Name: preparation and immunostaining of myelinating organotypic cerebellar slice cultures
Uploaded: 2019-03-20T14:00:00
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Agradecemos o Dr. Sean Freeman, Dr. Nathalie Sol-Foulon e Dr. Thomas Roux por valiosos comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo INSERM, ICM, ARSEP subsídios R13123DD, R17127DD ANR (a D.C.) e comunhão FRM, SPF20110421435 (a A.D.), FDT20170437332 (para M.T.). Agradecemos a estrutura de cultura de células CELIS e o icm. Plataforma de imagem Quant.

Todos os trabalhos que envolvam animais respeitadas condições institucionais e orientações estabelecidas pela UPMC, INSERM e o francês e Europeu directiva comunitária 86/609/CEE.
1. preparação do meio de cultura e cultura insere (hands-on tempo ≈ 10 – 15 min)
Nota: Execute esta etapa em uma capa de cultura de fluxo sob condições estéreis
<ol><li>Prepare-se 40 mL do meio de cultura, que consiste em 50% BME, equilibrada solução 25% ...

<ol>
	<li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+Plasticity+and+Nervous+System+Function.">Myelin Plasticity and Nervous System Function.</a> Annual Review Neuroscience. 41, 61-76 (2018).</li><li>Desmazi&#232;res, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+at+the+nodal+and+perinodal+axonal+domains:+a+basis+for+multiple+sclerosis+pathology.">Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple sclerosis pathology.</a> Multiple Sclerosis Houndmills Basingstoke England. 18, 133-137 (2012).</li><li>Waxman, S. G., Ritchie, J. 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J., Redmond, S. A., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+myelination:+implications+for+mechanisms+of+neural+plasticity.">Remodeling myelination: implications for mechanisms of neural plasticity.</a> Nature Neurosciences. 19, 190-197 (2016).</li><li>Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mechanism+of+nervous+system+plasticity:+activity-dependent+myelination.">A new mechanism of nervous system plasticity: activity-dependent myelination.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16, 756-767 (2015).</li><li>Nave, K. -. A., Werner, H. 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A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+and+support+of+axonal+integrity+by+glia.">Myelination and support of axonal integrity by glia.</a> Nature. 468, 244-252 (2010).</li><li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiological Reviews. 81, 871-927 (2001).</li><li>Kluver, H., Barrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+combined+staining+of+cells+and+fibers+in+the+nervous+system.">A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 12, 400-403 (1953).</li><li>Meier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+observations+on+early+myelination+in+the+human+spinal+cord.+Light+and+electron+microscope+study.">Some observations on early myelination in the human spinal cord. Light and electron microscope study.</a> Brain Research. 104, 21-32 (1976).</li><li>Hori, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SIMPLIFIED+ACID+HEMATEIN+TEST+FOR+PHOSPHOLIPIDS.">A SIMPLIFIED ACID HEMATEIN TEST FOR PHOSPHOLIPIDS.</a> Stain Technology. 38, 221-225 (1963).</li><li>Gallyas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+myelin+by+means+of+physical+development.">Silver staining of myelin by means of physical development.</a> Neurological Research. 1, 203-209 (1979).</li><li>Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje+cell+survival+and+axonal+regeneration+are+age+dependent:+an+in+vitro+study.">Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study.</a> Journal of Neuroscience An Official Journal of the Society of Neuroscience. 17, 3710-3726 (1997).</li><li>Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysolecithin+induces+demyelination+in+vitro+in+a+cerebellar+slice+culture+system.">Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system.</a> Journal of Neuroscience Research. 78, 157-166 (2004).</li><li>Zhang, H., Jarjour, A. A., Boyd, A., Williams, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+nervous+system+remyelination+in+culture--a+tool+for+multiple+sclerosis+research.">Central nervous system remyelination in culture--a tool for multiple sclerosis research.</a> Experimental Neurology. 230, 138-148 (2011).</li><li>Rasband, M. N., Peles, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nodes+of+Ranvier:+Molecular+Assembly+and+Maintenance.">The Nodes of Ranvier: Molecular Assembly and Maintenance.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8, a020495 (2015).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. 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G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).</li><li>Medina-Rodr&#237;guez, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+in+vivo+remyelination+with+small+molecules:+a+neuroreparative+pharmacological+treatment+for+Multiple+Sclerosis.">Promoting in vivo remyelination with small molecules: a neuroreparative pharmacological treatment for Multiple Sclerosis.</a> Science Reports. 7, (2017).</li><li>Spassky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+steps+of+oligodendrogenesis:+insights+from+the+study+of+the+plp+lineage+in+the+brain+of+chicks+and+rodents.">The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents.</a> Developmental Neurosciences. 23, 318-326 (2001).</li><li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+green+fluorescent+protein+in+the+oligodendrocyte+lineage:+a+transgenic+mouse+for+developmental+and+physiological+studies.">Expression of the green fluorescent protein in the oligodendrocyte lineage: a transgenic mouse for developmental and physiological studies.</a> Journal of Neuroscience Research. 70, 529-545 (2002).</li><li>Gibson, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+promotes+oligodendrogenesis+and+adaptive+myelination+in+the+mammalian+brain.">Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain.</a> Science. 344, 1252304 (2014).</li><li>Tomassy, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+profiles+of+myelin+distribution+along+single+axons+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex.">Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Science. 344, 319-324 (2014).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+sensitive+optical+coherence+microscopy+for+brain+imaging.">Polarization sensitive optical coherence microscopy for brain imaging.</a> Optics Letters. 41, 2213-2216 (2016).</li><li>Freudiger, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biomedical+imaging+with+high+sensitivity+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science. 322, 1857-1861 (2008).</li><li>Lim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+Schwann+cell+myelination+by+third+harmonic+generation+microscopy.">Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).</li><li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy.">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).</li><li>Arancibia-Carcamo, I. L., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+node+of+Ranvier+in+CNS+pathology.">The node of Ranvier in CNS pathology.</a> Acta Neuropathologia. (Berlin). 128, 161-175 (2014).</li></ol>

Aqui, detalhamos um protocolo para gerar um ex vivo modelo correspondente para as culturas de fatia de rato organotypic cerebelar, adaptado de anteriormente métodos publicados15,16,19 e a mielina subsequente immunostaining dessas preparações. Esta estratégia oferece a possibilidade de visualizar os componentes da mielina com uma alta resolução em Estados saudáveis e patológicos.
Organotypic ce...

Os neurônios são células altamente polarizadas, que compõem um compartimento somato-dendríticas que recebe entradas do seu ambiente e um axônio que garante a geração e a propagação de impulsos elétricos para outras células. Propagação rápida e entrega oportuna de informações é essencial para o bom funcionamento do sistema nervoso. Nos vertebrados, isto é facilitado pela mielinização, que permite aumentar a velocidade de condução axonal1. Mielina é uma estrutura especializada, formada por camadas compactadas de membrana de plasma gerada pela microambiental glia, nomeadamente oligodendrócitos no sistema nervoso central (SNC) e células de Schwann no sistema nervoso periférico (SNP). Tanto no SNC e o SNP, interações axoglial conduzir a formação de domínios axonal especializados: os nós de Ranvier e sua envolvente domínios, paranodes e juxtaparanodes2. Os segmentos axonal isolados por mielina, ou entrenós, alternadas com os nós de Ranvier, que correspondem a pequenos domínios amielínicas enriquecidos em canais de sódio voltagem-dependentes (atv). A alta concentração e ativação rápida de canais dev at aos nós de Ranvier permitir a regeneração dos potenciais de ação e em conjunto com as propriedades de isolamento das bainhas de mielina, assegurar a condução eficiente e rápido insulada do impulso nervoso ao longo do axônio3.
Além de seu papel em acelerar a velocidade de condução do impulso nervoso, microambiental glia fornece suporte metabólico para o axônio, preservando sua integridade a longo prazo e participando de sua sobrevivência4,5. Além disso, é evidente em anos recentes que a mielina é modulada dinamicamente ao longo da vida, assim, presumivelmente participando de regulamento e plasticidade das várias funções do sistema nervoso. Ajustes da distribuição, número, comprimento e espessura das bainhas de mielina ao longo do axónio, portanto, podem representar uma nova maneira para ajustar finamente várias redes6,7,8. Portanto, a aquisição evolutiva de mielina é um processo chave para funções sensoriais, motoras e cognitivas e a perturbação da interação entre axônios e glia é cada vez mais considerada como contribuindo para o desenvolvimento ou adquirida neurológica doenças9.
Composição de mielina tem sido caracterizada, com a característica específica de uma elevada percentagem de lípidos (70%) em comparação com as proteínas (30%) em contraste com outras membranas celulares10. No entanto, ao contrário de lipídios de mielina, a maioria das proteínas da mielina é específica para mielina, incluindo a proteína básica da mielina (MBP), proteína proteolipid (PLP), 2', glicoproteína de 3'-fosfodiesterase (CNP), associada a mielina de nucleotídeos 3'-cíclico (MAG), glicoproteína mielina-oligodendrocyte (MOG), PMP-22 e P010. Histológicos existem vários métodos para manchar a mielina com base na sua composição de lipídios, tais como Luxol rápido azul11, Sudão negro B12, Baker hematina ácida método13, bem como prata coloração de14. No entanto, essas abordagens não sempre permite um contraste adequado e resolução para visualizar as fibras individuais. Uma abordagem alternativa para detectar mielina é através de imuno-histoquímica dirigido contra as proteínas da mielina. Vários anticorpos antígenos específicos de mielina de destino com uma alta especificidade e podem ser usados rotineiramente para detectar estruturas mielinizadas. A interação antígeno-anticorpo pode ser revelada ainda mais usar um anticorpo secundário acoplado a um fluoróforo dirigido contra o anticorpo primário e visualizado com microscopia de fluorescência adequada. Aqui, descrevemos um protocolo imunoquímico para manchar a mielina em ex vivo cerebelar fatias, um modelo que permite uma boa preservação da arquitetura do tecido nervoso. Além disso, a organização e o tamanho das células de Purkinje (o único neurônio mielinizada do cerebelo) torná-los um modelo clássico para Estudos eletrofisiológicos e eles são da mesma forma ideais para realizar estudos fixos ou imagens ao vivo.
As fatias Cerebelares são geradas a partir de ratos P9-P10, um tempo correspondente do início da célula de Purkinje mielinização, um processo que é principalmente alcançado por uma semana ex vivo (6-7 dias in-vitro, DIV)15. Além disso, este modelo é adaptado para investigar distúrbios desmielinizantes como esclerose múltipla (MS), como uma desmielinização extensa pode ser induzida em fatias Cerebelares usando o myelinotoxic composto lysophosphatidylcholine (ou lysolecithin, LPC), Qual é seguida por um espontâneo como16,17. Como endógeno ocorre dois dias após a remoção de LPC, meio de cultura e é quase completo de um tratamento de post da semana.
A conclusão do presente protocolo leva cerca de 3 semanas, incluindo a metade de um dia para a preparação de culturas cerebelar fatia, uma semana para obter fatias totalmente mielinizadas, seguidas por 2 dias para atingir o pico de desmielinização e mais uma semana para seu pleno mielinogênese. Além disso, a imuno-histoquímica pode ser concluído em 2 dias. O protocolo descrito aqui é adaptado um padrão ninhada de 6 filhotes de ratos e precisa ser adaptado em relação ao número de animais utilizados para o experimento planejado.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BME medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>41010026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (10X HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14180046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Horse Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;Streptomycin (10.000 IU/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gey&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9779-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose Solution (45%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8769-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysophosphatidylcholine (LPC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L4129-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol (100% ethanol)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>20821.330</td>
			<td>Cooled at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#174; X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>500622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>EuroMEDEX</td>
			<td>ET330-A</td>
			<td>pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>06-896</td>
			<td>Dilution 1/300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AB9348</td>
			<td>Dilution 1/150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>NE1019</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma)</td>
			<td>Gift from Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Dilution 1/5 to 1/10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8809</td>
			<td>Dilution 1/150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34151</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Secondary Antibodies conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue chopper</td>
			<td>McIlwain</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14101-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-straight forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved-fine forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11297-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes (60-mm and 100-mm)</td>
			<td>TPP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-, 6-well culture plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell culture inserts (0,4 &#181;m, 30-mm diameter)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>37&#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-end pipette tips</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>134000CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-bore pipette tips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>2079G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td></td>
			<td>20 or 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filters</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td></td>
			<td>0.22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>RS France</td>
			<td></td>
			<td>76 x 26 x 1.1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>RS France</td>
			<td></td>
			<td>22 x 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Sciences Tissue Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>5511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and immunostaining of myelinating organotypic cerebellar slice cultures

No sistema nervoso, mielina é uma estrutura complexa membrana gerada pela microambiental glial cells, que ensheathes de axônios e facilita a condução elétrica rápido. Alteração da mielina foi mostrada para ocorrer em várias doenças neurológicas, onde é associado com déficits funcionais. Aqui, nós fornecemos uma descrição detalhada de um ex vivo modelo consiste em fatias cerebelar organotypic do mouse, que podem ser mantidas em cultura por várias semanas e ainda mais ser rotulado para visualizar a mielina.

Exemplos de mielina representante immunostainings em organotypic cerebelar fatias obtidas P9 P10 C57black6 tipo selvagem (WT) (Figura 2A), bem como ratos transgénicos PLP-GFP (Figura 2B), juntamente com células de Purkinje coloração. Myelinate de substância branca Cerebelares fatias faixas região das fatias em direção a periferia da folia e mielinização das células de Purkinje é principalmente alcançada depois de 6 a...

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Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Preparação e imunocoloração de culturas de fatia cerebelar microambiental Organotypic

Aqui nós apresentamos um método para preparar organotypic fatia de culturas de cerebelo de rato e bainha de mielina coloração por IHQ apropriado para investigar mecanismos de mielinização e como no sistema nervoso central.

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Este método permite estudar o mecanismo básico da mielinação e remyelinação no nível celular e tissular. Esta técnica está na encruzilhada entre culturas primárias e abordagens in vivo. É um modelo rápido e acessível com a principal vantagem de preservar a arquitetura tecidual.Demonstrando o procedimento estarão Melina Thetiot, pesquisadora de pós-doutorado e Remi Ronzano, doutoranda do meu laboratório. Para começar, insira uma pequena tesoura suavemente no foie magnum e corte o crânio fazendo uma incisão lateral em direção ao lado, e depois corte tudo ao redor do crânio da cabeça. Para recuperar a parte dorsal do crânio, use um fórceps fino e reto para levantar cuidadosamente a parte dorsal do crânio.Em seguida, introduza cuidadosamente os fórceps entre o crânio ventral e o cérebro. Gentilmente solte o cérebro e corte os nervos ópticos e trigêmeos com uma tesoura pequena. Em seguida, vire a cabeça ou a parte dorsal do crânio de cabeça para baixo um pouco acima de um prato de cultura celular de 60 milímetros contendo meio de dissecção gelada para ajudar o cérebro a cair pela gravidade.Usando fórceps finos, oriente o cérebro com o lado dorsal voltado para cima e o lado ventral deitado. Sob o microscópio binóculo, use as fórceps retas para imobilizar o cérebro no lado do cérebro. Então, separe o cérebro traseiro do resto do cérebro.Corte os peduncles cerebelares sob o cerebelo para separar o cerebelo do resto do cérebro traseiro. Uma vez que o cerebelo esteja isolado, use fórceps finos e retos para arrancar cuidadosamente as meninges. Segure o cerebelo suavemente com as fórceps finas e curvas e coloque-o com o lado dorsal sobre a plataforma de plástico, perpendicularmente à lâmina de barbear do helicóptero.Em seguida, com uma ponta de pipeta estéril e fina presa a uma pipeta de um mililitro, aspire qualquer acesso de meio de dissecção ao redor do cerebelo. Em seguida, com um helicóptero de tecido, corte 300 micrômetros de seções sagita grossas do cerebelo. Em seguida, adicione uma gota de meio de dissecção no cerebelo fatiado suavemente.Em seguida, com uma ponta de pipeta de javali larga presa à pipeta de um mililitro, aspira lentamente o cerebelo fatiado e transfira-o de volta para o prato de cultura celular de 60 milímetros contendo meio de dissecção gelada. Em seguida, use dois fórceps finos e retos para separar fatias individuais. Em seguida, com uma ponta de pipeta de javali larga presa à pipeta de um mililitro, transfira até quatro fatias selecionadas dos vermis, juntamente com algum meio de dissecção em uma inserção de cultura de uma placa de seis poços.Remova qualquer acesso do meio de dissecção ao redor das fatias usando uma ponta de pipeta fina. Para desmielinização, remova todo o meio de cultura abaixo das pastilhas de cultura após seis dias in vitro, e substitua-o por um mililitro por poço do meio de cultura pré-aquecido e fresco contendo 0,5 miligramas por mililitro LPC. Incubar por 15 a 17 horas a 37 graus Celsius em ambiente de 5% de dióxido de carbono.Após a incubação, lave as pastilhas colocando-as em uma placa de Petri de 25 mililitros contendo um mililitro de meio de cultura pré-aquecido. Em seguida, transfira imediatamente as pastilhas de cultura em uma nova placa de seis poços, contendo meio de cultura fresco e pré-aquecido. Para começar a imunohistoquímica, primeiro use fórceps para levantar pastilhas culturais e remover o meio de cultura abaixo deles.Em seguida, adicione dois mililitros de 4%PFA em 1x PBS, ph 7.4, nas pastilhas de membrana para fixar as fatias cerebelares. Após 30 minutos, lave as fatias três vezes com dois mililitros de 1x PBS por 10 minutos cada lavagem. Em seguida, sob o microscópio binóculo, usando uma ampliação de 25x a 30x, use um bisturi ou um pincel para separar suavemente as fatias das pastilhas de membrana.Em seguida, use um pincel para transferir as fatias flutuantes para os poços de uma placa de quatro poços, contendo 1x PBS para limitar o consumo de anticorpos. Em seguida, aspire o PBS de cada poço e incuba as fatias em 100% de etanol pré-resfriado a menos 20 graus Celsius por 15 a 20 minutos. Após a incubação, aspire o etanol 100% e lave as fatias brevemente com 1x PBS.Em seguida, lave-os duas vezes à temperatura ambiente com 1x PBS por 10 minutos cada lavagem. Para bloquear locais de fixação de anticorpos não específicos, aspire o PBS e incuba as fatias em uma solução contendo 1x PBS, 5%NGS e detergente não iônico de 0,3% à temperatura ambiente por 30 a 45 minutos. Em seguida, adicione anticorpos primários diluídos na solução de bloqueio e incubar as fatias a quatro graus Celsius durante a noite.Após a incubação durante a noite, lave as fatias três vezes com 1x PBS por 10 minutos cada lavagem. Em seguida, adicione os anticorpos secundários, diluídos na solução de bloqueio, em uma proporção de diluição de 500 e incubar as fatias à temperatura ambiente no escuro por três horas. Após a incubação com o anticorpo secundário, lave as fatias três vezes em 1x PBS no escuro por 10 minutos cada lavagem.Em seguida, sob um microscópio binóculo, coloque 100 microletadores de 1x PBS no slide e com um pincel, transfira as fatias para o PBS e achate-as no slide. Remova qualquer acesso do PBS. Por fim, coloque uma gota de meio de montagem diretamente sobre o deslizamento da tampa de vidro e cubra delicadamente as fatias.Imunostainings de mielina em fatias organotípicas cerebelares, obtidas nos dias de pós-natal 9 a 10 C57 preto seis camundongos do tipo selvagem foram observados em 11 dias in vitro com nós de ronviae enriquecidos em canais de sódio fechados de tensão, ladeados pelo domínio de junção axoglial paranodal. Os mesmos resultados foram observados para camundongos transgênicos PLP-GFP. A mielinação das células parkengy é alcançada principalmente após uma semana na cultura.O tratamento LPC desmyelinas totalmente as fatias, que remyelinate espontaneamente e são totalmente mielinados seis dias após a demyelinação. Este procedimento deve levar 25 minutos no máximo. É realmente o ponto mais crítico.A cultura de fatias organotípicas são adequadas para o estudo de imagem ao vivo da dinâmica da mielinação. Também pode ser usado para direcionar experimentos de triagem de drogas. Esta técnica permite uma abordagem fácil e quantitativa para estudar os processos de mielinação e remyelinação.Os experimentadores devem seguir os procedimentos básicos de segurança aplicados ao bem-estar animal, mielinização excessiva e afiada.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

O modelo de Cultura organotípicas Hippocampal Slice para o exame das lesões neuronais

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Neurociência

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

Preparação fatia, cultura de tecidos organotípicas e Gravação luciferase de Atividade Gene Relógio no núcleo supraquiasmático

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Organotípicas Hippocampal Culturas Slice

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotípicas Culturas Cerebelar: Desafios Apoptotic e Detecção

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

Gravação de células inteiras a partir de uma preparação Slice organotípicas de Neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Derivação de Enriquecido Culturas oligodendroglial e Neuron / oligodendroglial Myelinating Co-culturas de tecidos pós-natais murino

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotípicas culturas de mesencéfalo ventral Slice Embrionárias: Um Sistema para o Estudo de Desenvolvimento Neuronal dopaminérgicos In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

A Análise de Purkinje Morfologia de células dendríticas em Culturas fatia organotípicas

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Culturas Organotípicas fatia para Estudar Oligodendrocyte Dynamics e Myelination

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

A Análise de Neurovascular Remodelação em Entorhino-hipocampal culturas Organotípicas Fatia

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...