Name: preparation and immunostaining of myelinating organotypic cerebellar slice cultures
Uploaded: 2019-03-20T14:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures at JoVE.com

Biz Dr Sean Freeman, Dr Nathalie Sol-Foulon ve Dr Thomas Roux el yazması üzerine değerli yorumlar için teşekkür ederim. Bu eser INSERM, ICM, ARSEP hibe R13123DD, ANR R17127DD (MS için) ve FRM dostluk, SPF20110421435 (için ad), tarafından finanse edildi (M.T. için) FDT20170437332. Biz CELIS hücre kültür tesis ve ICM teşekkür ederim. Quant görüntüleme platformu.

Hayvanları içeren tüm iş kurumsal politikalarımızı ve yönergelerimizi UPMC, INSERM ve Fransız ve Avrupa Topluluğu Konsey Direktifi 86/609/EEC tarafından kurulan karşılanmış.
1. hazırlanması kültür orta ve kültür ekler (Uygulamalı zaman ≈ 10-15 dk)
Not: Bir akış kültür başlıklı steril koşullarda bu adımı gerçekleştirin
<ol><li>40 mL % 50'si oluşan kültür ortamının hazırlamak BME, % 25 Hank'in dengeli tuz so...

<ol>
	<li>Monje, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelin+Plasticity+and+Nervous+System+Function.">Myelin Plasticity and Nervous System Function.</a> Annual Review Neuroscience. 41, 61-76 (2018).</li><li>Desmazi&#232;res, A., Sol-Foulon, N., Lubetzki, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+at+the+nodal+and+perinodal+axonal+domains:+a+basis+for+multiple+sclerosis+pathology.">Changes at the nodal and perinodal axonal domains: a basis for multiple sclerosis pathology.</a> Multiple Sclerosis Houndmills Basingstoke England. 18, 133-137 (2012).</li><li>Waxman, S. G., Ritchie, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+dissection+of+the+myelinated+axon.">Molecular dissection of the myelinated axon.</a> Annals of Neurology. 33, 121-136 (1993).</li><li>F&#252;nfschilling, U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Glycolytic+oligodendrocytes+maintain+myelin+and+long-term+axonal+integrity.">Glycolytic oligodendrocytes maintain myelin and long-term axonal integrity.</a> Nature. 485, 517-521 (2012).</li><li>Lee, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oligodendroglia+metabolically+support+axons+and+contribute+to+neurodegeneration.">Oligodendroglia metabolically support axons and contribute to neurodegeneration.</a> Nature. 487, 443-448 (2012).</li><li>Chang, K. -. J., Redmond, S. A., Chan, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Remodeling+myelination:+implications+for+mechanisms+of+neural+plasticity.">Remodeling myelination: implications for mechanisms of neural plasticity.</a> Nature Neurosciences. 19, 190-197 (2016).</li><li>Fields, R. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+new+mechanism+of+nervous+system+plasticity:+activity-dependent+myelination.">A new mechanism of nervous system plasticity: activity-dependent myelination.</a> Nature Reviews Neuroscience. 16, 756-767 (2015).</li><li>Nave, K. -. A., Werner, H. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+of+the+nervous+system:+mechanisms+and+functions.">Myelination of the nervous system: mechanisms and functions.</a> Annual Review of Cell and Developmental Biology. 30, 503-533 (2014).</li><li>Nave, K. -. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Myelination+and+support+of+axonal+integrity+by+glia.">Myelination and support of axonal integrity by glia.</a> Nature. 468, 244-252 (2010).</li><li>Baumann, N., Pham-Dinh, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+of+oligodendrocyte+and+myelin+in+the+mammalian+central+nervous+system.">Biology of oligodendrocyte and myelin in the mammalian central nervous system.</a> Physiological Reviews. 81, 871-927 (2001).</li><li>Kluver, H., Barrera, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+for+the+combined+staining+of+cells+and+fibers+in+the+nervous+system.">A method for the combined staining of cells and fibers in the nervous system.</a> Journal of Neuropathology and Experimental Neurology. 12, 400-403 (1953).</li><li>Meier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+observations+on+early+myelination+in+the+human+spinal+cord.+Light+and+electron+microscope+study.">Some observations on early myelination in the human spinal cord. Light and electron microscope study.</a> Brain Research. 104, 21-32 (1976).</li><li>Hori, S. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+SIMPLIFIED+ACID+HEMATEIN+TEST+FOR+PHOSPHOLIPIDS.">A SIMPLIFIED ACID HEMATEIN TEST FOR PHOSPHOLIPIDS.</a> Stain Technology. 38, 221-225 (1963).</li><li>Gallyas, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Silver+staining+of+myelin+by+means+of+physical+development.">Silver staining of myelin by means of physical development.</a> Neurological Research. 1, 203-209 (1979).</li><li>Dusart, I., Airaksinen, M. S., Sotelo, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Purkinje+cell+survival+and+axonal+regeneration+are+age+dependent:+an+in+vitro+study.">Purkinje cell survival and axonal regeneration are age dependent: an in vitro study.</a> Journal of Neuroscience An Official Journal of the Society of Neuroscience. 17, 3710-3726 (1997).</li><li>Birgbauer, E., Rao, T. S., Webb, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lysolecithin+induces+demyelination+in+vitro+in+a+cerebellar+slice+culture+system.">Lysolecithin induces demyelination in vitro in a cerebellar slice culture system.</a> Journal of Neuroscience Research. 78, 157-166 (2004).</li><li>Zhang, H., Jarjour, A. A., Boyd, A., Williams, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Central+nervous+system+remyelination+in+culture--a+tool+for+multiple+sclerosis+research.">Central nervous system remyelination in culture--a tool for multiple sclerosis research.</a> Experimental Neurology. 230, 138-148 (2011).</li><li>Rasband, M. N., Peles, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Nodes+of+Ranvier:+Molecular+Assembly+and+Maintenance.">The Nodes of Ranvier: Molecular Assembly and Maintenance.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. 8, a020495 (2015).</li><li>Stoppini, L., Buchs, P. A., Muller, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+organotypic+cultures+of+nervous+tissue.">A simple method for organotypic cultures of nervous tissue.</a> Journal of Neurosciences Methods. 37, 173-182 (1991).</li><li>Hussain, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progesterone+and+Nestorone+facilitate+axon+remyelination:+a+role+for+progesterone+receptors.">Progesterone and Nestorone facilitate axon remyelination: a role for progesterone receptors.</a> Endocrinology. , 3820-3831 (2011).</li><li>Wioland, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epsilon+toxin+from+Clostridium+perfringens+acts+on+oligodendrocytes+without+forming+pores,+and+causes+demyelination.">Epsilon toxin from Clostridium perfringens acts on oligodendrocytes without forming pores, and causes demyelination.</a> Cellular Microbiology. 17, 369-388 (2015).</li><li>Pampaloni, F., Reynaud, E. G., Stelzer, E. H. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+third+dimension+bridges+the+gap+between+cell+culture+and+live+tissue.">The third dimension bridges the gap between cell culture and live tissue.</a> Nature Reviews Molecular Cell Biology. 8, 839-845 (2007).</li><li>Medina-Rodr&#237;guez, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Promoting+in+vivo+remyelination+with+small+molecules:+a+neuroreparative+pharmacological+treatment+for+Multiple+Sclerosis.">Promoting in vivo remyelination with small molecules: a neuroreparative pharmacological treatment for Multiple Sclerosis.</a> Science Reports. 7, (2017).</li><li>Spassky, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+early+steps+of+oligodendrogenesis:+insights+from+the+study+of+the+plp+lineage+in+the+brain+of+chicks+and+rodents.">The early steps of oligodendrogenesis: insights from the study of the plp lineage in the brain of chicks and rodents.</a> Developmental Neurosciences. 23, 318-326 (2001).</li><li>Yuan, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+the+green+fluorescent+protein+in+the+oligodendrocyte+lineage:+a+transgenic+mouse+for+developmental+and+physiological+studies.">Expression of the green fluorescent protein in the oligodendrocyte lineage: a transgenic mouse for developmental and physiological studies.</a> Journal of Neuroscience Research. 70, 529-545 (2002).</li><li>Gibson, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Neuronal+activity+promotes+oligodendrogenesis+and+adaptive+myelination+in+the+mammalian+brain.">Neuronal activity promotes oligodendrogenesis and adaptive myelination in the mammalian brain.</a> Science. 344, 1252304 (2014).</li><li>Tomassy, G. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinct+profiles+of+myelin+distribution+along+single+axons+of+pyramidal+neurons+in+the+neocortex.">Distinct profiles of myelin distribution along single axons of pyramidal neurons in the neocortex.</a> Science. 344, 319-324 (2014).</li><li>Wang, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Polarization+sensitive+optical+coherence+microscopy+for+brain+imaging.">Polarization sensitive optical coherence microscopy for brain imaging.</a> Optics Letters. 41, 2213-2216 (2016).</li><li>Freudiger, C. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+biomedical+imaging+with+high+sensitivity+by+stimulated+Raman+scattering+microscopy.">Label-free biomedical imaging with high sensitivity by stimulated Raman scattering microscopy.</a> Science. 322, 1857-1861 (2008).</li><li>Lim, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+imaging+of+Schwann+cell+myelination+by+third+harmonic+generation+microscopy.">Label-free imaging of Schwann cell myelination by third harmonic generation microscopy.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences U. S. A. 111, 18025-18030 (2014).</li><li>Schain, A. J., Hill, R. A., Grutzendler, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Label-free+in+vivo+imaging+of+myelinated+axons+in+health+and+disease+with+spectral+confocal+reflectance+microscopy.">Label-free in vivo imaging of myelinated axons in health and disease with spectral confocal reflectance microscopy.</a> Nature Medicine. 20, 443-449 (2014).</li><li>Arancibia-Carcamo, I. L., Attwell, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+node+of+Ranvier+in+CNS+pathology.">The node of Ranvier in CNS pathology.</a> Acta Neuropathologia. (Berlin). 128, 161-175 (2014).</li></ol>

Burada, eski bir oluşturmak için bir protokol ayrıntılı fare serebellar organotypic dilim kültürler için karşılık gelen vivo modeli adapte üzerinden daha önce yayımlanmış yöntemleri15,16,19 ve sonraki miyelin Bu hazırlıklar immunostaining. Bu strateji ile bir yüksek çözünürlüklü miyelin bileşenlerinde sağlıklı ve patolojik durumları görselleştirmek için imkanı sunuyor.
<p class="jove_conten...

Neurons girdileri çevresi ve üretimi ve elektrik darbeleri diğer hücrelere yayılmasını sağlar bir akson alır bir somato-dendritik bölme oluşturan çok polarize hücrelerdir. Hızlı yayılma ve bilgilerin zamanında teslim sinir sisteminin düzgün çalışması için önemlidir. Omurgalılar, aksonal iletim hızı1artan sağlayan myelination tarafından yönetilir. Miyelin sıkıştırılmış katmanları plazma zarı myelinating glia tarafından oluşturulan Merkezi sinir sistemi (MSS), yani oligodendrocytes ve periferik sinir sistemi (PNS) Schwann hücreleri tarafından kurulan özel bir yapıdır. Hem MSS ve PNS, axoglial etkileşimler özel aksonal etki oluşumu sürücü: of Ranvier düğümleri ve onların çevre etki alanları, paranodes ve juxtaparanodes2. Aksonal kesimi miyelin veya internodes, diğer voltaj Kapılı sodyum kanallarının (Nav) zenginleştirilmiş küçük unmyelinated etki alanlarına karşılık gelen düğümü of Ranvier ile izole edilmiş. Yüksek konsantrasyon ve Nav kanal düğümleri of Ranvier adlı hızlı aktivasyon rejenerasyon aksiyon potansiyelleri ve miyelin kılıf yalıtım özellikleri ile birlikte izin, verimli ve hızlı saltatory iletim sağlamak sinir impuls3akson boyunca.
Sinir impuls iletim hızı hızlandırılması rolüne ek olarak, myelinating glia uzun vadeli bütünlüğünü koruyarak ve onun hayatta kalma4,5' te katılan axon metabolik destek sağlar. Ayrıca, bu son yıllarda bu miyelin dinamik olarak böylece muhtemelen yönetmelik ve çeşitli sinir sistemi fonksiyonları plastisite katılan hayatı boyunca modülasyonlu anlaşılır bir hizmet haline gelmiştir. Dağıtım, sayısını, uzunluğu ve akson boyunca miyelin kılıf kalınlığını ayarlar böylece ince çeşitli ağlar6,7,8ayarlamak için yeni bir yol gösterebilir. Bu nedenle, miyelin evrimsel edinimi duyusal, motor ve Bilişsel işlevler için anahtar bir süreçtir ve akson ve glia arasındaki etkileşimi pertürbasyon giderek gelişimsel için katkı olarak kabul veya nörolojik elde hastalıklar9.
Miyelin kompozisyon, lipitler (% 70) yüksek oranda belirli özelliği ile karakterize proteinler (% 30) ile karşılaştırıldığında diğer hücresel zarları10aksine. Ancak, miyelin lipidler, miyelin proteinler miyelin temel protein (MBP), proteolipid protein (PIP), 2', 3'-döngüsel nükleotit 3'-miyelin ilişkili fosfodiesteraz (CNP), glikoprotein (MAG), dahil olmak üzere miyelin için belirli çoğu miyelin oligodendrocyte glikoprotein (MOG), PMP-22 ve P010. Miyelin leke çeşitli histolojik yöntemlerle temel alınarak Luxol hızlı mavi11gibi onun lipit bileşimi, Sudan Siyah B12, Baker'ın asit hematin yöntemi13yanı sıra14boyama gümüş adlı biri yok. Yine de, bu yaklaşımlar her zaman bir yeterli kontrast ve bireysel lifleri görselleştirmek için çözünürlük için izin vermez. Miyelin algılamak için alternatif bir yaklaşım miyelin proteinler karşı yönetmen immünhistokimya geçer. Çeşitli antikor miyelin özgü antijenlere yüksek özgüllük ile hedef ve düzenli olarak myelinated yapıları algılamak için kullanılabilir. Antikor-antijen etkileşim daha da bir fluorophore karşı birincil antikor yönettiği ve yeterli Floresans mikroskobu ile görüntülenmeyecektir için ikincil bir antikor kullanarak birleştiğinde ile açığa çıkarılabilir. Burada, immunochemical bir protokol üzerinde miyelin ex vivo serebellar dilimleri, sinir dokusu mimari iyi korunması için izin veren bir model leke açıklayın. Buna ek olarak, organizasyon ve boyutu Purkinje hücre (beyincik tek myelinated nöron) onlara Elektrofizyolojik çalışmalar için klasik bir model ve benzer şekilde sabit veya canlı görüntüleme çalışmaları gerçekleştirmek idealdir.
Serebellar dilimleri P9-P10 fareler Purkinje hücre myelination, çoğunlukla bir hafta ex vivo (6-7 gün in vitro DIV)15elde edilir bir süreç erken başlangıçlı karşılık gelen bir kez oluşturulur. Ayrıca, bu modeli geniş bir demiyelinizasyon myelinotoxic bileşik lysophosphatidylcholine (veya lysolecithin, LPC) kullanarak serebellar dilimler halinde indüklenen gibi multipl skleroz (MS), gibi demiyelinizan hastalıkları araştırmak için adapte hangi bir spontan remyelination16,17tarafından takip edilir. Endojen remyelination iki gün kültür ortamdan LPC çıkarıldıktan sonra gerçekleşir ve neredeyse bir hafta sonrası tedavi tamamlamak olduğunu.
Approximatively 3 hafta serebellar dilim kültürler hazırlık, tam myelinated dilimleri, demiyelinizasyon ulaşmak için 2 gün tarafından takip elde etmek için bir hafta ve onların tam bir hafta için yarım gün de dahil olmak üzere, bu protokolün tamamlanmasından alır remyelination. Buna ek olarak, immünhistokimya 2 gün içinde tamamlanabilir. Burada açıklanan protokol 6 fare pups standart bir çöp için uyarlanmış ve planlı deneme için kullanılan hayvan sayısı ile ilgili adapte gerekiyor.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>BME medium</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>41010026</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hank&#8217;s Balanced Salt Solution (10X HBSS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>14180046</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>GlutaMAX (100X)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>35050038</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Heat-inactivated Horse Serum</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>26050088</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Penicillin&#8211;Streptomycin (10.000 IU/mL)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>15140122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gey&#8217;s Balanced Salt Solution</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G9779-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>D-Glucose Solution (45%)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>G8769-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lysophosphatidylcholine (LPC)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>L4129-100MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Paraformaldehyde (PFA)</td>
			<td>Electron Microscopy Sciences</td>
			<td>15714</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Absolute ethanol (100% ethanol)</td>
			<td>VWR Chemicals</td>
			<td>20821.330</td>
			<td>Cooled at -20&#176;C</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Triton&#174; X-100</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>X100-500ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>10% Normal Goat Serum (NGS)</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>500622</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate Buffer Solution</td>
			<td>EuroMEDEX</td>
			<td>ET330-A</td>
			<td>pH 7.4</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-GFP Antibody (Polyclonal, Chicken)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>06-896</td>
			<td>Dilution 1/300</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Polyclonal, Chicken)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>AB9348</td>
			<td>Dilution 1/150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Myelin Basic Protein (MBP) Antibody (Monoclonal, Mouse IgG2b)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>NE1019</td>
			<td>Dilution 1/200</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-PLP Antibody (Rat, Hybridoma)</td>
			<td>Gift from Dr. K. Ikenaka; Okasaki, Japan</td>
			<td></td>
			<td>Dilution 1/5 to 1/10</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Sodium Channel, Pan Antibody (Monoclonal, Mouse IgG1, clone K58/35)</td>
			<td>Sigma Aldrich</td>
			<td>S8809</td>
			<td>Dilution 1/150</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti-Caspr Antibody (Polyclonal, Rabbit)</td>
			<td>Abcam</td>
			<td>ab34151</td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Goat Secondary Antibodies conjugated to Alexa Fluor 488, 594, 647 or 405</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td></td>
			<td>Dilution 1/500</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluoromount</td>
			<td>SouthernBiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue chopper</td>
			<td>McIlwain</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Razor blades</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Large scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>14101-14</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Small scissors</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>91500-09</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-straight forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>91150-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Curved-fine forceps</td>
			<td>F.S.T</td>
			<td>11297-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture dishes (60-mm and 100-mm)</td>
			<td>TPP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>4-, 6-well culture plates</td>
			<td>TPP</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Millicell culture inserts (0,4 &#181;m, 30-mm diameter)</td>
			<td>Merck Millipore</td>
			<td>PICM0RG50</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cell culture incubator</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>37&#176;C, 5% CO2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine-end pipette tips</td>
			<td>Dutscher</td>
			<td>134000CL</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Wide-bore pipette tips</td>
			<td>ThermoFisher Scientific</td>
			<td>2079G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td></td>
			<td>20 or 50 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile syringe filters</td>
			<td>Terumo Europe</td>
			<td></td>
			<td>0.22 &#181;m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Scalpel</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td>0510</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Brush</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope slides</td>
			<td>RS France</td>
			<td></td>
			<td>76 x 26 x 1.1 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glass coverslips</td>
			<td>RS France</td>
			<td></td>
			<td>22 x 22 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Kimtech Sciences Tissue Wipers</td>
			<td>Kimberly-Clark Professional</td>
			<td>5511</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Binocular microscope</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation and immunostaining of myelinating organotypic cerebellar slice cultures

Sinir sisteminde miyelin gliyal myelinating tarafından oluşturulan bir karmaşık membran yapısı hücreleri, hangi ensheathes akson ve hızlı elektrik iletim kolaylaştırır var. Miyelin değişiklik fonksiyonel açıkları ile ilişkili nerede çeşitli nörolojik hastalıklarda ortaya göstermiştir. Burada, eski bir ayrıntılı bir açıklama sağlamak vivo modeli kültür için birkaç hafta ve daha fazla miyelin görselleştirmek için etiketli muhafaza fare organotypic serebellar dilim, oluşan.

Organotypic serebellar dilimleri P9-P10 C57black6 vahşi-türünden (WT) (şekil 2A), yanında PLP-GFP transgenik fareler (şekil 2B), boyama Purkinje hücreleri ile birlikte elde edilen temsilcisi miyelin immunostainings örnekleri. Serebellar dilim beyaz madde myelinate izler folia çevre doğru dilim bölgesinin ve myelination Purkinje hücre çoğunlukla 6-7 sonra elde DIV. 7 DIV indüksiyon tam demiyelinizasyon LPC tedavi (<...

Watch this Scientific Journal Video about Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures at JoVE.com

Preparation and Immunostaining of Myelinating Organotypic Cerebellar Slice Cultures

Hazırlık ve Immunostaining Myelinating Organotypic serebellar dilim kültürlerin

Burada fare serebellum ve miyelin kılıf immünhistokimya tarafından myelination ve remyelination merkezi sinir sisteminde mekanizmaları araştıran için uygun boyama dilim kültürler organotypic hazırlamak için bir yöntem mevcut.

In the nervous system, myelin is a complex membrane structure generated by myelinating glial cells, which ensheathes axons and facilitates fast electrical ...

Bu yöntem hücresel ve tissular düzeyde miyelinasyon ve remiyelinasyon temel mekanizması çalışma sağlar. Bu teknik, birincil kültürler ve in vivo yaklaşımlar arasındaki kavşakta yer almaktadır. Doku mimarisini korumanın ana avantajıile hızlı ve erişilebilir bir modeldir.Prosedürü gösteren Melina Thetiot, bir doktora sonrası araştırmacı ve Remi Ronzano, benim laboratuvar bir doktora öğrencisi olacaktır. Başlamak için, foramen magnum içine yavaşça küçük bir makas yerleştirin ve yan doğru bir yanal kesi yaparak kafatası kesti, ve sonra baş kafatası etrafında tüm kesti. Kafatasının dorsal kısmını almak için, kafatasının dorsal kısmını dikkatlice kaldırmak için ince, düz forseps kullanın.Sonra dikkatlice ventral kafatası ve beyin arasındaki pikiyeler tanıtmak. Yavaşça beyin dışarı çevirmek ve küçük makas ile optik ve trigeminal sinirler kesti. Daha sonra, beynin yerçekimitarafından düşmesine yardımcı olmak için buz gibi diseksiyon ortamı içeren 60 milimetrelik hücre kültür çanağının hemen üzerinde baş veya kafatasının sırt kısmını ters çevirin.İnce forceps kullanarak, sırt tarafı yukarı bakan ve ventral tarafı yatarken beyin yönlendirmek. Dürbün mikroskobu altında, ön beyin tarafında beyin hareketsizleştirmek için ince, düz forseps kullanın. Sonra arka beyni beynin geri kalanından ayırın.Serebellumun altındaki serebellar peduncles kes arka beynin geri kalanından beyincik ayırmak için. Beyincik izole olduktan sonra, dikkatle menenjler yırtmak için ince, düz forceps kullanın. Serebellum hafifçe ince, kavisli forceps ile tutun ve plastik platform üzerine dorsal tarafı ile yerleştirin, helikopter jilet dik.Sonra, bir mililitrelik pipete bağlı steril, ince uç pipet ucu ile, beyincik etrafında diseksiyon ortamı herhangi bir erişim aspire. Sonra, bir doku doğrama ile, serebellumun 300 mikrometre kalınlığında saggital kesitleri dilim. Daha sonra, yavaşça dilimlenmiş beyincik üzerine diseksiyon ortamı bir damla ekleyin.Daha sonra, bir mililitrelik pipete bağlı geniş bir domuz pipet ucu ile, yavaş yavaş dilimlenmiş beyincik aspire ve buz soğuk diseksiyon ortamı içeren 60 milimetrehücre kültür çanak geri aktarın. Ardından, tek tek dilimleri ayırmak için iki ince, düz forceps kullanın. Daha sonra, bir mililitrelik pipete bağlı geniş bir domuz pipet ucu ile, vermis dört seçilen dilimler kadar aktarın, altı iyi plaka bir kültür eklemek üzerine bazı diseksiyon ortamı ile birlikte.İnce bir uç pipet ucu kullanarak dilimlerin etrafındaki diseksiyon ortamına erişimi kaldırın. Demiyelinasyon için, altı gün in vitro sonra kültür ekler altında tüm kültür ortamı kaldırmak ve mililitre LPC başına 0,5 miligram içeren önceden ısıtılmış, taze kültür ortamı kuyu başına bir mililitre ile değiştirin. %5 karbondioksit ortamında 37 santigrat derecede 15 ila 17 saat kuluçkaya yat.Kuluçkadan sonra, bir mililitre önceden ısıtılmış kültür ortamı içeren 25 mililitrelik Petri kabına yerleştirerek kesici uçları yıkayın. Sonra, hemen taze, önceden ısıtılmış kültür ortamı içeren yeni, altı iyi plaka, kültür ekler aktarın. İmmünohistokimyaya başlamak için, ilk olarak kültür kesici uçlarını kaldırmak ve altlarındaki kültür ortamını kaldırmak için forseps kullanın.Daha sonra, serebellar dilimleri düzeltmek için membran ekler üzerine 1x PBS, ph 7.4, % 4 PFA iki mililitre ekleyin. 30 dakika sonra, 10 dakika her yıkama için 1x PBS iki mililitre ile dilimleri üç kez yıkayın. Daha sonra, dürbün mikroskobu altında, 25x için 30x büyütme kullanarak, hafifçe membran ekler dilimleri ayırmak için bir neşter veya fırça kullanın.Ardından, yüzen dilimleri antikor tüketimini sınırlamak için 1x PBS içeren dört kuyu plakasının kuyularına aktarmak için bir fırça kullanın. Daha sonra, her kuyudan PBS aspire ve eksi 20 derece santigrat derecede önceden soğutulmuş% 100 etanol dilimleri inkübe 15-20 dakika. Kuluçkadan sonra% 100 etanol aspire ve 1x PBS ile kısa bir süre dilimleri yıkayın.Daha sonra, 10 dakika her yıkama için 1x PBS ile oda sıcaklığında iki kez yıkayın. Spesifik olmayan antikor fiksasyon bölgelerini engellemek için PBS'yi aspire edin ve dilimleri oda sıcaklığında %0,3'ü iyonik olmayan deterjan içeren bir çözeltide 30 ila 45 dakika kuluçkaya yatırın. Daha sonra, bloke çözeltisi seyreltilmiş birincil antikorlar ekleyin ve bir gecede dört derece santigrat dilimleri inkübün.Bir gece kuluçka sonra, 10 dakika her yıkama için 1x PBS ile dilimleri üç kez yıkayın. Daha sonra bloklama çözeltisinde seyreltilmiş ikincil antikorları 1 ila 500 seyreltme oranında ekleyin ve dilimleri üç saat boyunca karanlıkta oda sıcaklığında kuluçkaya yatırın. Sekonder antikor ile kuluçkadan sonra, dilimleri her yıkamada 10 dakika karanlıkta 1x PBS'de üç kez yıkayın.Daha sonra, dürbün mikroskobu altında, slayt üzerine 1x PBS 100 mikrolet yerleştirin ve bir fırça ile, PBS içine dilimleri aktarın ve slayt üzerinde düzleştirmek. PBS'nin tüm erişimini kaldırın. Son olarak, doğrudan cam kapak üzerine montaj ortamı bir damla yerleştirin ve yavaşça dilimleri kapağı.Doğum sonrası 9 ila 10 C57 siyah altı yabani tip fareden elde edilen organotipik serebellar dilimlerde miyelin immünboyamalar, paranodal aksoglial kavşak etki alanı ile çevrili voltaj lı sodyum kanallarında zenginleştirilmiş ronvia düğümleri ile 11 gün in vitro olarak gözlendi. PLP-GFP transgenik farelerde de aynı sonuçlar gözlendi. Parkenji hücrelerinin miyelinasyonu çoğunlukla kültürde bir hafta sonra elde edilir.LPC tedavisi tamamen spontan remyelinate ve tam miyelinated altı gün sonra demiyelinasyon dilimleri demyelinates. Bu yordam en fazla 25 dakika sürer. Gerçekten en kritik nokta.Organotipik dilim kültürü miyelonik dinamiğinin canlı görüntüleme çalışması için uygundur. Ayrıca uyuşturucu tarama deneylerini hedeflemek için de kullanılabilir. Bu teknik, miyelinasyon ve remiyelinasyon süreçlerini incelemek için kolay ve nicel bir yaklaşım sağlar.Deneyciler, hayvan refahı, aşırı ve keskin miyelinasyon için uygulanan temel güvenlik prosedürlerini takip etmek için vardır.

Research

JoVE Journal

Neuroscience

The Organotypic Hippocampal Slice Culture Model for Examining Neuronal Injury

Nöronal Sakatlık incelenmesi için Organotipik Hipokampal Dilim Kültür Modeli

Organotypic hippocampal slice culture is an in vitro method to examine mechanisms of neuronal injury in which the basic architecture and composition of ...

Slice Preparation, Organotypic Tissue Culturing and Luciferase Recording of Clock Gene Activity in the Suprachiasmatic Nucleus

Dilim hazırlanması, Organotipik Doku ekimi ve suprakiazmatik nükleus Saat Gen Faaliyet Lusiferaz Kayıt

A central circadian (~24 hr) clock coordinating daily rhythms in physiology and behavior resides in the suprachiasmatic nucleus (SCN) located in the ...

Organotypic Hippocampal Slice Cultures

Organotipik Hipokampal Dilim Kültürler

The hippocampus, a component of the limbic system, plays important roles in long-term memory and spatial navigation 1. Hippocampal neurons can modify the ...

Organotypic Cerebellar Cultures: Apoptotic Challenges and Detection

Organotipik Serebellar Kültürler: Apoptotik Zorluklar ve Tayin

Organotypic cultures of neuronal tissue were first introduced by Hogue in 1947 1,2 and have constituted a major breakthrough in the field of neuroscience. ...

Whole Cell Recording from an Organotypic Slice Preparation of Neocortex

Neokorteks bir Organotipik Dilim Hazırlık Tüm Hücre Kaydı

We have been studying the expression and functional roles of voltage-gated potassium channels in pyramidal neurons from rat neocortex.  Because of the ...

Derivation of Enriched Oligodendrocyte Cultures and Oligodendrocyte/Neuron Myelinating Co-cultures from Post-natal Murine Tissues

Post-natal murin Dokular Co-kültürler Myelinating zenginleştirilmiş oligodendrosit Kültürleri ve oligodendrosit / Nöron türetilmesi

Identifying the molecular mechanisms underlying OL development is not only critical to furthering our knowledge of OL biology, but also has implications ...

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Organotypic Slice Cultures of Embryonic Ventral Midbrain: A System to Study Dopaminergic Neuronal Development in vitro

Embriyonik ventral orta beyin Organotipik Dilim Kültürler: dopaminerjik Nöronal Gelişim Eğitim Bir Sistem In vitro</em

The  mouse is an excellent model organism to study mammalian brain development due  to the abundance of molecular and genetic data. However, the ...

The Analysis of Purkinje Cell Dendritic Morphology in Organotypic Slice Cultures

Organotipik Dilim Kültürleri Purkinje Hücre Dendritik Morfoloji Analizi

Purkinje cells are an attractive model system for studying dendritic development, because they have an impressive dendritic tree which is strictly ...

Organotypic Slice Cultures to Study Oligodendrocyte Dynamics and Myelination

Organotipik Dilim Kültürler Oligodendrosit Dinamikler ve miyelinasyonun incelemek için

NG2 expressing cells (polydendrocytes, oligodendrocyte precursor cells) are the fourth major glial cell population in the central nervous system. During ...

The Analysis of Neurovascular Remodeling in Entorhino-hippocampal Organotypic Slice Cultures

Içinde Neurovascular Yaptırma Analizi Entorhino-hipokampal Organotipik Dilim Kültürler

Ischemic brain injury is among the most common and devastating conditions compromising proper brain function and often leads to persisting functional ...