Name: preparation and immunostaining of myelinating organotypic cerebellar slice cultures
Uploaded: 2019-03-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures at JoVE.com

Ringraziamo il dottor Sean Freeman, Dr. Nathalie Sol-Foulon e Dr. Thomas Roux per i preziosi commenti sul manoscritto. Questo lavoro è stato finanziato dalla INSERM, ICM, ARSEP sovvenzioni R13123DD, ANR R17127DD (al D.C.) e FRM fellowship, SPF20110421435 (al D.C.), FDT20170437332 (di M.T.). Ringraziamo la struttura di cultura cellulare CELIS e l'icm. Piattaforma di imaging quant.

Tutti i lavori che coinvolgono gli animali è conformato da politiche istituzionali e linee guida stabilite dall'UPMC, INSERM e il francese e la direttiva comunitaria del Consiglio 86/609/CEE.
1. preparazione del terreno di coltura e cultura inserti (hands-on tempo ≈ 10 – 15 min)
Nota: Eseguire questo passaggio in una cappa a flusso cultura in condizioni sterili
<ol><li>Preparare 40 mL di terreno di coltura, che è costituito da 50% BME, soluz...

<ol>
	<li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+Plasticity+and+Nervous+System+Function.">Myelin Plasticity and Nervous System Function.</a> Annual Review Neuroscience. 41, 61-76 (2018).</li><li>Desmazi&#232;res, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+at+the+nodal+and+perinodal+axonal+domains:+a+basis+for+multiple+sclerosis+pathology.">Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple sclerosis pathology.</a> Multiple Sclerosis Houndmills Basingstoke England. 18, 133-137 (2012).</li><li>Waxman, S. G., Ritchie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+the+myelinated+axon.">Molecular dissection of the myelinated axon.</a> Annals of Neurology. 33, 121-136 (1993).</li><li>F&#252;nfschilling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolytic+oligodendrocytes+maintain+myelin+and+long-term+axonal+integrity.">Glycolytic oligodendrocytes maintain myelin and long-term axonal integrity.</a> Nature. 485, 517-521 (2012).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroglia+metabolically+support+axons+and+contribute+to+neurodegeneration.">Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration.</a> Nature. 487, 443-448 (2012).</li><li>Chang, K. -. J., Redmond, S. A., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+myelination:+implications+for+mechanisms+of+neural+plasticity.">Remodeling myelination: implications for mechanisms of neural plasticity.</a> Nature Neurosciences. 19, 190-197 (2016).</li><li>Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mechanism+of+nervous+system+plasticity:+activity-dependent+myelination.">A new mechanism of nervous system plasticity: activity-dependent myelination.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16, 756-767 (2015).</li><li>Nave, K. -. A., Werner, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+of+the+nervous+system:+mechanisms+and+functions.">Myelination of the nervous system: mechanisms and functions.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 503-533 (2014).</li><li>Nave, K. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+and+support+of+axonal+integrity+by+glia.">Myelination and support of axonal integrity by glia.</a> Nature. 468, 244-252 (2010).</li><li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiological Reviews. 81, 871-927 (2001).</li><li>Kluver, H., Barrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+combined+staining+of+cells+and+fibers+in+the+nervous+system.">A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 12, 400-403 (1953).</li><li>Meier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+observations+on+early+myelination+in+the+human+spinal+cord.+Light+and+electron+microscope+study.">Some observations on early myelination in the human spinal cord. Light and electron microscope study.</a> Brain Research. 104, 21-32 (1976).</li><li>Hori, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SIMPLIFIED+ACID+HEMATEIN+TEST+FOR+PHOSPHOLIPIDS.">A SIMPLIFIED ACID HEMATEIN TEST FOR PHOSPHOLIPIDS.</a> Stain Technology. 38, 221-225 (1963).</li><li>Gallyas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+myelin+by+means+of+physical+development.">Silver staining of myelin by means of physical development.</a> Neurological Research. 1, 203-209 (1979).</li><li>Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje+cell+survival+and+axonal+regeneration+are+age+dependent:+an+in+vitro+study.">Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study.</a> Journal of Neuroscience An Official Journal of the Society of Neuroscience. 17, 3710-3726 (1997).</li><li>Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysolecithin+induces+demyelination+in+vitro+in+a+cerebellar+slice+culture+system.">Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system.</a> Journal of Neuroscience Research. 78, 157-166 (2004).</li><li>Zhang, H., Jarjour, A. A., Boyd, A., Williams, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+nervous+system+remyelination+in+culture--a+tool+for+multiple+sclerosis+research.">Central nervous system remyelination in culture--a tool for multiple sclerosis research.</a> Experimental Neurology. 230, 138-148 (2011).</li><li>Rasband, M. N., Peles, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nodes+of+Ranvier:+Molecular+Assembly+and+Maintenance.">The Nodes of Ranvier: Molecular Assembly and Maintenance.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8, a020495 (2015).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neurosciences Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Hussain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+and+Nestorone+facilitate+axon+remyelination:+a+role+for+progesterone+receptors.">Progesterone and Nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors.</a> Endocrinology. , 3820-3831 (2011).</li><li>Wioland, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epsilon+toxin+from+Clostridium+perfringens+acts+on+oligodendrocytes+without+forming+pores,+and+causes+demyelination.">Epsilon toxin from Clostridium perfringens acts on oligodendrocytes without forming pores, and causes demyelination.</a> Cellular Microbiology. 17, 369-388 (2015).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).</li><li>Medina-Rodr&#237;guez, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+in+vivo+remyelination+with+small+molecules:+a+neuroreparative+pharmacological+treatment+for+Multiple+Sclerosis.">Promoting in vivo remyelination with small molecules: a neuroreparative pharmacological treatment for Multiple Sclerosis.</a> Science Reports. 7, (2017).</li><li>Spassky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+steps+of+oligodendrogenesis:+insights+from+the+study+of+the+plp+lineage+in+the+brain+of+chicks+and+rodents.">The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents.</a> Developmental Neurosciences. 23, 318-326 (2001).</li><li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+green+fluorescent+protein+in+the+oligodendrocyte+lineage:+a+transgenic+mouse+for+developmental+and+physiological+studies.">Expression of the green fluorescent protein in the oligodendrocyte lineage: a transgenic mouse for developmental and physiological studies.</a> Journal of Neuroscience Research. 70, 529-545 (2002).</li><li>Gibson, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+promotes+oligodendrogenesis+and+adaptive+myelination+in+the+mammalian+brain.">Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain.</a> Science. 344, 1252304 (2014).</li><li>Tomassy, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+profiles+of+myelin+distribution+along+single+axons+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex.">Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Science. 344, 319-324 (2014).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+sensitive+optical+coherence+microscopy+for+brain+imaging.">Polarization sensitive optical coherence microscopy for brain imaging.</a> Optics Letters. 41, 2213-2216 (2016).</li><li>Freudiger, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biomedical+imaging+with+high+sensitivity+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science. 322, 1857-1861 (2008).</li><li>Lim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+Schwann+cell+myelination+by+third+harmonic+generation+microscopy.">Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).</li><li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy.">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).</li><li>Arancibia-Carcamo, I. L., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+node+of+Ranvier+in+CNS+pathology.">The node of Ranvier in CNS pathology.</a> Acta Neuropathologia. (Berlin). 128, 161-175 (2014).</li></ol>

Qui, abbiamo dettaglio un protocollo per generare un ex vivo modello corrispondente alle culture del mouse organotipiche cerebellari fetta, adattato da precedentemente metodi pubblicati15,16,19 e la mielina successiva immunostaining di questi preparati. Questa strategia offre la possibilità di visualizzare componenti della mielina con una risoluzione elevata negli stati sani e patologici.
Tratto da 1...

I neuroni sono cellule altamente polarizzate, che comprendono un vano somato-dendritica che riceve gli input dal suo ambiente e un assone che assicura la generazione e la propagazione di impulsi elettrici ad altre cellule. Propagazione rapida e tempestiva consegna delle informazioni è essenziale per il corretto funzionamento del sistema nervoso. Nei vertebrati, esso è facilitato dalla mielinizzazione, che permette di aumentare la velocità di conduzione assonale1. Mielina è una struttura specializzata formata da strati compattati della membrana di plasma generato dalla glia myelinating, vale a dire gli oligodendrociti nel sistema nervoso centrale (SNC) e cellule di Schwann nel sistema nervoso periferico (PNS). Sia nel SNC e SNP, interazioni axoglial guidare la formazione di domini axonal specializzati: i nodi di Ranvier e loro circostante di domini, paranodes e juxtaparanodes2. I axonal segmenti isolati di mielina o internodi, si alternano con i nodi di Ranvier, che corrispondono a piccoli domini unmyelinated arricchiti in scanalature tensione-gated del sodio (Nav). L'alta concentrazione e la rapida attivazione di canaliv Na presso i nodi di Ranvier consentono la rigenerazione dei potenziali d'azione e insieme con le proprietà isolanti delle guaine mieliniche, garantire la conduzione efficiente e veloce stile della impulso nervoso lungo l' assone3.
Oltre al suo ruolo nell'accelerare la velocità di conduzione dell'impulso nervoso, glia myelinating fornisce supporto metabolico per l'assone, preservare la sua integrità a lungo termine e che partecipano della sua sopravvivenza4,5. Inoltre, è diventato chiaro in anni recenti che mielina è modulata in modo dinamico per tutta la vita, quindi presumibilmente partecipano il regolamento e la plasticità delle varie funzioni del sistema nervoso. Rettifiche nette per la distribuzione, numero, lunghezza e spessore delle guaine di mielina lungo gli assoni così potrebbero rappresentare un nuovo modo di regolare vari reti6,7,8. Pertanto, l'acquisizione evolutiva della mielina è un processo chiave per le funzioni sensoriali, motorie e cognitive e la perturbazione dell'interazione tra assoni e cellule gliali è sempre più considerata come un contributo per l'inerente allo sviluppo o acquisite neurologica malattie9.
Composizione della mielina è stata caratterizzata, con la caratteristica peculiare di un'alta percentuale di lipidi (70%) rispetto alle proteine (30%) a differenza di altre membrane cellulari10. Tuttavia, a differenza dei lipidi della mielina, la maggior parte delle proteine della mielina sono specifica di mielina, tra cui la proteina basica della mielina (MBP), proteolipide (PLP), 2', glicoproteina di 3'-ciclico del nucleotide 3'-fosfodiesterasi (CNP), mielina (MAG), glicoproteina del oligodendrocyte del myelin (MOG), PMP-22 e P010. Vari metodi istologici a macchiare la mielina esistano base alla sua composizione lipidica, come Luxol fast blu11, Sudan nero B12, Baker ematina acida metodo13, così come14di macchiatura d'argento. Tuttavia, questi approcci non sempre consentono un adeguato contrasto e risoluzione per visualizzare le singole fibre. Un approccio alternativo per rilevare la mielina è tramite immunoistochimica diretto contro proteine della mielina. Vari anticorpi antigeni della mielina-specifici di destinazione con un'alta specificità e possono essere utilizzati regolarmente per rilevare strutture myelinated. L'interazione antigene-anticorpo può essere ulteriormente rivelato utilizzando un anticorpo secondario accoppiato ad un fluoroforo diretto contro l'anticorpo primario e visualizzati con microscopia di fluorescenza adeguata. Qui, descriviamo un protocollo immunochimico per macchiare la mielina su ex vivo cerebellare fette, un modello che permette per una buona conservazione dell'architettura del tessuto nervoso. Inoltre, l'organizzazione e la dimensione delle cellule del Purkinje (l'unico neurone myelinated del cervelletto) li rendono un modello classico per gli studi elettrofisiologici e sono allo stesso modo ideale per svolgere gli studi fissi o live-imaging.
Le fette cerebellare sono generate dai topi P9-P10, un tempo corrispondente alla comparsa precoce di mielinizzazione delle cellule di Purkinje, un processo che avviene per lo più di una settimana ex vivo (6-7 giorni in vitro, DIV)15. Inoltre, questo modello è adattato per indagare demielinizzanti come la sclerosi multipla (SM), come un vasto demyelination può essere indotta a cerebellare fette utilizzando myelinotoxic composto lisofosfatidilcolina (o lisolecitina, LPC), cui è seguita da una spontanea remyelination16,17. Remyelination endogeno avviene da due giorni dopo la rimozione di LPC dal terreno di coltura ed è quasi completa un post trattamento di settimana.
Il completamento del presente protocollo prende circa 3 settimane, tra cui una mezza giornata per la preparazione di colture cerebellare fetta una settimana per ottenere fette completamente myelinated, seguite da 2 giorni per raggiungere la vetta del demyelination e un'altra settimana per loro pieno remyelination. Inoltre, immunohistochemistry può essere completato in 2 giorni. Il protocollo descritto qui è adattato a una cucciolata standard di 6 topi cuccioli e deve essere adattato per quanto riguarda il numero di animali utilizzati per l'esperimento pianificato.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BME medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>41010026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (10X HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14180046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Horse Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;Streptomycin (10.000 IU/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gey&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9779-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose Solution (45%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8769-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysophosphatidylcholine (LPC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L4129-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol (100% ethanol)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>20821.330</td>
			<td>Cooled at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#174; X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>500622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>EuroMEDEX</td>
			<td>ET330-A</td>
			<td>pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>06-896</td>
			<td>Dilution 1/300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AB9348</td>
			<td>Dilution 1/150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>NE1019</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma)</td>
			<td>Gift from Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Dilution 1/5 to 1/10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8809</td>
			<td>Dilution 1/150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34151</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Secondary Antibodies conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue chopper</td>
			<td>McIlwain</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14101-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-straight forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved-fine forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11297-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes (60-mm and 100-mm)</td>
			<td>TPP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-, 6-well culture plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell culture inserts (0,4 &#181;m, 30-mm diameter)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>37&#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-end pipette tips</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>134000CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-bore pipette tips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>2079G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td></td>
			<td>20 or 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filters</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td></td>
			<td>0.22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>RS France</td>
			<td></td>
			<td>76 x 26 x 1.1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>RS France</td>
			<td></td>
			<td>22 x 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Sciences Tissue Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>5511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
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preparation and immunostaining of myelinating organotypic cerebellar slice cultures

Nel sistema nervoso, della mielina è una struttura complessa membrana generata da myelinating glial cells, cui assoni di ensheathes e facilita la conduzione elettrica. Alterazione della mielina è stato indicato per accadere in varie malattie neurologiche, dove è associato con i deficit funzionali. Qui, forniamo una descrizione dettagliata di un ex vivo modello composto da fette organotipiche cerebellari del topo, che possono essere mantenute in coltura per diverse settimane e più ulteriormente essere etichettati per visualizzare la mielina.

Esempi di immunostainings rappresentante della mielina in organotipiche cerebellari fette ottenute da P9-P10 C57black6 wild-type (WT) (Figura 2A), così come topi transgenici PLP-GFP (Figura 2B), insieme alle cellule di Purkinje macchiatura. Mielinare da materia bianca cerebellare fette canzoni regione delle fette verso la periferia della folia e mielinizzazione delle cellule del Purkinje è per lo più raggiunto dopo 6 o 7 DIV. ...

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Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Preparazione e Immunostaining di su colture organotipiche Myelinating fetta cerebellare

Qui presentiamo un metodo per preparare organotipiche fetta culture dal cervelletto di topo e guaina mielinica colorazione da immunohistochemistry adatto per studiare i meccanismi della mielinizzazione e remyelination nel sistema nervoso centrale.

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Questo metodo consente di studiare il meccanismo di base della mielinazione e della remielinazione a livello cellulare e tisulare. Questa tecnica è al crocevia tra culture primarie e approcci in vivo. È un modello veloce e accessibile con il principale vantaggio di preservare l'architettura tissutale.A dimostrare la procedura saranno Melina Thetiot, ricercatrice post-dottorato e Remi Ronzano, dottoranda del mio laboratorio. Per iniziare, inserire delicatamente una piccola forbice nel forame magnum e tagliare il cranio facendo un'incisione laterale verso il lato, quindi tagliare tutto intorno al cranio della testa. Per recuperare la parte dorsale del cranio, utilizzare una forcep fine e dritta per sollevare con cura la parte dorsale del cranio.Quindi introdurre attentamente le forcep tra il cranio ventrale e il cervello. Capovolgere delicatamente il cervello e tagliare i nervi ottici e trigeminali con piccole forbici. Quindi, capovolgere la testa o la parte dorsale del cranio appena sopra un piatto di coltura cellulare di 60 millimetri contenente mezzo di dissezione ghiacciata per aiutare il cervello a cadere per gravità.Usando forcep fini, orientare il cervello con il lato dorsale rivolto verso l'alto e il lato ventrale sdraiato. Al microscopio binoculare, utilizzare le forcep sottili e dritte per immobilizzare il cervello sul lato delencefalo. Quindi, separare il cervello posteriore dal resto del cervello.Tagliare i peduncoli cerebellari sotto il cervelletto per separare il cervelletto dal resto del cervello posteriore. Una volta isolato il cervelletto, utilizzare forcette sottili e dritte per strappare con cura le meningi. Tenere delicatamente il cervelletto con le forcelle fini e curve e posizionarlo con il lato dorsale verso l'alto sulla piattaforma di plastica, perpendicolarmente alla lama del rasoio chopper.Successivamente, con una punta sterile e sottile di pipetta attaccata a una pipetta da un millilitro, aspirare qualsiasi accesso al mezzo di dissezione intorno al cervelletto. Quindi, con un elicottero tissutale, affettare sezioni saggitali spesse 300 micrometri del cervelletto. Quindi, aggiungere delicatamente una goccia di mezzo di dissezione sul cervelletto affettato.Quindi, con un'ampia punta di pipetta di cinghiale attaccata alla pipetta da un millilitro, aspirare lentamente il cervelletto affettato e trasferirlo di nuovo nel piatto di coltura cellulare da 60 millimetri contenente mezzo di dissezione ghiacciato. Quindi, utilizzare due forcep sottili e dritte per separare singole fette. Quindi, con un'ampia punta di pipetta di cinghiale attaccata alla pipetta da un millilitro, trasferire fino a quattro fette selezionate dai parassiti, insieme a qualche mezzo di dissezione su un inserto di coltura di una piastra a sei pozzetti.Rimuovere qualsiasi accesso al mezzo di dissezione intorno alle fette utilizzando una punta di pipetta sottile. Per la demielinazione, rimuovere tutto il mezzo di coltura al di sotto degli inserti di coltura dopo sei giorni in vitro e sostituirlo con un millilitro per pozzo del mezzo di coltura fresco preri riscaldato contenente 0,5 milligrammi per millilitro LPC. Incubare per 15-17 ore a 37 gradi Celsius in un ambiente di anidride carbonica al 5%.Dopo l'incubazione, lavare gli inserti posizionandoli in una piastra di Petri da 25 millilitri contenente un millilitro di mezzo di coltura preri riscaldato. Quindi, trasferire immediatamente gli inserti di coltura in un nuovo piatto di sei pozza, contenente un mezzo di coltura fresco e preri riscaldato. Per iniziare l'immunoistochimica, utilizzare prima le forcep per sollevare gli inserti di coltura e rimuovere il mezzo di coltura sottostante.Quindi, aggiungere due millilitri di 4%PFA in 1x PBS, ph 7.4, sugli inserti della membrana per fissare le fette cerebellari. Dopo 30 minuti, lavare le fette tre volte con due millilitri di 1x PBS per 10 minuti ciascuno lavaggio. Successivamente, al microscopio binoculare, utilizzando un ingrandimento da 25x a 30x, utilizzare un bisturi o un pennello per staccare delicatamente le fette dagli inserti della membrana.Quindi, utilizzare un pennello per trasferire le fette galleggianti nei pozzi di una piastra di quattro pozzatti, contenente 1x PBS per limitare il consumo di anticorpi. Quindi, aspirare il PBS da ogni pozzo e incubare le fette in etanolo pre-raffreddato al 100% a meno 20 gradi Celsius per 15-20 minuti. Dopo l'incubazione, aspirare l'etanolo al 100% e lavare brevemente le fette con 1x PBS.Quindi, lavarli due volte a temperatura ambiente con 1x PBS per 10 minuti ogni lavaggio. Per bloccare siti di fissazione degli anticorpi non specifici, aspirare il PBS e incubare le fette in una soluzione contenente 1x PBS, 5%NGS e 0,3% detergente non ionico a temperatura ambiente per 30-45 minuti. Successivamente, aggiungere anticorpi primari diluiti nella soluzione di blocco e incubare le fette a quattro gradi Celsius durante la notte.Dopo l'incubazione notturna, lavare le fette tre volte con 1 PBS per 10 minuti ciascuno lavaggio. Quindi aggiungere gli anticorpi secondari, diluiti nella soluzione di blocco, a un rapporto di diluizione da uno a 500 e incubare le fette a temperatura ambiente al buio per tre ore. Dopo l'incubazione con l'anticorpo secondario, lavare le fette tre volte in 1x PBS al buio per 10 minuti ogni lavaggio.Successivamente, sotto un microscopio binoculare, posizionare 100 microlettrici di 1x PBS sullo scivolo e con un pennello, trasferire le fette nel PBS e appiattirle sullo scivolo. Rimuovere qualsiasi accesso a PBS. Infine, posizionare una goccia di mezzo di montaggio direttamente sullo scivolo di copertura del vetro e coprire delicatamente le fette.Immunosottenizioni di mielina in fette cerebellari organotipiche, ottenute dai giorni postnatali da 9 a 10 C57 neri sei topi di tipo selvatico sono stati osservati a 11 giorni in vitro con nodi di ronviae arricchiti in canali di sodio gated di tensione, affiancati dal dominio di giunzione assiogliale paranodale. Gli stessi risultati sono stati osservati per i topi transgenici PLP-GFP. La mielinzione delle cellule del parkengy si ottiene principalmente dopo una settimana di coltura.Il trattamento LPC demielinizza completamente le fette, che si remielinano spontaneamente e sono completamente mielinate sei giorni dopo la demielinizzazione. Questa procedura dovrebbe richiedere 25 minuti al massimo. E' davvero il punto più critico.La coltura di fette organotipiche è adatta per lo studio di imaging dal vivo delle dinamiche mielinationi. Può anche essere utilizzato per indirizzare gli esperimenti di screening dei farmaci. Questa tecnica consente un approccio facile e quantitativo per studiare i processi di mielinizzazione e remielinizzazione.Gli sperimentatori devono seguire le procedure di sicurezza di base applicabili al benessere degli animali, alla mielinazione eccessiva e acuta.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

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Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Ricerca

Neuroscienze

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

Fetta Preparazione, coltura tissutale organotipica e Registrazione luciferasi di attività Clock gene nel nucleo soprachiasmatico

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

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