Name: preparation and immunostaining of myelinating organotypic cerebellar slice cultures
Uploaded: 2019-03-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures at JoVE.com

Мы благодарим д-р Шон Фриман, д -р Натали соль-Фулон и д-р Томас Ру за ценные замечания по рукописи. Эта работа финансировалась INSERM, ICM, ARSEP грантов R13123DD, НРУ R17127DD (до н.э.) и FRM стипендий, SPF20110421435 (до н.э.), FDT20170437332 (для м.т.). Мы благодарим фонд культуры клеток СЕЛИС и icm. Платформа Квант.

Все работы с участием животных выполнены с институциональной политикой и руководящими принципами, установленными UPMC, INSERM и французский и директивы Совета Европейского сообщества 86/609/ЕЕС.
1. Подготовка питательной среды и культуры вставляет (практический время ≈ 10-15 мин)</...

<ol>
	<li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+Plasticity+and+Nervous+System+Function.">Myelin Plasticity and Nervous System Function.</a> Annual Review Neuroscience. 41, 61-76 (2018).</li><li>Desmazi&#232;res, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+at+the+nodal+and+perinodal+axonal+domains:+a+basis+for+multiple+sclerosis+pathology.">Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple sclerosis pathology.</a> Multiple Sclerosis Houndmills Basingstoke England. 18, 133-137 (2012).</li><li>Waxman, S. G., Ritchie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+the+myelinated+axon.">Molecular dissection of the myelinated axon.</a> Annals of Neurology. 33, 121-136 (1993).</li><li>F&#252;nfschilling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolytic+oligodendrocytes+maintain+myelin+and+long-term+axonal+integrity.">Glycolytic oligodendrocytes maintain myelin and long-term axonal integrity.</a> Nature. 485, 517-521 (2012).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroglia+metabolically+support+axons+and+contribute+to+neurodegeneration.">Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration.</a> Nature. 487, 443-448 (2012).</li><li>Chang, K. -. J., Redmond, S. A., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+myelination:+implications+for+mechanisms+of+neural+plasticity.">Remodeling myelination: implications for mechanisms of neural plasticity.</a> Nature Neurosciences. 19, 190-197 (2016).</li><li>Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mechanism+of+nervous+system+plasticity:+activity-dependent+myelination.">A new mechanism of nervous system plasticity: activity-dependent myelination.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16, 756-767 (2015).</li><li>Nave, K. -. A., Werner, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+of+the+nervous+system:+mechanisms+and+functions.">Myelination of the nervous system: mechanisms and functions.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 503-533 (2014).</li><li>Nave, K. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+and+support+of+axonal+integrity+by+glia.">Myelination and support of axonal integrity by glia.</a> Nature. 468, 244-252 (2010).</li><li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiological Reviews. 81, 871-927 (2001).</li><li>Kluver, H., Barrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+combined+staining+of+cells+and+fibers+in+the+nervous+system.">A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 12, 400-403 (1953).</li><li>Meier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+observations+on+early+myelination+in+the+human+spinal+cord.+Light+and+electron+microscope+study.">Some observations on early myelination in the human spinal cord. Light and electron microscope study.</a> Brain Research. 104, 21-32 (1976).</li><li>Hori, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SIMPLIFIED+ACID+HEMATEIN+TEST+FOR+PHOSPHOLIPIDS.">A SIMPLIFIED ACID HEMATEIN TEST FOR PHOSPHOLIPIDS.</a> Stain Technology. 38, 221-225 (1963).</li><li>Gallyas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+myelin+by+means+of+physical+development.">Silver staining of myelin by means of physical development.</a> Neurological Research. 1, 203-209 (1979).</li><li>Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje+cell+survival+and+axonal+regeneration+are+age+dependent:+an+in+vitro+study.">Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study.</a> Journal of Neuroscience An Official Journal of the Society of Neuroscience. 17, 3710-3726 (1997).</li><li>Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysolecithin+induces+demyelination+in+vitro+in+a+cerebellar+slice+culture+system.">Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system.</a> Journal of Neuroscience Research. 78, 157-166 (2004).</li><li>Zhang, H., Jarjour, A. A., Boyd, A., Williams, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+nervous+system+remyelination+in+culture--a+tool+for+multiple+sclerosis+research.">Central nervous system remyelination in culture--a tool for multiple sclerosis research.</a> Experimental Neurology. 230, 138-148 (2011).</li><li>Rasband, M. N., Peles, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nodes+of+Ranvier:+Molecular+Assembly+and+Maintenance.">The Nodes of Ranvier: Molecular Assembly and Maintenance.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8, a020495 (2015).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neurosciences Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Hussain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+and+Nestorone+facilitate+axon+remyelination:+a+role+for+progesterone+receptors.">Progesterone and Nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors.</a> Endocrinology. , 3820-3831 (2011).</li><li>Wioland, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epsilon+toxin+from+Clostridium+perfringens+acts+on+oligodendrocytes+without+forming+pores,+and+causes+demyelination.">Epsilon toxin from Clostridium perfringens acts on oligodendrocytes without forming pores, and causes demyelination.</a> Cellular Microbiology. 17, 369-388 (2015).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).</li><li>Medina-Rodr&#237;guez, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+in+vivo+remyelination+with+small+molecules:+a+neuroreparative+pharmacological+treatment+for+Multiple+Sclerosis.">Promoting in vivo remyelination with small molecules: a neuroreparative pharmacological treatment for Multiple Sclerosis.</a> Science Reports. 7, (2017).</li><li>Spassky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+steps+of+oligodendrogenesis:+insights+from+the+study+of+the+plp+lineage+in+the+brain+of+chicks+and+rodents.">The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents.</a> Developmental Neurosciences. 23, 318-326 (2001).</li><li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+green+fluorescent+protein+in+the+oligodendrocyte+lineage:+a+transgenic+mouse+for+developmental+and+physiological+studies.">Expression of the green fluorescent protein in the oligodendrocyte lineage: a transgenic mouse for developmental and physiological studies.</a> Journal of Neuroscience Research. 70, 529-545 (2002).</li><li>Gibson, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+promotes+oligodendrogenesis+and+adaptive+myelination+in+the+mammalian+brain.">Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain.</a> Science. 344, 1252304 (2014).</li><li>Tomassy, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+profiles+of+myelin+distribution+along+single+axons+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex.">Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Science. 344, 319-324 (2014).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+sensitive+optical+coherence+microscopy+for+brain+imaging.">Polarization sensitive optical coherence microscopy for brain imaging.</a> Optics Letters. 41, 2213-2216 (2016).</li><li>Freudiger, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biomedical+imaging+with+high+sensitivity+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science. 322, 1857-1861 (2008).</li><li>Lim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+Schwann+cell+myelination+by+third+harmonic+generation+microscopy.">Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).</li><li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy.">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).</li><li>Arancibia-Carcamo, I. L., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+node+of+Ranvier+in+CNS+pathology.">The node of Ranvier in CNS pathology.</a> Acta Neuropathologia. (Berlin). 128, 161-175 (2014).</li></ol>

Здесь, мы подробно протокол для создания ex vivo модель, соответствующую мыши мозжечковой organotypic срез культур, адаптированных из ранее опубликованные методы15,16,19 и последующих миелина иммуноокрашивания этих препаратов. Эта стратегия пре?...

Нейроны являются крайне поляризованную клетки, которые составляют Сомато дендритных отсек, который получает входы от окружающей его среды и аксон, который обеспечивает генерации и распространения электрических импульсов в другие ячейки. Быстрое распространение и своевременное предоставление информации имеет важное значение для правильного функционирования нервной системы. В позвоночных он способствует миелинизации, что позволяет увеличить аксональное проводимости скорости1. Миелиновые является специализированная структура, образованная уплотненных слоев плазматической мембраны, порожденных myelinating глии, а именно Олигодендроциты в центральной нервной системе (ЦНС) и Шванновские клетки в периферической нервной системы (ПНС). Как в ЦНС и ПНС, axoglial взаимодействия диск формирование специализированных аксональное доменов: Ranvier из узлов и их окружающие доменов, paranodes и juxtaparanodes2. Аксональное сегменты, изолированные миелина, или междоузлий, чередуются с Ranvier на узлы, которые соответствуют малых unmyelinated домены, обогащенный в закрытом напряжения натриевых каналов (Nav). Высокая концентрация и быстрой активации Nav каналов на узлы по Ranvier позволяют регенерации потенциалы действия и вместе с теплоизоляционные свойства миелиновой оболочки, обеспечить проведение эффективных и быстро saltatory нервного импульса вдоль аксона3.
В дополнение к своей роли в ускорении скорости проведения нервного импульса глии myelinating обеспечивает метаболические поддержку Аксон, сохраняя его долгосрочной целостности и участвуя в ее выживание4,5. Кроме того это стало ясно в последние годы, что миелина динамически модулируется на протяжении всей жизни, таким образом, предположительно участвующих в регулирование и пластичности различных функций нервной системы. Корректировки распределения, номер, Длина и толщина миелиновой оболочки вдоль аксоны может таким образом представляют новый способ тонко настраивать различные сети6,,7-8. Таким образом эволюционное приобретение миелина является ключевой процесс для чувств, мотор и когнитивных функций и возмущений взаимодействия между аксонов и глии все чаще рассматривается как вклад развития или приобретенные неврологические болезни9.
Характеризуется состав миелина, с конкретной функцией значительная липидов (70%) по сравнению с белками (30%) в отличие от других клеточных мембран10. Однако в отличие от миелина липиды, большинство белки миелина специфичные для миелина, включая основной белок миелина (MBP), proteolipid белка (ПЛП), 2', 3'-циклических нуклеотидов 3'-фосфодиэстеразы (CNP), связанные миелина гликопротеина (МАГ), миелин Олигодендроциты гликопротеина (мог), PMP-22 и10P0. Основе его состав липидов, например Luxol быстро синий11, Судан черный B12, Бейкер кислоты hematin метод13, а также Серебряный пятнать14существуют различные гистологической методы пятно миелина. Тем не менее эти подходы не всегда позволяют для адекватного контрастность и разрешение для визуализации отдельных волокон. Альтернативный подход для выявления миелина является иммуногистохимия, направленных против белки миелина. Различные антитела целевых миелина специфичные антигены с высокой точностью и может быть использован регулярно для обнаружения Миелинизированные структур. Взаимодействие антител антигена можно далее показал, что с помощью вторичных антител в сочетании с Флюорофор направленных против основного антитела и визуализированы с адекватной флуоресцентной микроскопии. Здесь мы описываем иммунохимических протокол пятно миелина на ex vivo мозжечковой ломтиками, модель, которая позволяет для хорошего сохранения архитектуры нервной ткани. Кроме того Организации и размер клеток Пуркинье (единственным Миелинизированные нейронов мозжечка) делают их классическая модель для электрофизиологических исследований и аналогичным образом они идеальны для выполнения исследований фиксированной или жить изображений.
Мозжечковая фрагменты создаются из P9-P10 мышей, время, соответствующее раннее начало клеток Пуркинье миелинизации, процесс, который достигается в основном на одну неделю ex vivo (6-7 дней в пробирке, DIV)15. Кроме того эта модель адаптирована к расследованию демиелинизирующих расстройств, таких как рассеянный склероз (РС), как обширные демиелинизации может быть наведено в мозжечковой ломтики с использованием комплекса lysophosphatidylcholine myelinotoxic (или lysolecithin, LPC), который сопровождается спонтанное remyelination16,17. Эндогенные remyelination происходит от двух дней после удаления ЛСМ из питательной среды и является почти полной недели после лечения.
Завершение этого протокола занимает около 3 недель, в том числе полдня для подготовки мозжечковой ломтик культур, в неделю, чтобы получить полностью Миелинизированные ломтиками, после 2 дней, чтобы достичь пика демиелинизации и еще одна неделя для их полного remyelination. Кроме того иммуногистохимия может быть завершена в течение 2 дней. Протокол, описанные здесь адаптирована к стандартной помет мышей 6 детенышей и необходимо адаптировать относительно количество животных, используемых для запланированного эксперимента.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BME medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>41010026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (10X HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14180046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Horse Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;Streptomycin (10.000 IU/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gey&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9779-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose Solution (45%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8769-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysophosphatidylcholine (LPC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L4129-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol (100% ethanol)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>20821.330</td>
			<td>Cooled at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#174; X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>500622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>EuroMEDEX</td>
			<td>ET330-A</td>
			<td>pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>06-896</td>
			<td>Dilution 1/300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AB9348</td>
			<td>Dilution 1/150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>NE1019</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma)</td>
			<td>Gift from Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Dilution 1/5 to 1/10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8809</td>
			<td>Dilution 1/150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34151</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Secondary Antibodies conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue chopper</td>
			<td>McIlwain</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14101-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-straight forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved-fine forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11297-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes (60-mm and 100-mm)</td>
			<td>TPP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-, 6-well culture plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell culture inserts (0,4 &#181;m, 30-mm diameter)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>37&#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-end pipette tips</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>134000CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-bore pipette tips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>2079G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td></td>
			<td>20 or 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filters</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td></td>
			<td>0.22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>RS France</td>
			<td></td>
			<td>76 x 26 x 1.1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>RS France</td>
			<td></td>
			<td>22 x 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Sciences Tissue Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>5511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and immunostaining of myelinating organotypic cerebellar slice cultures

В нервной системе миелина является комплекс мембранные структуры, порожденных myelinating глиальных клеток, которые ensheathes аксоны и облегчает быстро электрической проводимости. Было показано, что миелина изменения происходят в различных неврологических заболеваний, где это связано с функциональными недостатками. Здесь, мы предоставляем подробное описание ex vivo модель, состоящая из мыши organotypic мозжечка фрагменты, которые можно сохранить в культуре на несколько недель и далее быть помечены для визуализации миелина.

Примеры immunostainings представитель миелиновый organotypic мозжечка ломтиками, полученные от C57black6 P9-P10 одичал типа (WT) (рисунок 2A), а также ПЛП-GFP трансгенных мышей (рис. 2B), вместе с окрашивания клеток Пуркинье. Мозжечковая ломтики myelinate от белого ве?...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures at JoVE.com

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Подготовка и иммуноокрашивания Myelinating Organotypic мозжечка ломтик культур

Здесь мы представляем метод подготовить organotypic срез культур от мыши мозжечка и миелиновой оболочкой, окрашивание, иммуногистохимия подходит для изучения механизмов миелинизации и remyelination в центральной нервной системе.

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Этот метод позволяет изучить основной механизм миелинизации и ремиелинизации на клеточном и тискулярном уровне. Этот метод находится на перекрестке между основными культурами и подходами in vivo. Это быстрая и доступная модель с основным преимуществом сохранения архитектуры тканей.Демонстрация процедуры будет Мелина Thetiot, постдокторант исследователь и Реми Ronzano, аспирант из моей лаборатории. Для начала вставьте маленькие ножницы осторожно в foramen magnum и вырезать череп, сделав один боковой разрез в сторону, а затем вырезать все вокруг черепа головы. Для извлечения спинной части черепа используйте тонкие прямые типсы, чтобы аккуратно поднять спинную часть черепа.Затем осторожно ввести миппы между брюшной череп и мозг. Аккуратно переверните мозг и вырежьте зрительные и тригеминальные нервы маленькими ножницами. Затем поверните голову или спинную часть черепа вверх дном чуть выше 60-миллиметровой клеточной культуры блюдо, содержащее ледяное вскрытие среды, чтобы помочь мозгу упасть под действием силы тяжести.Используя тонкие миппы, сориентировать мозг с спинной стороны лицом вверх и брюшной стороны лежа. Под бинокулярным микроскопом используйте тонкие прямые типсы для обездвиживания мозга на стороне forebrain. Затем отделите задний мозг от остальной части мозга.Вырезать мозжечковые педункулы под мозжечок, чтобы отделить мозжечок от остальной части заднего мозга. После того, как мозжечок изолирован, используйте тонкие, прямые миппы, чтобы тщательно оторвать око. Держите мозжечок осторожно с тонкой, изогнутые типсы и поместите его с спинной стороной вверх на пластиковую платформу, перпендикулярно измельчитель лезвие бритвы.Далее, с стерильным, тонким кончиком пипетки конца прилагается к одноми миллилитров пипетки, аспирировать любой доступ вскрытия среды вокруг мозжечка. Затем, с помощью вертолета ткани, нарежьте 300 микрометров толщиной сагитальных секций мозжечка. Затем аккуратно добавьте каплю среды вскрытия на нарезанный мозжечок.Затем, с широким кончиком пипетки кабана прилагается к одной миллилитр пипетки, медленно аспирировать нарезанный мозжечок и передать его обратно в 60 миллиметров клеточной культуры блюдо, содержащее ледяной вскрытия среды. Затем используйте два тонких прямых типса для отдельных ломтиков. Затем, с широким кончиком пипетки кабана, прикрепленным к одноми миллилитровой пипетке, перенесите до четырех выбранных ломтиков из вермы, а также некоторые средства вскрытия на одну культурную вставку из шести хорошо пластины.Удалите любой доступ к среде вскрытия вокруг ломтиков, используя тонкий кончик пипетки конца. Для демиелинизации удалите всю культурную среду ниже культуры, вставьте через шесть дней в пробирке, и замените ее на один миллилитр на колодец предварительно разогретой свежей культуры среды, содержащей 0,5 миллиграмма на миллилитр LPC. Инкубировать в течение 15 до 17 часов при 37 градусах по Цельсию в 5%углекислого газа окружающей среды.После инкубации, мыть вставки, поместив их в 25 миллилитров Петри блюдо, содержащее один миллилитр предварительно разогретой среды культуры. Затем немедленно перенесите культурные вставки в новую, шесть хорошо пластин, содержащих свежие, предварительно разогретые среды культуры. Чтобы начать иммуногистохимию, сначала используйте forceы, чтобы поднять культурные вставки и удалить культурную среду под ними.Затем добавьте два миллилитров 4%PFA в 1x PBS, ph 7.4, на мембранные вставки, чтобы исправить мозжечковые ломтики. Через 30 минут, мыть ломтики три раза с двумя миллилитров 1x PBS в течение 10 минут каждый мыть. Затем, под бинокулярным микроскопом, используя увеличение от 25x до 30x, используйте скальпель или кисть, чтобы аккуратно отделить ломтики от мембранных вставок.Затем используйте кисть для передачи плавающих ломтиков в колодцы четырех скважин пластины, содержащей 1x PBS, чтобы ограничить потребление антител. Затем, аспирировать PBS из каждой хорошо и инкубировать ломтики в предварительно охлажденных 100% этанола при температуре минус 20 градусов по Цельсию в течение 15 до 20 минут. После инкубации, аспирировать 100% этанола и мыть ломтики кратко с 1x PBS.Затем мыть их два раза при комнатной температуре с 1x PBS в течение 10 минут каждый мыть. Чтобы блокировать неспецифические сайты фиксации антител, аспирировать PBS и инкубировать ломтики в растворе, содержащем 1x PBS, 5%NGS, и 0.3%non ионные моющие средства при комнатной температуре в течение 30 до 45 минут. Затем добавьте первичные антитела, разбавленные блокирующим раствором, и инкубировать ломтики при четырех градусах Цельсия за одну ночь.После ночной инкубации, мыть ломтики три раза с 1x PBS в течение 10 минут каждый мыть. Затем добавьте вторичные антитела, разбавленные блокирующим раствором, при соотношении разбавления от одного до 500 и инкубировать ломтики при комнатной температуре в темноте в течение трех часов. После инкубации со вторичным антителом, мыть ломтики три раза в 1x PBS в темноте в течение 10 минут каждый мыть.Затем, под бинокулярным микроскопом, поместите 100 микролетеров 1x PBS на слайд и кистью, перенесите ломтики в PBS и сгладите их на слайде. Удалите любой доступ PBS. Наконец, поместите каплю монтажной среды прямо на стеклянную крышку скольжения и аккуратно покрыть ломтиками.Миелин иммуностимуляторов в органотипных мозжечковых ломтиков, полученных от пост натальных дней 9 до 10 C57 черный шесть диких мышей типа наблюдались в 11 дней в пробирке с узлами ronviae обогащенных в напряжении закрытых каналов натрия, в окружении паранодального аксонального соединения домена. Те же результаты наблюдались у трансгенных мышей PLP-GFP. Миелинизация паркенги клеток в основном достигается после одной недели в культуре.LPC лечение полностью демиелинат ломтики, которые ремиелинат спонтанно и полностью миелинов шесть дней после демиелинизации. Эта процедура должна занять максимум 25 минут. Это действительно самый критический момент.Органотипическая культура ломтика подходит для живого изучения динамики миелинизации. Он также может быть использован для ориентации экспериментов скрининга наркотиков. Этот метод позволяет легко, количественный подход для изучения процессов миелинизации и ремиелинизации.Экспериментаторы должны следовать основным процедурам безопасности, применяемым к благополучию животных, чрезмерной и резкой миелинизации.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Органотипической гиппокампа Модель культуры фрагмент за рассмотрение нейронов травмы

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

Подготовка фрагментов, органотипической культивирования тканей и люциферазы Запись часы активность генов в супрахиазматическое ядро

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Органотипической гиппокампа культур фрагмент

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Органотипической мозжечка культур: проблемы и апоптоза Обнаружение

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

Всего Запись сотовый от органотипической Подготовка Кусочек Неокортекс

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Вывод Обогащенный олигодендроцитов культур и олигодендроцитов / Нейрон Myelinating сотрудничества культур от Послеродовые мышей тканей

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Органотипической культур Кусочек Эмбриональные Брюшной мозга: системы по изучению дофаминергической нейронов развития В пробирке</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Анализ Пуркинье морфологии дендритных клеток в органотипической культур Slice

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Органотипической срез культуры для изучения олигодендроцит Динамика и миелинизации

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Анализ нейрососудистой ремоделирования в Entorhino-гиппокампа культуры Органотипической Slice

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...