Name: preparation and immunostaining of myelinating organotypic cerebellar slice cultures
Uploaded: 2019-03-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures at JoVE.com

Agradecemos Dr. Sean Freeman, Dr. Nathalie Sol-Foulon y Dr. Thomas Roux valiosos comentarios sobre el manuscrito. Este trabajo fue financiado por el INSERM, ICM, ARSEP becas R13123DD, R17127DD de la ANR (para DC) y beca FRM, SPF20110421435 (para DC), FDT20170437332 (a M.T.). Agradecemos a las instalaciones de cultura de célula CELIS y la RIC. Plataforma de proyección de imagen de Quant.

Todo trabajo con animales el cumplimiento de las políticas institucionales y lineamientos establecidos por el UPMC, INSERM y el francés y Directiva Comunidad Europea 86/609/CEE.
1. preparación de medio de cultivo y cultura inserta (práctica tiempo ≈ 10-15 min)
Nota: Realizar este paso en una campana de cultivo de flujo bajo condiciones estériles
<ol><li>Preparar 40 mL de medio de cultivo, que consiste en 50% BME, solución salina equilibrad...

<ol>
	<li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+Plasticity+and+Nervous+System+Function.">Myelin Plasticity and Nervous System Function.</a> Annual Review Neuroscience. 41, 61-76 (2018).</li><li>Desmazi&#232;res, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+at+the+nodal+and+perinodal+axonal+domains:+a+basis+for+multiple+sclerosis+pathology.">Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple sclerosis pathology.</a> Multiple Sclerosis Houndmills Basingstoke England. 18, 133-137 (2012).</li><li>Waxman, S. G., Ritchie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+the+myelinated+axon.">Molecular dissection of the myelinated axon.</a> Annals of Neurology. 33, 121-136 (1993).</li><li>F&#252;nfschilling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolytic+oligodendrocytes+maintain+myelin+and+long-term+axonal+integrity.">Glycolytic oligodendrocytes maintain myelin and long-term axonal integrity.</a> Nature. 485, 517-521 (2012).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroglia+metabolically+support+axons+and+contribute+to+neurodegeneration.">Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration.</a> Nature. 487, 443-448 (2012).</li><li>Chang, K. -. J., Redmond, S. A., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+myelination:+implications+for+mechanisms+of+neural+plasticity.">Remodeling myelination: implications for mechanisms of neural plasticity.</a> Nature Neurosciences. 19, 190-197 (2016).</li><li>Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mechanism+of+nervous+system+plasticity:+activity-dependent+myelination.">A new mechanism of nervous system plasticity: activity-dependent myelination.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16, 756-767 (2015).</li><li>Nave, K. -. A., Werner, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+of+the+nervous+system:+mechanisms+and+functions.">Myelination of the nervous system: mechanisms and functions.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 503-533 (2014).</li><li>Nave, K. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+and+support+of+axonal+integrity+by+glia.">Myelination and support of axonal integrity by glia.</a> Nature. 468, 244-252 (2010).</li><li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiological Reviews. 81, 871-927 (2001).</li><li>Kluver, H., Barrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+combined+staining+of+cells+and+fibers+in+the+nervous+system.">A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 12, 400-403 (1953).</li><li>Meier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+observations+on+early+myelination+in+the+human+spinal+cord.+Light+and+electron+microscope+study.">Some observations on early myelination in the human spinal cord. Light and electron microscope study.</a> Brain Research. 104, 21-32 (1976).</li><li>Hori, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SIMPLIFIED+ACID+HEMATEIN+TEST+FOR+PHOSPHOLIPIDS.">A SIMPLIFIED ACID HEMATEIN TEST FOR PHOSPHOLIPIDS.</a> Stain Technology. 38, 221-225 (1963).</li><li>Gallyas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+myelin+by+means+of+physical+development.">Silver staining of myelin by means of physical development.</a> Neurological Research. 1, 203-209 (1979).</li><li>Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje+cell+survival+and+axonal+regeneration+are+age+dependent:+an+in+vitro+study.">Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study.</a> Journal of Neuroscience An Official Journal of the Society of Neuroscience. 17, 3710-3726 (1997).</li><li>Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysolecithin+induces+demyelination+in+vitro+in+a+cerebellar+slice+culture+system.">Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system.</a> Journal of Neuroscience Research. 78, 157-166 (2004).</li><li>Zhang, H., Jarjour, A. A., Boyd, A., Williams, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+nervous+system+remyelination+in+culture--a+tool+for+multiple+sclerosis+research.">Central nervous system remyelination in culture--a tool for multiple sclerosis research.</a> Experimental Neurology. 230, 138-148 (2011).</li><li>Rasband, M. N., Peles, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nodes+of+Ranvier:+Molecular+Assembly+and+Maintenance.">The Nodes of Ranvier: Molecular Assembly and Maintenance.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8, a020495 (2015).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neurosciences Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Hussain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+and+Nestorone+facilitate+axon+remyelination:+a+role+for+progesterone+receptors.">Progesterone and Nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors.</a> Endocrinology. , 3820-3831 (2011).</li><li>Wioland, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epsilon+toxin+from+Clostridium+perfringens+acts+on+oligodendrocytes+without+forming+pores,+and+causes+demyelination.">Epsilon toxin from Clostridium perfringens acts on oligodendrocytes without forming pores, and causes demyelination.</a> Cellular Microbiology. 17, 369-388 (2015).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).</li><li>Medina-Rodr&#237;guez, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+in+vivo+remyelination+with+small+molecules:+a+neuroreparative+pharmacological+treatment+for+Multiple+Sclerosis.">Promoting in vivo remyelination with small molecules: a neuroreparative pharmacological treatment for Multiple Sclerosis.</a> Science Reports. 7, (2017).</li><li>Spassky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+steps+of+oligodendrogenesis:+insights+from+the+study+of+the+plp+lineage+in+the+brain+of+chicks+and+rodents.">The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents.</a> Developmental Neurosciences. 23, 318-326 (2001).</li><li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+green+fluorescent+protein+in+the+oligodendrocyte+lineage:+a+transgenic+mouse+for+developmental+and+physiological+studies.">Expression of the green fluorescent protein in the oligodendrocyte lineage: a transgenic mouse for developmental and physiological studies.</a> Journal of Neuroscience Research. 70, 529-545 (2002).</li><li>Gibson, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+promotes+oligodendrogenesis+and+adaptive+myelination+in+the+mammalian+brain.">Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain.</a> Science. 344, 1252304 (2014).</li><li>Tomassy, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+profiles+of+myelin+distribution+along+single+axons+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex.">Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Science. 344, 319-324 (2014).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+sensitive+optical+coherence+microscopy+for+brain+imaging.">Polarization sensitive optical coherence microscopy for brain imaging.</a> Optics Letters. 41, 2213-2216 (2016).</li><li>Freudiger, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biomedical+imaging+with+high+sensitivity+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science. 322, 1857-1861 (2008).</li><li>Lim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+Schwann+cell+myelination+by+third+harmonic+generation+microscopy.">Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).</li><li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy.">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).</li><li>Arancibia-Carcamo, I. L., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+node+of+Ranvier+in+CNS+pathology.">The node of Ranvier in CNS pathology.</a> Acta Neuropathologia. (Berlin). 128, 161-175 (2014).</li></ol>

Aquí detallamos un protocolo para generar un ex vivo modelo correspondientes a las culturas de rebanada de ratón organotypic cerebelosa, adaptado de previamente métodos publicados15,16,19 y la mielina posterior inmunotinción de estos preparados. Esta estrategia ofrece la posibilidad de visualizar los componentes de la mielina con una alta resolución en Estados sanos y patológicos.
Cerebelosa org...

Las neuronas son células altamente polarizadas, que comprenden un compartimiento somato-dendrítica que recibe entradas de su medio ambiente y un axón que garantice la generación y propagación de impulsos eléctricos a otras células. Propagación rápida y oportuna entrega de información es esencial para el buen funcionamiento del sistema nervioso. En los vertebrados, se facilita por la mielinización, que permite aumentar la velocidad de conducción axonal1. Mielina es una estructura especializada formada por capas compactadas de membrana del plasma generado por la glia myelinating, es decir, oligodendrocitos en el sistema nervioso central (CNS) y células de Schwann en sistema nervioso periférico (PNS). Tanto en el SNC y el SNP, axoglial interacciones conducen a la formación de dominios especializados de axonales: los nodos de Ranvier y sus alrededores de dominios los paranodes y juxtaparanodes2. Los segmentos axonales aislados por mielina o entrenudos, alternas con los nodos de Ranvier, que corresponden a pequeños dominios unmyelinated enriquecidos en canales voltaje-bloqueados del sodio (Nav). La alta concentración y rápida activación de canales de Nav en los nodos de Ranvier permiten la regeneración de los potenciales de acción y junto con las propiedades aislantes de las vainas de mielina, garantizar la eficiente y rápida de saltatoria conducción de la transmisión del impulso nervioso a lo largo del axón3.
Además de su papel en la aceleración de la velocidad de conducción del impulso nervioso, glia myelinating proporciona apoyo metabólico para el axón, preservando su integridad a largo plazo y participar en su supervivencia4,5. Además, ha quedado claro en estos últimos años que esa mielina es modulada dinámicamente a lo largo de la vida, por lo tanto presumiblemente participan en la regulación y plasticidad de diversas funciones del sistema nervioso. Ajustes de la distribución, número, longitud y grosor de las vainas de mielina a lo largo de axones así podrían representar una forma novedosa para ajustar finamente varios redes6,7,8. Por lo tanto, la adquisición evolutiva de la mielina es un proceso clave para las funciones sensoriales, motores y cognitivos y la alteración de la interacción entre los axones y glia es cada vez más considerada como contribuyendo al desarrollo o adquirida neurológica enfermedades9.
Composición de la mielina se ha caracterizado, con la particularidad de una alta proporción de lípidos (70%) en comparación con las proteínas (30%) en contraste con otras10de las membranas celulares. Sin embargo, a diferencia de los lípidos de la mielina, la mayoría de las proteínas de la mielina es específica de mielina, incluyendo la proteína básica de mielina (MBP), proteína del proteolípido (PLP), 2', glicoproteína de nucleótidos 3'-cíclico 3'-fosfodiesterasa (CNP), asociada a la mielina (MAG), glicoproteína del oligodendrocyte del myelin (MOG) y PMP-22, P010. Diversos métodos histológicos para tinción de mielina existen en base a su composición de lípidos, como Luxol fast blue11, Sudán negro B12, de panadero hematina ácida método13, así como14de tinción de plata. Sin embargo, estos enfoques no siempre permiten un adecuado contraste y resolución para visualizar las fibras individuales. Un método alternativo para detectar la mielina es a través de inmunohistoquímica dirigido contra proteínas de mielina. Anticuerpos contra varios antígenos específicos de mielina de destino con una alta especificidad y puede utilizarse rutinariamente para detectar estructuras mielínicas. La interacción antígeno-anticuerpo puede ser revelada aún más usando un anticuerpo secundario unido a un fluoróforo dirigida contra el anticuerpo primario y visualizada con microscopía de fluorescencia adecuada. Aquí, describimos un protocolo inmunoquímico para tinción de mielina en ex vivo cerebelosa rebanadas, un modelo que permite una buena conservación de la arquitectura del tejido nervioso. Además, la organización y el tamaño de las células de Purkinje (la única neurona myelinated del cerebelo) hacen un modelo clásico para los estudios electrofisiológicos y son igualmente ideales para realizar estudios de imágenes en vivo o fijados.
Las láminas cerebelosas se generan a partir de ratones P9-P10, un tiempo correspondiente al inicio temprano de la mielinización de células de Purkinje, un proceso que se logra sobre todo por una semana ex vivo (6-7 días in vitro DIV)15. Además, este modelo está adaptado para investigar trastornos desmielinizantes como la esclerosis múltiple (EM), como una desmielinización extensa puede ser inducida en rebanadas cerebelosas con el myelinotoxic compuesto lysophosphatidylcholine (o lysolecithin, LPC), que es seguido por una espontánea remyelination16,17. Remielinización endógena ocurre dos días después del retiro de la LPC del medio de cultivo y es casi completa después del tratamiento una semana.
La realización de este protocolo toma aproximadamente 3 semanas, incluyendo el medio día para la preparación de culturas rebanada cerebelosa, a la semana para obtener rebanadas completamente myelinated, seguidos por 2 días en llegar a la cima del demyelination y otra semana para todo su remielinización. Además, la inmunohistoquímica puede completarse en 2 días. El protocolo descrito aquí se adapta a una estándar camada de 6 cachorros de ratones y necesita ser adaptado con respecto al número de animales utilizados para el experimento planeado.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BME medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>41010026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (10X HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14180046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Horse Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;Streptomycin (10.000 IU/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gey&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9779-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose Solution (45%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8769-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysophosphatidylcholine (LPC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L4129-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol (100% ethanol)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>20821.330</td>
			<td>Cooled at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#174; X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>500622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>EuroMEDEX</td>
			<td>ET330-A</td>
			<td>pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>06-896</td>
			<td>Dilution 1/300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AB9348</td>
			<td>Dilution 1/150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>NE1019</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma)</td>
			<td>Gift from Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Dilution 1/5 to 1/10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8809</td>
			<td>Dilution 1/150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34151</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Secondary Antibodies conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue chopper</td>
			<td>McIlwain</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14101-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-straight forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved-fine forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11297-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes (60-mm and 100-mm)</td>
			<td>TPP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-, 6-well culture plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell culture inserts (0,4 &#181;m, 30-mm diameter)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>37&#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-end pipette tips</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>134000CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-bore pipette tips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>2079G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td></td>
			<td>20 or 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filters</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td></td>
			<td>0.22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>RS France</td>
			<td></td>
			<td>76 x 26 x 1.1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>RS France</td>
			<td></td>
			<td>22 x 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Sciences Tissue Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>5511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and immunostaining of myelinating organotypic cerebellar slice cultures

En el sistema nervioso, la mielina es una estructura compleja de la membrana generada por myelinating glial de las células, que axones ensheathes y facilita la conducción eléctrica rápido. Alteración de la mielina se ha demostrado para ocurrir en varias enfermedades neurológicas, donde se asocia con déficits funcionales. Aquí, ofrecemos una descripción detallada de una ex modelo vivo que consiste en rodajas cerebelosa organotypic de ratón, que se pueden mantener en cultivo por varias semanas y aún más ser etiquetado para visualizar la mielina.

Ejemplos de mielina representante immunostainings en rebanadas cerebelosa organotypic obtenidos P9-P10 C57black6 wild-type (WT) (figura 2A), así como de ratones transgénicos de PLP-GFP (figura 2B), junto con la tinción de las células de Purkinje. Myelinate de la materia blanca cerebelosas rebanadas pistas región de las láminas hacia la periferia de la folia y mielinización de las células de Purkinje se obtiene sobre todo ...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures at JoVE.com

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Preparación y el Immunostaining de Myelinating Organotypic rebanada cerebelosa culturas

Aquí presentamos un método para preparar organotypic culturas rebanada de cerebelo de ratón y la vaina de mielina de tinción por inmunohistoquímica adecuado para investigar mecanismos de myelination y remielinización en el sistema nervioso central.

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Este método permite estudiar el mecanismo básico de mielinización y reeyelinación a nivel celular y tisular. Esta técnica está en la encrucijada entre las culturas primarias y los enfoques in vivo. Es un modelo rápido y accesible con la principal ventaja de preservar la arquitectura tisular.Demostrando el procedimiento estarán Melina Thetiot, investigadora postdoctoral y Remi Ronzano, estudiante de doctorado de mi laboratorio. Para comenzar, inserte unas tijeras pequeñas suavemente en el foramen magnum y corte el cráneo haciendo una incisión lateral hacia el lado, y luego corte todo alrededor del cráneo de la cabeza. Para recuperar la parte dorsal del cráneo, utilice un fórceps fino y recto para levantar cuidadosamente la parte dorsal del cráneo.Luego introduzca cuidadosamente los fórceps entre el cráneo ventral y el cerebro. Voltee suavemente el cerebro y corte los nervios ópticos y trigéminos con tijeras pequeñas. A continuación, gire la cabeza o la parte dorsal del cráneo boca abajo justo por encima de un plato de cultivo celular de 60 milímetros que contiene un medio de disección de frío helado para ayudar al cerebro a caer por gravedad.Usando fórceps finos, orienta el cerebro con el lado dorsal hacia arriba y el lado ventral acostado. Bajo el microscopio binocular, utilice los fórceps finos y rectos para inmovilizar el cerebro en el lado del antebrazo. Luego, separa el cerebro trasero del resto del cerebro.Cortar los pedúnculos cerebelosos debajo del cerebelo para separar el cerebelo del resto del cerebro trasero. Una vez que el cerebelo esté aislado, utilice fórceps finos y rectos para desgarrar cuidadosamente las meninges. Sujete el cerebelo suavemente con los fórceps finos y curvos y colóquelo con el lado dorsal hacia arriba sobre la plataforma de plástico, perpendicularmente a la cuchilla de afeitar del helicóptero.A continuación, con una punta de pipeta de extremo estéril y delgada unida a una pipeta de un mililitro, aspira cualquier acceso al medio de disección alrededor del cerebelo. Luego, con un helicóptero de tejido, corte secciones saggitales de 300 micrómetros de espesor del cerebelo. A continuación, agregue una gota de medio de disección en el cerebelo en rodajas suavemente.Luego, con una punta ancha de pipeta de jabalí unida a la pipeta de un mililitro, aspira lentamente el cerebelo en rodajas y transfiéralo de nuevo al plato de cultivo celular de 60 milímetros que contiene el medio de disección de frío helado. A continuación, utilice dos fórceps finos y rectos para separar las rodajas individuales. A continuación, con una punta ancha de pipeta de jabalí unida a la pipeta de un mililitro, transfiera hasta cuatro rebanadas seleccionadas del vermis, junto con algún medio de disección en un inserto de cultivo de una placa de seis pozos.Retire cualquier acceso del medio de disección alrededor de las rodajas utilizando una punta de pipeta de extremo fino. Para la desmielinización, retire todo el medio de cultivo por debajo de los insertos de cultivo después de seis días in vitro, y reemplácelo por un mililitro por pozo del medio de cultivo fresco precalentado que contenga 0,5 miligramos por mililitro de LPC. Incubar de 15 a 17 horas a 37 grados centígrados en un 5% de ambiente de dióxido de carbono.Después de la incubación, lave los insertos colocándolos en un plato de 25 mililitros Petri que contenga un mililitro de medio de cultivo precalentó. A continuación, transfiera inmediatamente las inserciones de cultivo en un nuevo plato de seis pozos, que contiene un medio de cultivo fresco y precalentado. Para comenzar la inmunohistoquímica, primero use fórceps para levantar inserciones de cultivo y eliminar el medio de cultivo debajo de ellos.A continuación, agregue dos mililitros de 4%PFA en 1x PBS, ph 7.4, en las inserciones de membrana para fijar las rodajas de cerebeloso. Después de 30 minutos, lave las rodajas tres veces con dos mililitros de 1x PBS durante 10 minutos cada lavado. A continuación, bajo el microscopio binocular, usando un aumento de 25x a 30x, utilice un bisturí o un cepillo para separar suavemente las rodajas de las inserciones de membrana.Luego, usa un cepillo para transferir las rodajas flotantes a los pozos de una placa de cuatro pozos, que contiene 1x PBS para limitar el consumo de anticuerpos. Luego, aspirar el PBS de cada pozo e incubar las rodajas en etanol preenfriado 100% a menos 20 grados Celsius durante 15 a 20 minutos. Después de la incubación, aspirar el 100% de etanol y lavar las rodajas brevemente con 1x PBS.Luego, lávelos dos veces a temperatura ambiente con 1x PBS durante 10 minutos cada lavado. Para bloquear sitios de fijación de anticuerpos no específicos, aspire el PBS e incubar las rodajas en una solución que contenga 1x PBS, 5%NGS y 0,3% detergente no iónico a temperatura ambiente durante 30 a 45 minutos. A continuación, agregue anticuerpos primarios diluidos en la solución de bloqueo e incubar las rodajas a cuatro grados centígrados durante la noche.Después de la incubación durante la noche, lave las rodajas tres veces con 1x PBS durante 10 minutos cada lavado. A continuación, agregue los anticuerpos secundarios, diluidos en la solución de bloqueo, en una relación de dilución de uno a 500 e incubar las rodajas a temperatura ambiente en la oscuridad durante tres horas. Después de la incubación con el anticuerpo secundario, lave las rodajas tres veces en 1x PBS en la oscuridad durante 10 minutos cada lavado.A continuación, bajo un microscopio binocular, coloque 100 microleters de 1x PBS en la diapositiva y con un cepillo, transfiera las rodajas en el PBS y aplanarlas en la diapositiva. Quite cualquier acceso de PBS. Por último, coloque una gota de medio de montaje directamente sobre el resbalón de la cubierta de vidrio y cubra suavemente las rodajas.Se observaron inmunotenciones de mielina en rodajas de cerebelosa organotípicas, obtenidas de los días post natales 9 a 10 C57 negros seis ratones de tipo salvaje a los 11 días in vitro con nodos de ronviae enriquecidos en canales de sodio cerrados por tensión, flanqueados por el dominio de unión axoglial paranodal. Se observaron los mismos resultados para los ratones transgénicos PLP-GFP. La mielinización de las células parkengy se logra principalmente después de una semana en el cultivo.El tratamiento con LPC desmielina completamente las rodajas, que remilinan espontáneamente y están completamente mielinadas seis días después de la desmielinización. Este procedimiento debe tardar 25 minutos como máximo. Es realmente el punto más crítico.El cultivo de rebanadas organotípicas es adecuado para el estudio por imágenes en vivo de la dinámica de mielinización. También se puede utilizar para apuntar a experimentos de detección de drogas. Esta técnica permite un enfoque fácil y cuantitativo para estudiar los procesos de mielinización y reeyelinación.Los experimentadores deben seguir los procedimientos básicos de seguridad que se aplican al bienestar animal, la mielinización excesiva y aguda.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

El organotípicos rebanada hipocampo modelo de cultivo para el examen de la lesión neuronal

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Investigación

Neurociencias

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

Preparación Cortar, cultivo de tejidos organotípicos y grabación de la actividad luciferasa de reloj de genes en el núcleo supraquiasmático

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Organotípicos culturas rebanada hipocampo

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotípicos Culturas del cerebelo: Retos y detección de apoptosis

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

Grabación de células enteras de una rebanada preparación organotípicos del neocórtex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Derivación de las Culturas enriquecido oligodendrocitos y neuronas oligodendrocitos / myelinating Co-culturas de Post-natal tejidos murinos

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Culturas organotípicos rebanada de mesencéfalo ventral embrionario: Un sistema para estudiar el desarrollo neuronal dopaminérgica In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

El análisis de la morfología de células dendríticas Purkinje en cultivos de corte organotípicos

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Culturas Organotípicos Slice para Estudiar Oligodendrocyte Dinámica y mielinización

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...