא כמעט מוחלט של שבוע לאחר הטיפול.
השלמתו של פרוטוקול זה לוקח 3 שבועות שנהנתם, כולל חצי יום הכנה תרבויות פרוסה אסטרוציטומה, שבוע כדי לקבל פרוסות מלא סיבי העצב, ואחריו 2 ימים כדי להגיע לשיא של demyelination, עוד שבוע עבור שלהם מלא remyelination. בנוסף, ניתן להשלים אימונוהיסטוכימיה 2 ימים. הפרוטוקול המתואר כאן מותאם בהמלטה סטנדרטי של 6 הגורים עכברים וצריך להתאים בנוגע למספר בעלי החיים שבהם משתמשים עבור הניסוי המתוכנן.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BME medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>41010026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (10X HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14180046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Horse Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;Streptomycin (10.000 IU/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gey&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9779-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose Solution (45%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8769-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysophosphatidylcholine (LPC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L4129-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol (100% ethanol)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>20821.330</td>
			<td>Cooled at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#174; X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>500622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>EuroMEDEX</td>
			<td>ET330-A</td>
			<td>pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>06-896</td>
			<td>Dilution 1/300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AB9348</td>
			<td>Dilution 1/150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>NE1019</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma)</td>
			<td>Gift from Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Dilution 1/5 to 1/10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8809</td>
			<td>Dilution 1/150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34151</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Secondary Antibodies conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue chopper</td>
			<td>McIlwain</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14101-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-straight forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved-fine forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11297-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes (60-mm and 100-mm)</td>
			<td>TPP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-, 6-well culture plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell culture inserts (0,4 &#181;m, 30-mm diameter)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>37&#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-end pipette tips</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>134000CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-bore pipette tips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>2079G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td></td>
			<td>20 or 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filters</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td></td>
			<td>0.22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>RS France</td>
			<td></td>
			<td>76 x 26 x 1.1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>RS France</td>
			<td></td>
			<td>22 x 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Sciences Tissue Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>5511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and immunostaining of myelinating organotypic cerebellar slice cultures

המיאלין במערכת העצבים, הוא מבנה הממברנה מורכבות שנוצרו על-ידי myelinating גליה תאים, אשר אקסונים ensheathes ומקל מהר וההולכה. שינוי המיאלין הוכח להופיע במחלות נוירולוגיות שונות, איפה היא מזוהה עם גירעונות פונקציונלי. כאן, אנו מספקים תיאור מפורט של אקסית vivo דגם המורכב העכבר organotypic אסטרוציטומה פרוסות, אשר יכול להישמר בתרבות במשך מספר שבועות, עוד יותר להיקרא להמחיש מיאלין.

דוגמאות המיאלין נציג immunostainings לפרוסות אסטרוציטומה organotypic המתקבל P9-P10 C57black6 פראי-סוג (WT) (איור 2 א), כמו גם פיפ-GFP העכברים הטרנסגניים (איור 2B), יחד עם תאי Purkinje מכתים. שעוטף מן החומר הלבן אסטרוציטומה פרוסות מסלולים באזור הפרוסות לעבר הפריפריה הנמ?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures at JoVE.com

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Immunostaining של Myelinating Organotypic פרוסה אסטרוציטומה תרבויות והכנה

כאן אנו מציגים שיטה להכין organotypic פרוסה תרבויות מן המוח הקטן העכבר מיאלין, צביעת על-ידי אימונוהיסטוכימיה מתאים לחקור מנגנונים של myelination ו- remyelination במערכת העצבים המרכזית.

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

שיטה זו מאפשרת ללמוד את המנגנון הבסיסי של מילינג ורמיאלציה ברמה התאית והטיסולרית. טכניקה זו נמצאת בצומת דרכים בין תרבויות ראשוניות וגישות vivo. זהו מודל מהיר ונגיש עם היתרון העיקרי של שמירה על ארכיטקטורת הרקמה.הפגנת ההליך תהיה מלינה ת'יות, פוסט דוקטורנטית ורמי רונאזאנו, דוקטורנטית מהמעבדה שלי. כדי להתחיל, להכניס מספריים קטנים בעדינות לתוך מגנום foramen לחתוך את הגולגולת על ידי ביצוע חתך צדי אחד לכיוון הצד, ולאחר מכן לחתוך סביב כל גולגולת הראש. כדי לאחזר את החלק הגבי של הגולגולת, השתמש במטס דק וישר כדי להרים בזהירות את החלק הגבי של הגולגולת.ואז בזהירות להציג את המדפים בין גולגולת הגחון והמוח. בעדינות להעיף את המוח לחתוך את העצבים האופטיים והטריגמינליים עם מספריים קטנים. לאחר מכן, סובב את הראש או את החלק הגבי של הגולגולת במהופך ממש מעל צלחת תרבות תאים של 60 מילימטר המכילה מדיום ניתוח קר כקרח כדי לעזור למוח לרדת בכוח הכבידה.באמצעות מטלות עדין, לכוון את המוח עם הצד הגבי פונה כלפי מעלה ואת הצד הגחוני בשכיבה. מתחת למיקרוסקופ המשקפת, השתמש במקלות ישרות עדינות כדי לשתק את המוח בצד הקדמה. לאחר מכן, הפרד את המוח האחורי משאר המוח.חותכים את peduncles המוח הקטן מתחת למוח הקטן כדי להפריד את המוח הקטן משאר המוח האחורי. לאחר המוח הקטן מבודד, להשתמש עדין, מדפים ישר לקרוע בזהירות את קרום המוח. החזיקו את המוח הקטן בעדינות עם המדפים העדינים והמסובבים וה מניחים אותו עם הצד הגבי למעלה על גבי פלטפורמת הפלסטיק, בניצב אל סכין הגילוח של המסוק.לאחר מכן, עם קצה סטרילי, קצה דק פיפטה מחובר פיפטה מיליליטר אחד, שאפו כל גישה של מדיום ניתוח סביב המוח הקטן. לאחר מכן, עם מסוק רקמות, פרוסה 300 מיקרומטר עבה קטעים saggital של המוח הקטן. לאחר מכן, מוסיפים טיפה של מדיום ניתוח על המוח הקטן פרוס בעדינות.לאחר מכן, עם קצה פיפטה חזיר רחב מחובר פיפטה מיליליטר אחד, לאט שאפו את המוח הקטן פרוס ולהעביר אותו בחזרה לתוך צלחת תרבות התא 60 מילימטר המכיל קרח קר ניתוח בינוני. לאחר מכן, השתמשו בשני מדפים ישרים עדין כדי להפריד פרוסות בודדות. לאחר מכן, עם קצה פיפטה חזיר רחב מחובר פיפטה מיליליטר אחד, להעביר עד ארבע פרוסות נבחרות מן vermis, יחד עם כמה מדיום ניתוח על הכנס תרבות אחת של צלחת שש היטב.הסר כל גישה של מדיום ניתוח סביב הפרוסות באמצעות קצה דק טיפט. עבור demyelination, להסיר את כל התרבות בינוני מתחת לתרבות מכניס לאחר שישה ימים במבחנה, ולהחליף אותו עם מיליליטר אחד ל הבאר של אמצעי תרבות טרום מחומם, טרי המכיל 0.5 מיליגרם למיליליטר LPC. דגירה במשך 15 עד 17 שעות ב 37 מעלות צלזיוס בסביבה 5%פחמן דו חמצני.לאחר הדגירה, לשטוף את המכניסים על ידי הצבת אותם בצלחת פטרי 25 מיליליטר המכיל מיליליטר אחד של מדיום תרבות מחומם מראש. לאחר מכן, מיד להעביר את התרבות מכניסה חדש, שישה צלחת גם, המכיל טרי, מדיום תרבות מחומם מראש. כדי להתחיל אימונוהיסטוכימיה, ראשית להשתמש במטסים כדי להרים את התרבות מכניס ולהסיר את מדיום התרבות מתחתיהם.לאחר מכן, להוסיף שני מיליליטר של 4%PFA ב 1x PBS, ph 7.4, על מוסיף קרום כדי לתקן את פרוסות המוח הקטן. לאחר 30 דקות, לשטוף את הפרוסות שלוש פעמים עם שני מיליליטר של 1x PBS במשך 10 דקות כל לשטוף. לאחר מכן, מתחת למיקרוסקופ המשקפת, באמצעות הגדלה של פי 25 עד 30, השתמש באזמל או במברשת כדי לנתק בעדינות את הפרוסות ממוסיף הממברנה.לאחר מכן, השתמש במברשת כדי להעביר את הפרוסות הצפות לתוך בארות של צלחת ארבע בארות, המכיל 1x PBS כדי להגביל את צריכת הנוגדנים. לאחר מכן, שאפו את ה-PBS מכל באר והדקרו את הפרוסות באתנול מקורר מראש של 100% במינוס 20 מעלות צלזיוס למשך 15 עד 20 דקות. לאחר הדגירה, שאפו את האתנול 100% ושטפו את הפרוסות לזמן קצר עם פיב"ג אחד.לאחר מכן, לשטוף אותם פעמיים בטמפרטורת החדר עם 1x PBS במשך 10 דקות כל לשטוף. כדי לחסום אתרי קיבוע נוגדנים לא ספציפיים, שאפו את ה-PBS והדקרו את הפרוסות בתתב"ג המכיל 1x PBS, 5%NGS ו-0.3% חומר ניקוי יוני בטמפרטורת החדר למשך 30 עד 45 דקות. לאחר מכן, מוסיפים נוגדנים ראשוניים מדוללים בתפיסת החסימה ומדגרים את הפרוסות בארבע מעלות צלזיוס בן לילה.לאחר הדגירה לילה, לשטוף את הפרוסות שלוש פעמים עם 1x PBS במשך 10 דקות כל לשטוף. לאחר מכן מוסיפים את הנוגדנים המשניים, מדוללים בתפיסת החסימה, ביחס דילול של 1 עד 500 ומדגרים את הפרוסות בטמפרטורת החדר בחושך במשך שלוש שעות. לאחר הדגירה עם הנוגדן המשני, לשטוף את הפרוסות שלוש פעמים ב 1x PBS בחושך במשך 10 דקות כל לשטוף.לאחר מכן, תחת מיקרוסקופ משקפת, מניחים 100 מיקרולטרים של PBS 1x על השקופית עם מברשת, להעביר את הפרוסות לתוך PBS ולשטח אותם על השקופית. הסר כל גישה של PBS. לבסוף, מניחים טיפה של מדיום הרכבה ישירות על החלקת מכסה הזכוכית בעדינות לכסות את הפרוסות.immunostainings Myelin בפרוסות המוח הקטן organotypic, המתקבל ימים שלאחר הלידה 9 עד 10 C57 שחור שישה עכברים מסוג בר נצפו ב 11 ימים במבחנה עם צמתים של ronviae מועשר בתמי נתרן מגודר מתח, מוקף על ידי תחום צומת אקסוגליאלי עלה. אותן תוצאות נצפו עבור עכברים מהופנטים PLP-GFP. מילינג של תאי parkengy מושגת בעיקר לאחר שבוע בתרבות.טיפול LPC demyelinates באופן מלא את הפרוסות, אשר remyelinate באופן ספונטני והם מיילין מלא שישה ימים לאחר demyelination. הליך זה צריך לקחת 25 דקות לכל היותר. זו באמת הנקודה הקריטית ביותר.תרבות פרוסות אורגנוטיפיק מתאימה לחקר הדמיה חיה של דינמיקת המיאלציה. זה יכול לשמש גם עבור מיקוד ניסויים הקרנת סמים. טכניקה זו מאפשרת גישה קלה וכמותית לחקר תהליכי מילינג ורמיאלציה.על הניסויים לפעול על פי נהלי הבטיחות הבסיסיים החלים על רווחת בעלי החיים, מיאלציה מוגזמת וחדה.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

תרבות Organotypic בהיפוקמפוס Slice דגם לבחינת פגיעה עצבית

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

אופן ההכנה פורסים, רקמות culturing Organotypic ו הקלטה בלוציפראז של פעילות הגן שעון בגרעין suprachiasmatic

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Organotypic Slice תרבויות בהיפוקמפוס

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

תרבויות cerebellar Organotypic: אתגרים אפופטוטיים וזיהוי

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

הקלטה נייד שלמים מן ההכנה פורסים Organotypic של הניאוקורטקס

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

גזירת תרבויות Oligodendrocyte מועשר Neuron Oligodendrocyte / Myelinating משותף תרבויות מן שלאחר הלידה רקמות Murine

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

פורסים תרבויות Organotypic של המוח התיכון הגחון עובריים: מערכת מחקר ופיתוח עצבי דופאמין במבחנה</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

הניתוח של מורפולוגיה דנדריטים סלולרי פורקינג&#39; בתרבויות Slice Organotypic

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

תרבויות Organotypic Slice ללמוד oligodendrocyte Dynamics וmyelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

תרבויות Organotypic Slice ניתוח של עצבים וכלי דם שיפוץ בEntorhino-היפוקמפוס

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...