Name: preparation and immunostaining of myelinating organotypic cerebellar slice cultures
Uploaded: 2019-03-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures at JoVE.com

Vi tackar Dr Sean Freeman, Dr Nathalie Sol-Foulon och Dr Thomas Roux för värdefulla synpunkter på manuskriptet. Detta arbete finansierades av INSERM, ICM, ARSEP bidrag R13123DD, ANR R17127DD (till e.Kr.) och FRM fellowship, SPF20110421435 (till e.Kr.), FDT20170437332 (till MT). Vi tackar CELIS cell kultur anläggningen och icm. Quant imaging plattform.

Allt arbete som involverar djur efterkom institutionella principer och riktlinjer som fastställts av UPMC, INSERM och de franska och Europeiska gemenskapen rådets direktiv 86/609/EEG.
1. beredning av odlingsmedium och kultur infogar (Hands-on tid ≈ 10 – 15 min)
Obs: Utföra detta steg i flödet kultur huva under sterila förhållanden
<ol><li>Förbereda 40 mL odlingsmedium, som består av 50% BME, 25% Hanks balanserad saltlösning (1 x), 25%...

<ol>
	<li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+Plasticity+and+Nervous+System+Function.">Myelin Plasticity and Nervous System Function.</a> Annual Review Neuroscience. 41, 61-76 (2018).</li><li>Desmazi&#232;res, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+at+the+nodal+and+perinodal+axonal+domains:+a+basis+for+multiple+sclerosis+pathology.">Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple sclerosis pathology.</a> Multiple Sclerosis Houndmills Basingstoke England. 18, 133-137 (2012).</li><li>Waxman, S. G., Ritchie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+the+myelinated+axon.">Molecular dissection of the myelinated axon.</a> Annals of Neurology. 33, 121-136 (1993).</li><li>F&#252;nfschilling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolytic+oligodendrocytes+maintain+myelin+and+long-term+axonal+integrity.">Glycolytic oligodendrocytes maintain myelin and long-term axonal integrity.</a> Nature. 485, 517-521 (2012).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroglia+metabolically+support+axons+and+contribute+to+neurodegeneration.">Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration.</a> Nature. 487, 443-448 (2012).</li><li>Chang, K. -. J., Redmond, S. A., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+myelination:+implications+for+mechanisms+of+neural+plasticity.">Remodeling myelination: implications for mechanisms of neural plasticity.</a> Nature Neurosciences. 19, 190-197 (2016).</li><li>Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mechanism+of+nervous+system+plasticity:+activity-dependent+myelination.">A new mechanism of nervous system plasticity: activity-dependent myelination.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16, 756-767 (2015).</li><li>Nave, K. -. A., Werner, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+of+the+nervous+system:+mechanisms+and+functions.">Myelination of the nervous system: mechanisms and functions.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 503-533 (2014).</li><li>Nave, K. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+and+support+of+axonal+integrity+by+glia.">Myelination and support of axonal integrity by glia.</a> Nature. 468, 244-252 (2010).</li><li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiological Reviews. 81, 871-927 (2001).</li><li>Kluver, H., Barrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+combined+staining+of+cells+and+fibers+in+the+nervous+system.">A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 12, 400-403 (1953).</li><li>Meier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+observations+on+early+myelination+in+the+human+spinal+cord.+Light+and+electron+microscope+study.">Some observations on early myelination in the human spinal cord. Light and electron microscope study.</a> Brain Research. 104, 21-32 (1976).</li><li>Hori, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SIMPLIFIED+ACID+HEMATEIN+TEST+FOR+PHOSPHOLIPIDS.">A SIMPLIFIED ACID HEMATEIN TEST FOR PHOSPHOLIPIDS.</a> Stain Technology. 38, 221-225 (1963).</li><li>Gallyas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+myelin+by+means+of+physical+development.">Silver staining of myelin by means of physical development.</a> Neurological Research. 1, 203-209 (1979).</li><li>Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje+cell+survival+and+axonal+regeneration+are+age+dependent:+an+in+vitro+study.">Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study.</a> Journal of Neuroscience An Official Journal of the Society of Neuroscience. 17, 3710-3726 (1997).</li><li>Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysolecithin+induces+demyelination+in+vitro+in+a+cerebellar+slice+culture+system.">Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system.</a> Journal of Neuroscience Research. 78, 157-166 (2004).</li><li>Zhang, H., Jarjour, A. A., Boyd, A., Williams, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+nervous+system+remyelination+in+culture--a+tool+for+multiple+sclerosis+research.">Central nervous system remyelination in culture--a tool for multiple sclerosis research.</a> Experimental Neurology. 230, 138-148 (2011).</li><li>Rasband, M. N., Peles, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nodes+of+Ranvier:+Molecular+Assembly+and+Maintenance.">The Nodes of Ranvier: Molecular Assembly and Maintenance.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8, a020495 (2015).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neurosciences Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Hussain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+and+Nestorone+facilitate+axon+remyelination:+a+role+for+progesterone+receptors.">Progesterone and Nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors.</a> Endocrinology. , 3820-3831 (2011).</li><li>Wioland, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epsilon+toxin+from+Clostridium+perfringens+acts+on+oligodendrocytes+without+forming+pores,+and+causes+demyelination.">Epsilon toxin from Clostridium perfringens acts on oligodendrocytes without forming pores, and causes demyelination.</a> Cellular Microbiology. 17, 369-388 (2015).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).</li><li>Medina-Rodr&#237;guez, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+in+vivo+remyelination+with+small+molecules:+a+neuroreparative+pharmacological+treatment+for+Multiple+Sclerosis.">Promoting in vivo remyelination with small molecules: a neuroreparative pharmacological treatment for Multiple Sclerosis.</a> Science Reports. 7, (2017).</li><li>Spassky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+steps+of+oligodendrogenesis:+insights+from+the+study+of+the+plp+lineage+in+the+brain+of+chicks+and+rodents.">The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents.</a> Developmental Neurosciences. 23, 318-326 (2001).</li><li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+green+fluorescent+protein+in+the+oligodendrocyte+lineage:+a+transgenic+mouse+for+developmental+and+physiological+studies.">Expression of the green fluorescent protein in the oligodendrocyte lineage: a transgenic mouse for developmental and physiological studies.</a> Journal of Neuroscience Research. 70, 529-545 (2002).</li><li>Gibson, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+promotes+oligodendrogenesis+and+adaptive+myelination+in+the+mammalian+brain.">Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain.</a> Science. 344, 1252304 (2014).</li><li>Tomassy, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+profiles+of+myelin+distribution+along+single+axons+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex.">Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Science. 344, 319-324 (2014).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+sensitive+optical+coherence+microscopy+for+brain+imaging.">Polarization sensitive optical coherence microscopy for brain imaging.</a> Optics Letters. 41, 2213-2216 (2016).</li><li>Freudiger, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biomedical+imaging+with+high+sensitivity+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science. 322, 1857-1861 (2008).</li><li>Lim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+Schwann+cell+myelination+by+third+harmonic+generation+microscopy.">Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).</li><li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy.">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).</li><li>Arancibia-Carcamo, I. L., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+node+of+Ranvier+in+CNS+pathology.">The node of Ranvier in CNS pathology.</a> Acta Neuropathologia. (Berlin). 128, 161-175 (2014).</li></ol>

Här, vi detalj ett protokoll för att generera en ex vivo modell motsvarar mus cerebellär organotypic skiva kulturer, anpassat från tidigare publicerade metoder15,16,19 och efterföljande myelin immunfärgning av dessa preparat. Denna strategi erbjuder möjligheten att visualisera myelin komponenter med en hög upplösning i både friska och patologiska stater.
Cerebellär organotypic skiva kulture...

Nervceller är starkt polariserade celler, som omfattar ett somato-dendritiska fack som får indata från sin omgivning och en axon som säkerställer generering och spridning av elektriska impulser till andra celler. Forförökningen och snabb leverans av information är nödvändigt för att nervsystemet ska fungera korrekt. Hos ryggradsdjur underlättas det genom myelinisering, vilket gör att öka axonal överledning hastighet1. Myelin är en specialiserad struktur som bildas av kompakterade lager av plasmamembranet som genereras av den myelinating glia, nämligen oligodendrocyter i det centrala nervsystemet (CNS) och Schwann celler i det perifera nervsystemet (PNS). Både i CNS och PNS, axoglial interaktioner kör bildandet av specialiserade axonal domäner: de noder av Ranvier och deras omgivande domäner, paranodes och juxtaparanodes2. Segmenten axonal isolerade av myelin, eller internoder, suppleant med de noder av Ranvier, som motsvarar till små unmyelinated domäner anrikade med spänningskänsliga natriumkanaler (Nav). Hög koncentration och snabb aktivering av Nav kanaler på de noder av Ranvier tillåta förnyelse av handlingspänningar, och tillsammans med de isolerande egenskaperna hos de myelin slidor, säkerställa en effektiv och snabb saltatorisk överledning av den nervimpuls längs axonet3.
Utöver sin roll i accelererande överledning hastighet nervimpuls, ger myelinating glia metabolt stöd till axon, bevara dess långsiktiga integritet och deltar i dess överlevnad4,5. Dessutom har det klargjorts i senaste åren att myelinet moduleras dynamiskt under hela livet och således förmodligen deltar i reglering och plasticitet i olika nervsystemets funktioner. Justeringar av distribution, antal, längd och tjocklek av myelin slidor längs axoner kan således representera ett nytt sätt att fint ställa olika nätverk6,7,8. Evolutionära förvärvet av myelin är därför en viktig process för sensoriska, motoriska och kognitiva funktioner och störning i samspelet mellan axoner och glia är alltmer anses bidra till den fosterskadande eller förvärvade neurologiska sjukdomar9.
Myelin sammansättning har karakteriserats, med den specifika funktionen av en hög andel av lipider (70%) jämfört med proteiner (30%) i motsats till andra cellulära membran10. Men till skillnad från myelin lipider är de flesta av myelin protein specifika för myelin, inklusive myelin grundläggande protein (MBP), proteolipid protein (PLP), 2', 3'-cykliska nukleotid 3'-fosfodiesteras (CNP), myelin-associerade glykoprotein (MAG), myelin-oligodendrocyte glykoprotein (MOG), PMP-22 och P010. Det finns utifrån dess lipid sammansättning, såsom Luxol snabbt blå11, Sudan svart B12, Baker's acid hematin metod13, samt silver färgning14olika histologiska metoder att färga myelin. Dock möjliggör dessa metoder inte alltid en tillräcklig kontrast och upplösning att visualisera enskilda fibrer. En alternativ metod att upptäcka myelin är genom immunhistokemi mot myelin proteiner. Olika antikroppar rikta myelin-specifika antigener med en hög specificitet och kan rutinmässigt användas att upptäcka myeliniserade strukturer. Antikropp-antigen interaktionen kan avslöjas ytterligare med hjälp av en sekundär antikropp kopplat till en fluorophore riktad mot den primär antikroppen och visualiseras med adekvat fluorescensmikroskopi. Här beskriver vi ett immunokemisk protokoll för att färga myelin på ex vivo cerebellär skivor, en modell som möjliggör en bra bevarandet av nervvävnad arkitekturen. Dessutom organisation och storlek av Purkinje celler (enda myeliniserade neuron av lillhjärnan) gör dem en klassisk modell för elektrofysiologiska studier och de är lika idealiska fast eller live-imaging studier.
Cerebellär skivor genereras från P9-P10 möss, en tid som motsvarar den tidig debuten av Purkinje celler myelinisering, en process som uppnås främst genom en vecka ex vivo (6-7 dagar in vitro DIV)15. Dessutom, denna modell är anpassad att undersöka demyeliniserande störningar såsom multipel skleros (MS), som en omfattande demyelinisering kan induceras i lillhjärnan skivor med hjälp av myelinotoxic-förening lysofosfatidylkolin (eller lysolecithin, LPC), som följs av en spontan remyelination16,17. Endogena remyelination sker från två dagar efter LPC borttagning från odlingssubstratet och är nästan komplett en vecka efterbehandling.
Slutförandet av detta protokoll tar ungefär tre veckor, inklusive en halvdag för cerebellär slice kulturer förberedelse, en vecka för att få fullt myeliniserade skivor, följt av 2 dagar att nå toppen av demyelinisering och ytterligare en vecka för sin fulla remyelination. Immunohistokemi kan dessutom fyllas i 2 dagar. Protokollet beskrivs här är anpassad till en standard kull 6 möss valpar och behöver anpassas om antalet djur som används för planerade experimentet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BME medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>41010026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (10X HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14180046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Horse Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;Streptomycin (10.000 IU/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gey&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9779-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose Solution (45%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8769-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysophosphatidylcholine (LPC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L4129-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol (100% ethanol)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>20821.330</td>
			<td>Cooled at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#174; X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>500622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>EuroMEDEX</td>
			<td>ET330-A</td>
			<td>pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>06-896</td>
			<td>Dilution 1/300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AB9348</td>
			<td>Dilution 1/150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>NE1019</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma)</td>
			<td>Gift from Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Dilution 1/5 to 1/10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8809</td>
			<td>Dilution 1/150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34151</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Secondary Antibodies conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue chopper</td>
			<td>McIlwain</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14101-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-straight forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved-fine forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11297-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes (60-mm and 100-mm)</td>
			<td>TPP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-, 6-well culture plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell culture inserts (0,4 &#181;m, 30-mm diameter)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>37&#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-end pipette tips</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>134000CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-bore pipette tips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>2079G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td></td>
			<td>20 or 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filters</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td></td>
			<td>0.22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>RS France</td>
			<td></td>
			<td>76 x 26 x 1.1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>RS France</td>
			<td></td>
			<td>22 x 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Sciences Tissue Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>5511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and immunostaining of myelinating organotypic cerebellar slice cultures

Myelin ligger i nervsystemet, en komplex membranstruktur som genereras av myelinating glial celler, som ensheathes axoner och underlättar snabb elektrisk överledning. Myelin förändring har visat sig uppstå vid olika neurologiska sjukdomar, där det är associerade med funktionella underskott. Här, vi ger en detaljerad beskrivning av en ex vivo modell bestående av mus organotypic cerebellär skivor, som kan hållas i kultur för flera veckor och ytterligare märkas för att visualisera myelin.

Exempel på representativa myelin immunostainings i organotypic cerebellär skivor erhållits från P9-P10 C57black6 vildtyp (WT) (figur 2A), samt PLP-GFP transgena möss (figur 2B), tillsammans med Purkinje celler färgning. Cerebellär skivor myelinate från den vita substansen spårar regionen skivor mot periferin av folia och myelinisering Purkinje celler är mestadels uppnås efter 6 till 7 DIV. På 7 DIV är induktion av en...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures at JoVE.com

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Förberedelse och immunfärgning av Myelinating Organotypic cerebellär Slice kulturer

Här presenterar vi en metod för att förbereda organotypic skiva kulturer från mus lillhjärnan och myelinskidan färgning av immunhistokemi lämpar sig för att undersöka mekanismer myelinisering och remyelination i centrala nervsystemet.

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Denna metod gör det möjligt att studera den grundläggande mekanismen för myelination och remyelination på cell- och tissular nivå. Denna teknik är vid korsningen mellan primära kulturer och in vivo tillvägagångssätt. Det är en snabb och tillgänglig modell med den största fördelen att bevara vävnadsarkitekturen.Demonstrerar proceduren blir Melina Thetiot, postdoktor och Remi Ronzano, doktorand från mitt laboratorium. Till att börja med sätter du in en liten sax försiktigt i foramen magnum och skär skallen genom att göra ett lateralt snitt mot sidan, och skär sedan runt huvudet skallen. För att hämta ryggdelen av skallen, använd en fin, rak tång för att försiktigt lyfta ryggdelen av skallen.Sedan försiktigt införa tången mellan ventrala skallen och hjärnan. Vänd försiktigt ut hjärnan och skär de optiska och trigeminala nerverna med små saxar. Vänd sedan huvudet eller ryggdelen av skallen upp och ner strax ovanför en 60 millimeter cellkultursrätt som innehåller iskall dissekeringsmedium för att hjälpa hjärnan att släppa av gravitationen.Med hjälp av fina tångar, orientera hjärnan med dorsala sidan uppåt och den ventrala sidan liggande. Under binokulär mikroskopet, använd de fina, raka tång för att immobilisera hjärnan på framhjärnan sidan. Sedan, separera hind hjärnan från resten av hjärnan.Skär cerebellar peduncles under lillhjärnan för att separera lillhjärnan från resten av bakhjärnan. När lillhjärnan är isolerad, använd fina, raka tång för att försiktigt riva bort hjärnhinnorna. Håll lillhjärnan försiktigt med de fina, böjda tlyckorna och placera det med ryggsidan upp på plastplattformen, vinkelrätt mot chopper rakbladet.Nästa, med en steril, tunn ände pipett spets fäst vid en en milliliter pipett, aspirera någon tillgång av dissekering medium runt lillhjärnan. Sedan, med en vävnadshacka, skiva 300 mikrometer tjocka saggitalsektioner av lillhjärnan. Lägg sedan till en droppe dissektionsmedium på det skivade lillhjärnan försiktigt.Sedan, med en bred vildsvin pipett spets fäst vid en milliliter pipett, sakta aspirera skivad lillhjärnan och överföra den tillbaka till 60 millimeter cell kultur skålen innehåller iskall dissektion medium. Därefter använder två fina, raka tångar för att separera enskilda skivor. Sedan, med en bred vildsvinpipets spets fäst vid en milliliter pipett, överföra upp till fyra utvalda skivor från vermis, tillsammans med några dissekeringsmedium på en kultur insats av en sex brunnsplatta.Ta bort all åtkomst av dissektionsmedium runt skivorna med hjälp av en tunn ändpipett. För demyelination, ta bort alla odlingsmedium under odlingsinsatserna efter sex dagar in vitro, och ersätta den med en milliliter per brunn av det förvarvade, färska odlingsmediet som innehåller 0,5 milligram per milliliter LPC. Inkubera i 15 till 17 timmar vid 37 grader Celsius i 5%koldioxid miljö.Efter inkubationen, tvätta skären genom att placera dem i en petriskål på 25 milliliter som innehåller en milliliter av förvättat odlingsmedium. Sedan, omedelbart överföra kultur skär i en ny, sex väl platta, som innehåller färska, förvörd kultur medium. För att börja immunohistokemi, använd först tuppar för att lyfta kulturinsatser och ta bort odlingsmediet under dem.Lägg sedan till två milliliter på 4%PFA i 1x PBS, ph 7.4, på membraninsatserna för att fixera cerebellarskivorna. Efter 30 minuter, tvätta skivorna tre gånger med två milliliter 1x PBS i 10 minuter varje tvätt. Därefter, under kikaren mikroskop, med hjälp av en 25x till 30x förstoring, använd en skalpell eller en borste för att försiktigt lossa skivorna från membranet skär.Använd sedan en borste för att överföra de flytande skivorna i brunnarna på en fyra brunnsplatta, som innehåller 1x PBS för att begränsa antikroppskonsumtionen. Sedan aspirera PBS från varje brunn och inkubera skivorna i färdigkyld 100%etanol vid minus 20 grader Celsius i 15 till 20 minuter. Efter inkubation, aspirera 100%etanol och tvätta skivorna kort med 1x PBS.Sedan tvätta dem två gånger i rumstemperatur med 1x PBS i 10 minuter varje tvätt. För att blockera icke-specifika antikroppsfixeringsställen aspirera DU PBS och inkubera skivorna i en lösning som innehåller 1x PBS, 5%NGS och 0,3%icke-joniskt rengöringsmedel vid rumstemperatur i 30 till 45 minuter. Därefter lägger primära antikroppar utspädda i den blockerande lösningen och inkubera skivorna i fyra grader Celsius över natten.Efter inkubation över natten, tvätta skivorna tre gånger med 1x PBS i 10 minuter varje tvätt. Tillsätt sedan de sekundära antikropparna, utspädda i blockeringslösningen, vid ett till 500-utspädningsförhållande och inkubera skivorna i rumstemperatur i mörker i tre timmar. Efter inkubation med den sekundära antikroppen, tvätta skivorna tre gånger i 1x PBS i mörker i 10 minuter varje tvätt.Därefter, under en kikare mikroskop, placera 100 mikroleters av 1x PBS på bilden och med en borste, överföra skivorna i PBS och platta ut dem på bilden. Ta bort all åtkomst av PBS. Slutligen, placera en droppe monteringsmedium direkt på glaslocket glida och försiktigt täcka skivorna.Myelin immunostainings i organotypic cerebellar skivor, erhålls från post natal dagar 9 till 10 C57 svart sex vilda typ möss observerades 11 dagar in vitro med noder av ronviae berikas i spänning gated natrium kanaler, flankerad av domänen paranodal axoglial junction. Samma resultat observerades för PLP- GFP transgena möss. Myelination av parkengycellerna uppnås mestadels efter en vecka i kultur.LPC behandling helt demyelinates skivorna, som remyelinate spontant och är helt myelinated sex dagar efter demyelination. Denna procedur bör ta 25 minuters maximum. Det är verkligen den mest kritiska punkten.Organotypisk skiva kultur är lämpliga för levande bildframställning studie av myelination dynamik. Det kan också användas för inriktning drogscreening experiment. Denna teknik möjliggör en enkel, kvantitativ metod för att studera myelination och remyelination processer.Försöksspridare ska följa de grundläggande säkerhetsrutiner som gäller för djurens välbefinnande, överdriven och skarp myeljering.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Den Organotypic hippocampus Slice Kultur Modell för prövningen Neuronal skada

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

Skiva Förberedelse, Organotypic Tissue odling och luciferas Inspelningen av Clock geners aktivitet i suprachiasmatiska Nucleus

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Organotypic hippocampus Slice kulturer

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotypic Cerebellar kulturer: apoptotiska utmaningar och Detection

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

Hela Cell Spela in från en Organotypic Slice Beredning av neocortex

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Härledning av anrikat Oligodendrocyte kulturer och Oligodendrocyte / Neuron Myelinating Co-kulturer från Postnatal Murine vävnader

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice kulturer av embryonala på magen mitthjärnan: Ett system att studera Dopaminerga nervsystemets utveckling In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Analysen av Purkinje Cell Dendritic Morfologi i Organotypiska slice kulturer

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Organotypic Slice kulturer för att studera Oligodendrocyte Dynamics och myelinisering

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Den Analys av neurovaskulär Remodeling i Entorhino-hippocampus Organotypic Slice kulturer

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...