Name: preparation and immunostaining of myelinating organotypic cerebellar slice cultures
Uploaded: 2019-03-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures at JoVE.com

Vi takker Dr. Sean Freeman, Dr. Nathalie Sol-Foulon og Dr. Thomas Roux for verdifulle kommentarer på manuskriptet. Dette arbeidet ble finansiert av INSERM, ICM, ARSEP tilskudd R13123DD, ANR R17127DD (å e.Kr.) og FRM fellesskap, SPF20110421435 (å e.Kr.), FDT20170437332 (til Mt). Vi takker CELIS celle kultur anlegget og icm. Quant tenkelig plattform.

Alt arbeid som involverer dyr overholdt institusjonelle politikk og retningslinjer som er etablert av den UPMC, INSERM og fransk og europeisk fellesskap rådsdirektiv 86/609/EØF.
1. forberedelse kultur Medium og kultur setter inn (Hands-on tid ≈ 10-15 min)
Merk: Utføre dette trinnet i flyt kultur hette under sterile forhold
<ol><li>Forberede 40 mL kultur medium, som består av 50% BME, 25% Hanks balansert saltløsning (1 x), 25% inaktivert hes...

<ol>
	<li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+Plasticity+and+Nervous+System+Function.">Myelin Plasticity and Nervous System Function.</a> Annual Review Neuroscience. 41, 61-76 (2018).</li><li>Desmazi&#232;res, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+at+the+nodal+and+perinodal+axonal+domains:+a+basis+for+multiple+sclerosis+pathology.">Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple sclerosis pathology.</a> Multiple Sclerosis Houndmills Basingstoke England. 18, 133-137 (2012).</li><li>Waxman, S. G., Ritchie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+the+myelinated+axon.">Molecular dissection of the myelinated axon.</a> Annals of Neurology. 33, 121-136 (1993).</li><li>F&#252;nfschilling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolytic+oligodendrocytes+maintain+myelin+and+long-term+axonal+integrity.">Glycolytic oligodendrocytes maintain myelin and long-term axonal integrity.</a> Nature. 485, 517-521 (2012).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroglia+metabolically+support+axons+and+contribute+to+neurodegeneration.">Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration.</a> Nature. 487, 443-448 (2012).</li><li>Chang, K. -. J., Redmond, S. A., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+myelination:+implications+for+mechanisms+of+neural+plasticity.">Remodeling myelination: implications for mechanisms of neural plasticity.</a> Nature Neurosciences. 19, 190-197 (2016).</li><li>Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mechanism+of+nervous+system+plasticity:+activity-dependent+myelination.">A new mechanism of nervous system plasticity: activity-dependent myelination.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16, 756-767 (2015).</li><li>Nave, K. -. A., Werner, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+of+the+nervous+system:+mechanisms+and+functions.">Myelination of the nervous system: mechanisms and functions.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 503-533 (2014).</li><li>Nave, K. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+and+support+of+axonal+integrity+by+glia.">Myelination and support of axonal integrity by glia.</a> Nature. 468, 244-252 (2010).</li><li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiological Reviews. 81, 871-927 (2001).</li><li>Kluver, H., Barrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+combined+staining+of+cells+and+fibers+in+the+nervous+system.">A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 12, 400-403 (1953).</li><li>Meier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+observations+on+early+myelination+in+the+human+spinal+cord.+Light+and+electron+microscope+study.">Some observations on early myelination in the human spinal cord. Light and electron microscope study.</a> Brain Research. 104, 21-32 (1976).</li><li>Hori, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SIMPLIFIED+ACID+HEMATEIN+TEST+FOR+PHOSPHOLIPIDS.">A SIMPLIFIED ACID HEMATEIN TEST FOR PHOSPHOLIPIDS.</a> Stain Technology. 38, 221-225 (1963).</li><li>Gallyas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+myelin+by+means+of+physical+development.">Silver staining of myelin by means of physical development.</a> Neurological Research. 1, 203-209 (1979).</li><li>Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje+cell+survival+and+axonal+regeneration+are+age+dependent:+an+in+vitro+study.">Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study.</a> Journal of Neuroscience An Official Journal of the Society of Neuroscience. 17, 3710-3726 (1997).</li><li>Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysolecithin+induces+demyelination+in+vitro+in+a+cerebellar+slice+culture+system.">Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system.</a> Journal of Neuroscience Research. 78, 157-166 (2004).</li><li>Zhang, H., Jarjour, A. A., Boyd, A., Williams, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+nervous+system+remyelination+in+culture--a+tool+for+multiple+sclerosis+research.">Central nervous system remyelination in culture--a tool for multiple sclerosis research.</a> Experimental Neurology. 230, 138-148 (2011).</li><li>Rasband, M. N., Peles, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nodes+of+Ranvier:+Molecular+Assembly+and+Maintenance.">The Nodes of Ranvier: Molecular Assembly and Maintenance.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8, a020495 (2015).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neurosciences Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Hussain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+and+Nestorone+facilitate+axon+remyelination:+a+role+for+progesterone+receptors.">Progesterone and Nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors.</a> Endocrinology. , 3820-3831 (2011).</li><li>Wioland, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epsilon+toxin+from+Clostridium+perfringens+acts+on+oligodendrocytes+without+forming+pores,+and+causes+demyelination.">Epsilon toxin from Clostridium perfringens acts on oligodendrocytes without forming pores, and causes demyelination.</a> Cellular Microbiology. 17, 369-388 (2015).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).</li><li>Medina-Rodr&#237;guez, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+in+vivo+remyelination+with+small+molecules:+a+neuroreparative+pharmacological+treatment+for+Multiple+Sclerosis.">Promoting in vivo remyelination with small molecules: a neuroreparative pharmacological treatment for Multiple Sclerosis.</a> Science Reports. 7, (2017).</li><li>Spassky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+steps+of+oligodendrogenesis:+insights+from+the+study+of+the+plp+lineage+in+the+brain+of+chicks+and+rodents.">The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents.</a> Developmental Neurosciences. 23, 318-326 (2001).</li><li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+green+fluorescent+protein+in+the+oligodendrocyte+lineage:+a+transgenic+mouse+for+developmental+and+physiological+studies.">Expression of the green fluorescent protein in the oligodendrocyte lineage: a transgenic mouse for developmental and physiological studies.</a> Journal of Neuroscience Research. 70, 529-545 (2002).</li><li>Gibson, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+promotes+oligodendrogenesis+and+adaptive+myelination+in+the+mammalian+brain.">Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain.</a> Science. 344, 1252304 (2014).</li><li>Tomassy, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+profiles+of+myelin+distribution+along+single+axons+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex.">Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Science. 344, 319-324 (2014).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+sensitive+optical+coherence+microscopy+for+brain+imaging.">Polarization sensitive optical coherence microscopy for brain imaging.</a> Optics Letters. 41, 2213-2216 (2016).</li><li>Freudiger, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biomedical+imaging+with+high+sensitivity+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science. 322, 1857-1861 (2008).</li><li>Lim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+Schwann+cell+myelination+by+third+harmonic+generation+microscopy.">Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).</li><li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy.">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).</li><li>Arancibia-Carcamo, I. L., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+node+of+Ranvier+in+CNS+pathology.">The node of Ranvier in CNS pathology.</a> Acta Neuropathologia. (Berlin). 128, 161-175 (2014).</li></ol>

Her vi detalj en protokoll for å generere en ex vivo modell tilsvarer musen lillehjernen organotypic skive kulturer, tilpasset fra tidligere publiserte metoder15,16,19 og påfølgende myelin immunostaining av disse forberedelsene. Denne strategien tilbyr muligheten til å visualisere myelin komponenter med en både sunn og patologiske tilstander.
Lillehjernen organotypic skive kulturer tatt fra 10 da...

Neurons er svært polarisert celler, som omfatter en somato-dendrittiske kupé som mottar inndata fra omgivelsene og en axon som sikrer generasjon og overføring av elektriske impulser til andre celler. Rask overføring og rettidig levering av informasjon er avgjørende for riktig funksjon av nervesystemet. I virveldyr, er det tilrettelagt av myelination, som gir økende axonal ledning hastighet1. Myelin er en spesialisert struktur av komprimerte lag av plasma membran generert av myelinating glia, nemlig oligodendrocytes i sentralnervesystemet (CNS) og Schwann celler i perifere nervesystemet (PNS). Både i CNS og PNS, axoglial vekselsvirkningene kjøre dannelsen av spesialiserte axonal domener: noder av Ranvier og deres omkringliggende domener, paranodes og juxtaparanodes2. Axonal segmentene isolert av myelin, eller internodes, alternativ med noder av Ranvier, som samsvarer med små unmyelinated domener beriket i spenning-gated natrium kanaler (Nav). Høy konsentrasjon og rask aktivering av Nav kanaler på noder i Ranvier tillate fornyelse av handlingen potensialer, og de isolerende egenskapene av myelin hylser, sikre effektiv og rask saltatory gjennomføring av den nerve impuls langs axon3.
I tillegg til sin rolle i akselererende ledning hastigheten av det nerven impulsen, gir myelinating glia metabolske støtte til axon, bevare integriteten langsiktig og delta i overlevelse4,5. Videre har det blitt klart i de senere årene at myelin dynamisk modulert gjennom livet, således antagelig deltar i regulering og plastisitet av ulike nervesystemet funksjoner. Justeringer av distribusjon, antall, lengde og tykkelse på myelin sheaths langs axons kan dermed representerer en ny måte å fininnstille ulike nettverk6,7,8. Derfor evolusjonære oppkjøpet av myelin er en viktig prosess for sensoriske, motoriske og kognitive funksjoner og forstyrrelsene av samspillet mellom axons og glia er stadig som bidrar til den utviklingsmessige eller ervervet nevrologiske sykdommer9.
Myelin sammensetning har vært preget med den bestemte funksjonen av en høy andel av lipider (70%) sammenlignet med proteiner (30%) i motsetning til andre mobilnettet membraner10. Men i motsetning til myelin lipider er de fleste av myelin proteiner spesifikke for myelin, inkludert myelin basic protein (MBP), proteolipid protein (PLP), 2', 3-sykliske nukleotid 3-fosfodiesterase (CNP), myelin-assosiert glykoprotein (MAG), myelin-oligodendrocyte glykoprotein (MOG), PMP-22 og P010. Ulike histologiske metoder stain myelin finnes basert på komposisjonen lipid, som Luxol rask blå11, Sudan svart B12, Baker syre hematin metoden13, samt sølv flekker14. Likevel, disse er ikke alltid mulig for en tilstrekkelig kontrast og oppløsning til å visualisere personlige fiber. En alternativ tilnærming til oppdage myelin er gjennom immunohistochemistry rettet mot myelin proteiner. Ulike antistoffer målrette myelin-spesifikke antigener med en høy spesifisitet og kan brukes rutinemessig å oppdage myelinated strukturer. Antistoff-antigen samspillet kan bli ytterligere avdekket ved hjelp av en sekundær antistoff koplet til en fluorophore rettet mot primære antistoffer og visualisert med tilstrekkelig fluorescens mikroskopi. Her beskriver vi en talipes protokoll til stain myelin på ex vivo lillehjernen skiver, en modell som gir en god bevaring av nervøs vev arkitektur. I tillegg organisasjon og størrelsen på Purkinje celler (eneste myelinated Nevron av lillehjernen) gjøre dem en klassisk modell for elektrofysiologiske studier og egner seg like godt å utføre fast eller live-imaging studier.
Lillehjernen skiver genereres fra P9-P10 mus, gangen tilsvarer tidlig utbruddet av Purkinje celle myelination, en prosess som oppnås hovedsakelig ved en uke ex vivo (6-7 dager i vitro, DIV)15. Videre, denne modellen er tilpasset for å undersøke demyeliniserende lidelser som multippel sklerose (MS), som en omfattende demyelinisering kan bli indusert i lillehjernen skiver ved hjelp av myelinotoxic sammensatte lysophosphatidylcholine (eller lysolecithin, LPC), som etterfølges av en spontan remyelination16,17. Endogene remyelination foregår fra to dager etter LPC fjerning fra kultur medium og er nesten en uke innlegg behandling.
Fullføringen av denne protokollen tar approximatively 3 uker, inkludert en halv dag for lillehjernen skive kulturer forberedelse, en uke å få fullt myelinated skiver, etterfulgt av 2 dager å nå toppen av demyelinisering og en uke i sin helhet remyelination. I tillegg kan immunohistochemistry fullføres i 2 dager. Protokollen beskrevet her er tilpasset en standard søppel av 6 mus pups og må tilpasses om antall dyr som brukes for planlagte eksperimentet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BME medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>41010026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (10X HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14180046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Horse Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;Streptomycin (10.000 IU/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gey&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9779-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose Solution (45%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8769-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysophosphatidylcholine (LPC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L4129-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol (100% ethanol)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>20821.330</td>
			<td>Cooled at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#174; X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>500622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>EuroMEDEX</td>
			<td>ET330-A</td>
			<td>pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>06-896</td>
			<td>Dilution 1/300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AB9348</td>
			<td>Dilution 1/150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>NE1019</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma)</td>
			<td>Gift from Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Dilution 1/5 to 1/10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8809</td>
			<td>Dilution 1/150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34151</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Secondary Antibodies conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue chopper</td>
			<td>McIlwain</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14101-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-straight forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved-fine forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11297-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes (60-mm and 100-mm)</td>
			<td>TPP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-, 6-well culture plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell culture inserts (0,4 &#181;m, 30-mm diameter)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>37&#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-end pipette tips</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>134000CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-bore pipette tips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>2079G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td></td>
			<td>20 or 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filters</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td></td>
			<td>0.22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>RS France</td>
			<td></td>
			<td>76 x 26 x 1.1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>RS France</td>
			<td></td>
			<td>22 x 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Sciences Tissue Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>5511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and immunostaining of myelinating organotypic cerebellar slice cultures

I nervesystemet er myelin et kompleks membran generert av myelinating glial celler, som ensheathes axons og muliggjør rask Elektrisk ledning. Myelin endring har vist oppstår i ulike nevrologiske sykdommer, hvor det er forbundet med funksjonell underskudd. Her gir vi en detaljert beskrivelse av en ex vivo modell består av musen organotypic lillehjernen skiver, som kan vedlikeholdes i kultur for flere uker og ytterligere merkes for å visualisere myelin.

Eksempler på representant myelin immunostainings i organotypic lillehjernen skiver innhentet fra P9-P10 C57black6 vill-type (WT) (figur 2A), samt PLP-GFP transgene mus (figur 2B), sammen med Purkinje celler flekker. Lillehjernen skiver myelinate fra hvit saken sporer regionen skiver mot periferien av folia og myelination av Purkinje celler er stort sett oppnådd etter 6 til 7 DIV. 7 DIV er induksjon av en full demyelinisering mu...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures at JoVE.com

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Forberedelse og immunostai-Myelinating Organotypic lillehjernen skive kulturer

Her presenterer vi en metode for å forberede organotypic skive kulturer fra musen lillehjernen og myelin-skjeden farging av immunhistokjemi egnet for å undersøke mekanismer for myelination og remyelination i det sentrale nervesystemet.

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Denne metoden gjør det mulig å studere den grunnleggende mekanismen for myelinasjon og remyelinasjon på cellulært og tissulært nivå. Denne teknikken er i krysningen mellom primære kulturer og in vivo tilnærminger. Det er en rask og tilgjengelig modell med den største fordelen av å bevare vevarkitekturen.Å demonstrere prosedyren vil være Melina Thetiot, en postdoktor og Remi Ronzano, en ph.d.-student fra laboratoriet mitt. For å begynne, sett en liten saks forsiktig inn i foramen magnum og kutt skallen ved å gjøre et lateralt snitt mot siden, og kutt deretter rundt hodeskallen. For å hente den dorsale delen av skallen, bruk en fin, rett tang for å forsiktig løfte den dorsale delen av skallen.Deretter introduserer du forsiktig tangene mellom ventral skallen og hjernen. Vend forsiktig ut hjernen og kutt optiske og trigeminusnerver med liten saks. Deretter snur du hodet eller den dorsale delen av skallen opp ned like over en 60 millimeter cellekulturrett som inneholder iskaldt disseksjonsmedium for å hjelpe hjernen til å falle av tyngdekraften.Ved hjelp av fine tang, orienter hjernen med dorsalsiden vendt opp og ventral side liggende ned. Under det kikkertmikroskopet bruker du de fine, rette tangene til å immobilisere hjernen på forhjernssiden. Deretter skiller bakhjernen fra resten av hjernen.Klipp lillehjernen peduncles under lillehjernen for å skille lillehjernen fra resten av bakhjernen. Når lillehjernen er isolert, bruk fine, rette tang for å forsiktig rive bort meningene. Hold lillehjernen forsiktig med de fine, buede tangene og plasser den med ryggsiden opp på plastplattformen, vinkelrett på helikopterets barberblad.Deretter, med en steril, tynn ende pipette tips festet til en en en milliliter pipette, aspirere enhver tilgang til disseksjon medium rundt lillehjernen. Deretter, med et vevshelikopter, skjær 300 mikrometer tykke saggitale deler av lillehjernen. Deretter legger du til en dråpe disseksjonsmedium på det skivede lillehjernen forsiktig.Deretter, med en bred villsvinpipettespiss festet til den ene milliliterpipetten, aspirerer sakte den skivede lillehjernen og overfører den tilbake til 60 millimeter cellekulturfat som inneholder iskald disseksjonsmedium. Deretter bruker du to fine, rette tang for å skille individuelle skiver. Deretter, med en bred villsvinpipettespiss festet til den ene milliliterpipetten, overfører du opptil fire utvalgte skiver fra vermis, sammen med noen disseksjonsmedium på en kulturinnsats av en seks brønnplate.Fjern eventuell tilgang til disseksjonsmediet rundt skivene ved hjelp av en tynn endepipettespiss. For demyelinasjon fjerner du alle kulturmedium under kulturinnleggene etter seks dager in vitro, og erstatter det med en milliliter per brønn av det forvarmede, friske kulturmediet som inneholder 0,5 mg per milliliter LPC. Inkuber i 15 til 17 timer ved 37 grader Celsius i 5% karbondioksidmiljø.Etter inkubasjon, vask innsatsene ved å plassere dem i en 25 milliliter petriskål som inneholder en milliliter forhåndsoppvarmet kulturmedium. Deretter overfører du umiddelbart kulturinnsatsene i en ny, seks brønnplate, som inneholder friskt, forvarmet kulturmedium. For å begynne immunohistochemistry, bruk først tang til å løfte kulturinnlegg og fjerne kulturmediet under dem.Deretter legger du til to milliliter med 4% PFA i 1x PBS, ph 7.4, på membranen setter inn for å fikse lillehjernen skiver. Etter 30 minutter vask skivene tre ganger med to milliliter 1x PBS i 10 minutter hver vask. Deretter, under kikkertmikroskopet, ved hjelp av en 25x til 30x forstørrelse, bruk en skalpell eller en børste for å forsiktig løsne skivene fra membranen setter inn.Deretter bruker du en børste til å overføre de flytende skivene til brønnene på en firebrønnplate, som inneholder 1x PBS for å begrense antistoffforbruket. Deretter aspirerer PBS fra hver brønn og inkubere skivene i forhåndskjølt 100% etanol ved minus 20 grader Celsius i 15 til 20 minutter. Etter inkubasjon, aspirere 100% etanol og vask skivene kort med 1x PBS.Vask dem deretter to ganger ved romtemperatur med 1x PBS i 10 minutter hver vask. Hvis du vil blokkere ikke-spesifikke antistofffikseringssteder, aspirerer du PBS og inkuberer skivene i en løsning som inneholder 1x PBS, 5 % NGS og 0,3 % ikke-ionisk vaskemiddel ved romtemperatur i 30 til 45 minutter. Deretter legger du til primære antistoffer fortynnet i blokkeringsløsningen og inkubere skivene ved fire grader Celsius over natten.Etter inkubasjon over natten vask skivene tre ganger med 1x PBS i 10 minutter hver vask. Tilsett deretter de sekundære antistoffene, fortynnet i blokkeringsløsningen, ved ett til 500 fortynningsforhold og inkubere skivene ved romtemperatur i mørket i tre timer. Etter inkubasjon med det sekundære antistoffet, vask skivene tre ganger i 1x PBS i mørket i 10 minutter hver vask.Deretter, under et kikkert mikroskop, plasserer du 100 mikroletere med 1x PBS på lysbildet og med en børste overfører skivene inn i PBS og flater dem på lysbildet. Fjern eventuell tilgang til PBS. Til slutt legger du en dråpe monteringsmedium direkte på glassdekselet og dekker forsiktig skivene.Myelin immunstainings i organotypiske cerebellar skiver, hentet fra post natal dager 9 til 10 C57 svart seks vill type mus ble observert ved 11 dager in vitro med noder av ronviae beriket i spenning gated natriumkanaler, flankert av paranodal axoglial junction domene. De samme resultatene ble observert for PLP-GFP transgene mus. Myelinasjon av parkengy cellene oppnås for det meste etter en uke i kultur.LPC-behandling avmyeminerer helt skivene, som remyelinate spontant og er fullt myelinert seks dager etter demyelinasjon. Denne prosedyren bør ta maksimalt 25 minutter. Det er virkelig det mest kritiske punktet.Organotypisk skivekultur er egnet for levende bildebehandlingsstudie av myelinasjonsdynamikk. Den kan også brukes til å målrette narkotika screening eksperimenter. Denne teknikken gir en enkel, kvantitativ tilnærming til å studere myelinasjon og remyelineringsprosesser.Eksperimenterere skal følge de grunnleggende sikkerhetsprosedyrene som gjelder for dyrevelferd, overdreven og skarp myelinasjon.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice kulturer av embryonale Ventral midthjernen: Et system for å Study dopaminerge neuronal Development In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Organotypic skive kulturer til å studere oligodendrocyte Dynamics og myelinisering

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Analysen av Neurokar ombygging i Entorhino-hippocampus organotypic skive kulturer

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...