Name: a high-throughput shigella-specific bactericidal assay
Uploaded: 2019-02-27T14:00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay at JoVE.com

تم تمويل هذا العمل بمنحه من المسار إلى M.H.N. وأجريت هذه الدراسة كالبحوث التعاونية ووضع اتفاق بين معهد والتر ريد الجيش البحوث وجامعة ألاباما في برمنغهام.

<ol>
	<li>Riddle, M. S., Sanders, J. W., Putnam, S. D., Tribble, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence,+etiology,+and+impact+of+diarrhea+among+long-term+travelers+(US+military+and+similar+populations):+a+systematic+review.">Incidence, etiology, and impact of diarrhea among long-term travelers (US military and similar populations): a systematic review.</a> The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 74 (5), 891-900 (2006).</li><li>Tickell, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+management+of+Shigella+infection+in+children+with+diarrhoea:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Identification and management of Shigella infection in children with diarrhoea: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Global Health. 5 (12), e1235-e1248 (2017).</li><li>Livio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+isolates+from+the+global+enteric+multicenter+study+inform+vaccine+development.">Shigella isolates from the global enteric multicenter study inform vaccine development.</a> Clinical Infectious Diseases. 59 (7), 933-941 (2014).</li><li>Barry, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+pitfalls+in+Shigella+vaccine+research.">Progress and pitfalls in Shigella vaccine research.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 10 (4), 245-255 (2013).</li><li>Noriega, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategy+for+cross-protection+among+Shigella+flexneri+serotypes.">Strategy for cross-protection among Shigella flexneri serotypes.</a> Infection and Immunity. 67 (2), 782-788 (1999).</li><li>Levine, M. M., Kotloff, K. L., Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+of+Shigella+vaccines:+two+steps+forward+and+one+step+back+on+a+long,+hard+road.">Clinical trials of Shigella vaccines: two steps forward and one step back on a long, hard road.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (7), 540-553 (2007).</li><li>Sayem, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+host+immune+responses+to+epidemic+and+endemic+strains+of+Shigella+dysenteriae+type+I.">Differential host immune responses to epidemic and endemic strains of Shigella dysenteriae type I.</a> Journal of Health Population and Nutrition. 29 (5), 429-437 (2011).</li><li>Rahman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+zinc+supplementation+as+adjunct+therapy+on+the+systemic+immune+responses+in+shigellosis.">Effects of zinc supplementation as adjunct therapy on the systemic immune responses in shigellosis.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 81 (2), 495-502 (2005).</li><li>Nahm, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=interlaboratory+evaluations,+and+application+of+a+simple,+high-throughput+Shigella+serum+bactericidal+assay.">interlaboratory evaluations, and application of a simple, high-throughput Shigella serum bactericidal assay.</a> mSphere. 3 (3), (2018).</li><li>Burton, R. L., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+fourfold+multiplexed+opsonization+assay+(MOPA4)+for+pneumococcal+antibodies.">Development and validation of a fourfold multiplexed opsonization assay (MOPA4) for pneumococcal antibodies.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 13 (9), 1004-1009 (2006).</li><li>Tribble, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+a+Shigella+flexneri+2a+Invaplex+50+intranasal+vaccine+in+adult+volunteers.">Safety and immunogenicity of a Shigella flexneri 2a Invaplex 50 intranasal vaccine in adult volunteers.</a> Vaccine. 28 (37), 6076-6085 (2010).</li><li>Kim, H. W., Kim, K. H., Kim, J., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+serum+bactericidal+assay+for+antibodies+to+Haemophilus+influenzae+type+b.">A high throughput serum bactericidal assay for antibodies to Haemophilus influenzae type b.</a> BMC Infectious Diseases. 16, 473 (2016).</li><li>Maslanka, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+and+a+multilaboratory+comparison+of+Neisseria+meningitidis+serogroup+A+and+C+serum+bactericidal+assays.">Standardization and a multilaboratory comparison of Neisseria meningitidis serogroup A and C serum bactericidal assays.</a> The Multilaboratory Study Group. Clinical Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (2), 156-167 (1997).</li><li>Jang, M. S., Sahastrabuddhe, S., Yun, C. H., Han, S. H., Yang, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+bactericidal+assay+for+the+evaluation+of+typhoid+vaccine+using+a+semi-automated+colony-counting+method.">Serum bactericidal assay for the evaluation of typhoid vaccine using a semi-automated colony-counting method.</a> Microbial Pathogeneis. 97, 19-26 (2016).</li><li>Necchi, F., Saul, A., Rondini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+high-throughput+method+to+evaluate+serum+bactericidal+activity+using+bacterial+ATP+measurement+as+survival+readout.">Development of a high-throughput method to evaluate serum bactericidal activity using bacterial ATP measurement as survival readout.</a> PLoS One. 12 (2), e0172163 (2017).</li><li>Riddle, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+a+candidate+bioconjugate+vaccine+against+Shigella+flexneri+2a+administered+to+healthy+adults:+a+single+blind,+randomized+phase+I+study.">Safety and immunogenicity of a candidate bioconjugate vaccine against Shigella flexneri 2a administered to healthy adults: a single blind, randomized phase I study.</a> Clinical and Vaccine Immunology. , (2016).</li><li>Shimanovich, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+Antigen-Specific+Serum+Antibody+Levels+as+Correlates+of+Protection+against+Shigellosis+in+a+Controlled+Human+Challenge+Study.">Functional and Antigen-Specific Serum Antibody Levels as Correlates of Protection against Shigellosis in a Controlled Human Challenge Study.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 24 (2), (2017).</li></ol>

R.W.K موظف حكومة الولايات المتحدة، وعلى هذا النحو الآراء التي أعرب عنها في هذا المنشور آراء المؤلفين ولا تعكس بالضرورة السياسة الرسمية أو موقف الإدارة من الجيش، ووزارة الدفاع، ولا حكومة الولايات المتحدة.

البروتوكول هو موضح هنا يدل مقايسة المناعية وظيفية لتقييم النشاط شيجيلاسيدال من الأجسام المضادة في المصل. وفي التحليل أظهر لهذا البروتوكول [مونوكلونل] محددة ل 3a فليكسنيري س. كانت تستخدم9 جنبا إلى جنب مع مراقبة الأمصال البشرية من لقاح دوسنتاريا سابقة دراسة11. مصدر المصل اختبارها في هذا التحليل قد تختلف على نطاق واسع من العينات الحيوانية قبل الإكلينيكية للعينات السريرية البشرية، والنشاط شيجيلاسيدال من عينة المصل سوف يتأثر بعمليات التحصين والتعرض التي قد تعرضت للفرد. ويمكن توقع بعض ه بين اللقاح وثيق الصلة، على وجه التحديد 2 أ . س. فليكسنيري و 3a فليكسنيري س. ولكن القليل ه فقد رأينا في هذه السلالات بالمقارنة مع سوني س.9. الأساس للترتيبات الاحتياطية يركز على تفعيل تتالي مكملاً بجسم مضاد-مستضد ملزمة. ولذلك، معالجة الكاشف BRC واحدة من العديد من الخطوات الحاسمة التي تشارك في تنفيذ هذا البروتوكول. واختير BRC لاستخدامها في هذا التحليل بسبب الأداء المتسق ومستويات منخفضة من NSK في أخرى فحوصات جراثيم12،،من1314.  نشاط BRC درجة الحرارة حساسة ويجب اتخاذ التدابير المناسبة لضمان أن تجميد ذوبان دورات إلى أدنى حد، أن BRC الكوتيد إلى وحدات تخزين تستخدم مرة واحدة، وأن مختبرين BRC هي مذاب بسرعة، مباشرة قبل استخدامها في التحليل. اتساق النشاط مكملاً سيؤثر إمكانية تكرار نتائج لهذا التحليل. آخر الخطوة الحاسمة التي تؤثر في إمكانية تكرار نتائج الفحص هو إنتاج وتمييع الأرصدة البكتيرية. من المهم أن قبل البدء التحليل المناسب تمييع الأرصدة البكتيرية مصممة، كنجاح التحليل هو اعتماداً على إنتاج متسقة من عناصر التحكم بوجود تهم زيمبابوي في المتوسط زيمبابوي ~ 120 كل بقعة. من أجل الحصول على النقاط التي يتم العد بالبرنامج، من المحتم أيضا أن الأسلوب المتبع للبكتيريا لوحة يتم تنفيذها بنجاح. الترسب الحل البكتيرية وآماله لوحة حيث أن البقع تشغيل ~ 2-3 سم أمر حاسم لإنتاج المستعمرات لتوزيع حجم الحق والصحيح لعد دقيق بالبرنامج لطيفة. إتقان كل هذه الخطوات سوف تكفل إنتاج نتائج دقيقة ومتسقة بموجب هذا البروتوكول
حتى عندما يتم تنفيذ جميع الخطوات الحاسمة قد تكون هناك أيضا حالات حيث من الضروري تعديل أو استكشاف أخطاء هذا البروتوكول. قد تتطلب إدخال تعديلات على هذا البروتوكول لتقييم أخرى البكتيريا الأمثل بين عشية وضحاها LBA لوحة حضانة درجة الحرارة، لضمان تشكيل المستعمرات الصغيرة. سلالات أخرى من بكتيريا أو جسم مصادر، عدا المصل، قد تتطلب التحسين تكملة التركيز. ينبغي أيضا رصد القيم NSK وكيس من الأمصال مراقبة للتأكد من أن يعمل المقايسة على نحو ملائم. لا ينبغي أن ترتفع NSK ما يزيد على 70 في المائة. كي تحكم لا ينبغي أن تختلف سيرا يعني أكثر من ± 2SD. لتحقيق نتائج ناجحة ومتناسقة عند استخدام هذا البروتوكول، أنه يلزم القيام بجميع الخطوات كما هو موضح هنا، مع إيلاء اهتمام خاص للخطوات الأساسية المشار إليها أعلاه.
حين يملأ هذا البروتوكول ضرورة هامة في مجتمع البحوث دوسنتاريا ، ليس دون القيود. هذا البروتوكول يعتمد على المواد البيولوجية، وذلك، سيتم دوماً بعض التغيرات التي من الصعب التحكم. التغيرات في نشاط مكمل من الكثير مختلفة ومن مصادر قد تساهم في تقلب في فحوصات. للتخفيف من هذا، من المهم معالجة مكملة بشكل مناسب واختبار الجديدة الكثير من تكملة للنشاط قبل الشراء. ربما من المفيد أيضا إنشاء مجمعات لتكملة الكثير مع نشاط معروف لديها إمدادات متجانسة. هذا البروتوكول هو بسيط بالتصميم ولا يتطلب أية معدات متخصصة ومستعمرة الآلي تعداد البرامج متاحة بحرية. بينما هذه البساطة ميزة، يتيح هذا البروتوكول لاستخدامها في أي مختبر، وأنها لا تزال تتطلب حضانة بين عشية وضحاها. وقد وصف الاختبارات الأخيرة التي شرط الحضانة أقصر كثيرا، ولكن تتطلب الكواشف المتخصصة، التحضيرية15. قيد آخر من هذا التحليل في شكله الحالي أنه فقط قادرة على التحقيق من أنواع بكتيرية واحد في وقت واحد. في ميدان دوسنتاريا وهناك رغبة في إنشاء لقاح متعددي، وبعد فحوصات المناعية التي يمكن تقييم مسببات الأمراض على نحو متعدد ذات قيمة كبيرة. يمكن تعديل هذا التحليل في المستقبل لتلبية هذه الحاجة، ولكن في شكله الحالي، مقايسة واحد-من نوع plex.
بينما هذا التحليل على بعض القيود، أنها لا تزال العديد من المزايا أكثر الأساليب الموجودة أو بديلة. وتشمل هذه المزايا العديد من التحسينات التي تتضافر لجعل تنفيذ هذا الأسلوب أقل بكثير من العمالة الكثيفة والفائق أكثر مما SBAs التقليدية. استخدام الأرصدة المجمدة البكتيرية، شكل الإنزيم لوحة 96، حسنا، الطلاء على أطباق بيتري مربعا أكبر، تلون المستعمرات التي تسمح لتصوير والتلقائية العد مستعمرة، كلها عوامل تساعد على تقليل المواد والوقت اللازم لإتمام هذا المقايسة. هذا التحليل أيضا بمزايا أكثر من غيرها من الأساليب الفائق نظراً لأنها لا تتطلب أي الكواشف المتخصصة أو المعدات. يمكن تنفيذ البروتوكول وصف مع الكواشف الأساسية والبرمجيات متاحة بحرية، والسماح لتطبيقه في أي وضع المختبر.
جميع المزايا التي ينص هذا البروتوكول تدعم استخدامه في العديد من التحقيقات مستقبلا. المقايسة يعتبر مثاليا لدراسة الاستجابات المناعية بعد العدوى الطبيعية أو التطعيم. هذا التطبيق يسمح للترتيبات الاحتياطية لتكون أداة قيمة في بحوث اللقاحات دوسنتاريا وتم بالفعل استخدام تقييم الاستمناع اللقاح في اللقاحات الحيوية-المتقارن دوسنتاريا حيث قد برهن على قدرة هذه اللقاحات إلى الحث على إنتاج أجسام مضادة الوظيفية16. هذا البروتوكول قد تم اختبارها على نطاق واسع بمختبرات متعددة، وقد ثبت أن تنتج نتائج يمكن الاعتماد عليها، واستنساخه9. هذا البروتوكول كما تنتج نتائج مماثلة عندما يتم اختبار عينات نفس استخدام فحوصات جراثيم أخرى17. الاتساق في البيانات التي تولدها هذه المقايسة، وتوافقها مع غيرها من الأساليب القديمة يجعلها أداة قوية لتقييم دقة نشاط جراثيم في عينات مصل الدم. المقايسة بسهولة كما يمكن تكييفها لتقييم أنواع عينة إضافية. بينما المصل متاحة بسهولة في التجارب السريرية الكبار، يمكن أن يكون من الصعب الحصول على مصل كافية في المحاكمات التي تركز على الأطفال الرضع والأطفال الصغار؛ أحد السكان المستهدفين في نهاية المطاف للقاحات دوسنتاريا . في هذه المحاكمات، التي تم جمعها في ورقة تصفية الدم كله بشكل روتيني والمجففة. وقد أحرز بعض النجاح الأولية مع هذا النوع من نموذج تنسيق استخدام الترتيبات الاحتياطية. بالإضافة إلى الدم كله، عينات الأغشية المخاطية (مثل اللعاب ومقتطفات البراز والبول) هي أيضا هدفا ذات الصلة في بحوث اللقاحات دوسنتاريا . حاليا، وقد تم تقييم هذا البروتوكول لثلاثة من اللقاح ذات الصلة سريرياً أكثر من دوسنتاريا ولكن أيضا يمكن تكييفها ل spp. دوسنتاريا الإضافية، فضلا عن غيرها من مسببات الأمراض البكتيرية. الأعمال المقبلة ستركز على إنتاج مقايسة متعدد مع العديد من نفس خصائص الإنزيم الموصوفة بموجب هذا البروتوكول. سوف تسمح تحليل متعدد لتقييم متعددة دوسنتاريا اللقاح في وقت واحد، كذلك المحافظة على حجم العينة والأيدي في وقت الفحص. وهناك أيضا أعمال جارية لنقل هذا التحليل في المختبرات عبر أنحاء العالم. هذه التقييمات العالمية سوف تولد المزيد من البيانات نحو تأهيل مقايسة على نطاق بحث أكبر، بينما في الوقت نفسه زيادة عدد مختبرات علم الأحياء الدقيقة وعلم المناعة التي يمكنها الوصول إلى هذه الترتيبات الاحتياطية لتقييم البكتيريا والمصل عينات التي تم جمعها من مواقع مختلفة في المستوطنة. الفحص الموصوفة هنا بسيط والفائق ولديه القدرة على تحسين تقييم المناعية في الميدان دوسنتاريا ، فضلا عن تطبيقات أوسع لتقييم مسببات الأمراض البكتيرية الأخرى.

اللقاح دوسنتاريا و 2a فليكسنيري دوسنتاريا 3a فليكسنيري س. س. سوني، تبين انتشار الأوبئة على الصعيد العالمي. أمراض الإسهال الناجمة عن هذه دوسنتاريا أنواع الآثار العسكرية، المسافرين1، وهو سبب الرئيسي للوفاة الإسهال بين الأطفال دون سن الخامسة في البلدان النامية2. لا يوجد حاليا أي لقاح المرخصة لحماية ضد دوسنتاريا، بيد أن هناك اللقاحات المتعددة في مختلف مراحل التنمية. العديد من هذه اللقاحات، وتدابير وقائية أخرى حاليا في التنمية، والتركيز على الأجسام المضادة التي أنتجها ضد دوسنتاريا lipopolysaccharide (LPS). لبس مرشح لقاح جذابة لأنها سطح مستضد رئيسية والعدوى الطبيعية مع دوسنتاريا الحث على لبس حدة الأجسام المضادة التي يمكن أن تكون وقائية ضد إعادة العدوى بطريقة النمط المصلي المسيطر على حدة. ولذلك، سوف تحتاج لقاح دوسنتاريا ناجحة المحتمل بالينت متعددة والهدف 3-4 دوسنتاريا اللقاح للحث على الحصانة ضد 70-80% على الصعيد العالمي تعميم سلالات3،4، 5 , 6-وهذا يتطلب أن فحوصات لتقييم المرشحين لقاح دوسنتاريا تكون محددة للقاح مختلفة متعددة.
فحوصات مناعية الحالية لتقييم المرشحين لقاح التركيز على قياس مستويات الأجسام المضادة التتر، ولكن هناك فحوصات جيدة تتسم قليلة لتقييم الوظيفية الأجسام المضادة. دراسة القدرة الوظيفية جسم مهم لأن الممرض أجسام مضادة محددة المسؤولة عن مكافحة العدوى من خلال عدد من الآليات الوظيفية بما في ذلك ملزم البكتيريا المستضدات السطحية، ومنع التصاق إلى و عدوى خلايا الظهارية، واستهداف الخلايا البكتيرية أو أوبسونيزاتيون والبلعمه، وقتل مسببات الأمراض مباشرة ملزمة والشروع في سلسلة مكملة. قتل البكتيريا بالأجسام المضادة المباشرة يحدث عند الأجسام المضادة لربط المكونات السطحية من البكتيريا المستهدفة والشروع في تتالي تكملة مما يؤدي إلى تفعيل العديد من زيموجينس أن في نهاية المطاف نتيجة في تشكيل المسام في البكتيريا الخلية التي يسبب الوفاة تحلل والبكتيريا. قد يكون هذا القتل المباشر للبكتيريا بتعميم الأجسام المضادة وتكملة خط دفاع مبكرة حاسمة أثناء الإصابة.
الأفراد الذين يصابون بطبيعة الحال أن الأجسام المضادة مع النشاط شيجيلاسيدال بهم سيرا. تم الكشف عن هذه الأجسام محددة دوسنتاريا-قتل مكملاً بوساطة التقليدية باستخدام فحوصات 7،8. يشير هذا إلى أنه قد يكون هناك دور للأجسام المضادة جراثيم في الحماية ضد دوسنتاريا. فحوصات جراثيم التقليدية بسيطة في تنفيذها: المصل إبطال الحرارة (لتدمير النشاط مكملاً الذاتية) ومختلطة مع البكتيريا للفائدة. تكملة خارجية تضاف إلى هذا الخليط بتركيز معين. خليط رد فعل المحتضنة للسماح لقتل البكتيريا وثم مطلي بتأكيد الوحدات المكونة للمستعمرة (كفوس). حالما يتم عد كفوس، يمكن حساب مؤشر لقتل 50 ٪ (كي) وتحدد عيار الترتيبات الاحتياطية. في حين أن هذا الإجراء بسيط نسبيا، يمكن أن تكون هذه الاختبارات ذات العمالة الكثيفة وتستغرق وقتاً طويلاً لتنفيذ ويمكن أن تكون النتائج اختلافاً كبيرا. وبالإضافة إلى هذه القيود، لا الاختبارات الوظيفية تتسم أيضا موجودة حاليا ل دوسنتاريا. ولذلك، نحن بنجاح وضع والمؤهلين مقايسة بسيطة، الفائق لقياس نشاط جراثيم دوسنتاريا لثلاثة من السلالات ذات الصلة سريرياً أكثر9. ويصف هذا البروتوكول الترتيبات الاحتياطية مع التعديلات التي تعمل على تحسين كفاءة المقايسة وإمكانية تكرار نتائج. وأول هذه التعديلات هو استخدام الأرصدة المجمدة البكتيرية. إنتاج مخزون استخدام واحد يلغي الحاجة إلى ثقافة جديدة البكتيريا لفحص كل حين أيضا على الحد من تقلب المقايسة للمقايسة. آخر وقت والعمل توفير الاستفادة من هذا البروتوكول هو استخدام صيغة المقايسة لوحة 96-جيدا. هذا يسمح لتمييع المسلسل عينات من حيث أنه يمكن أن يكون اختبار مجموعة من التركيزات.  كما أنه يسمح لاستخدام الممصات متعددة القنوات لطلاء عينات مربعة بيتري الأطباق. عند هذه الأطباق بيتري مربعة تستخدم بالاقتران مع نظام ثقافة التي تنتج مستعمرات صغيرة، هو تخفيض عدد لوحات أجار المطلوبة للفحص. وهذا، بالاقتران مع البرمجيات المتاحة بحرية عد مستعمرة، وضعت أصلاً أوبسونوفاجوسيتيك متعدد المكوّرات الرئوية مما أسفر عن مصرع10من المقايسة (موبا)، يسمح للتعداد مستعمرة السريع والآلي، ويمكن الاعتماد عليها. كل هذه التحسينات تقلل وقت الفحص العملي، وخلق نظام الفائق للسماح بلوحات متعددة ليتم تشغيلها في وقت واحد.
في حين تم تحسين هذا البروتوكول لثلاثة من اللقاح ذات الصلة سريرياً أكثر من دوسنتاريا، وصف الترتيبات الاحتياطية هنا يمكن تطبيقها بسهولة على العديد من مسببات الأمراض البكتيرية الأخرى. بالإضافة إلى إمكانية استخدام هذا البروتوكول مع البكتيريا الأخرى، هذا البروتوكول لديه إمكانات للتوسع خارج استخدام مصل فقط كمادة بدء، التي يمكن أن تشمل تحليل الأجسام المضادة في أنواع العينة ذات الصلة الأخرى مثل عينات الأغشية المخاطية، بما في ذلك عينات البراز واللعاب. استخدام هذا الفحص للتحقيق في الاستجابات المناعية بعد التطعيم قد يعطي أوسع نطاقا من التبصر في الاستجابات المناعية المتولدة عن طريق التلقيح مما يؤدي إلى التصميم العقلاني للقاحات، والمساعدة في فهم الحصانة الطبيعية كيف يتطور.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9391</td>
			<td>Type B, powder, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTC (2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8877</td>
			<td>&#8805;98.0% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>&#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baby Rabbit Complement</td>
			<td>PelFreez</td>
			<td>31061-3</td>
			<td>3-4 week old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS with Ca2+/Mg2+</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14065-56</td>
			<td>Without Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar (Lennox)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2897</td>
			<td>Powder microbial growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td>Powdered, (C12H18O9)n</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td>For molecular biology, &#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3022</td>
			<td>Powder microbial growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Petri Dish</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z617679-240EA</td>
			<td>120 mm x 120 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3799</td>
			<td>96 well u-bottom plate with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NICE Software</td>
			<td>University of Alabama at Birmingham</td>
			<td></td>
			<td>ftp://ftp.nist.gov/pub/physics/mlclarke/NICE/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput shigella-specific bactericidal assay

فحوصات جراثيم المصل (SBAs) قياس النشاط الوظيفي للأجسام المضادة، وقد استخدمت على مدى عقود عديدة. قياس SBAs مباشرة النشاط قتل جسم بتقييم قدرة الأجسام المضادة في مصل الدم ربط للبكتيريا وتنشيط تكملة. هذا التنشيط تكملة النتائج بتحلل وقتل البكتيريا المستهدفة. هذه الاختبارات قيمة نظراً لأنها تتجاوز التحديد الكمي لإنتاج الأجسام المضادة توضيح الوظائف البيولوجية أن هذه الأجسام المضادة لها، السماح للباحثين بدراسة الدور الذي قد تؤديه الأجسام المضادة في الوقاية من الإصابة. SBAs قد استخدمت لدراسة الاستجابات المناعية للعديد من مسببات الأمراض البشرية، ولكن هناك لا منهجية مقبولة على نطاق واسع دوسنتاريا في الوقت الحاضر. تاريخيا، قد تم SBAs جداً ذات العمالة الكثيفة، التي تتطلب الكثير من الخطوات تستغرق وقتاً طويلاً لدقة قياس البكتيريا الباقين على قيد الحياة. ويصف هذا البروتوكول بسيطة وقوية، والفائق الاعتداء أن الأجسام المضادة الفنية تدابير محددة دوسنتاريا في مصل الدم في المختبر. الأسلوب الموصوفة هنا يوفر مزايا عديدة أكثر SBAs التقليدية، بما في ذلك استخدام الأرصدة المجمدة البكتيرية، 96 الاعتداء أيضا لوحات والنظام الجزئي-الثقافة ومستعمرة-العد الآلي. جميع هذه التعديلات جعل هذا التحليل أقل كثيفة العمالة وأكثر الفائق. هذا البروتوكول أبسط وأسرع لأداء من SBAs التقليدية في حين لا تزال تستخدم تكنولوجيات بسيطة والكاشفات متاحة بسهولة. البروتوكول قد طبق بنجاح في مختبرات مستقلة متعددة والمقايسة قوي وقابل لإعادة الإنتاج. يمكن استخدامها في التحليل لتقييم الاستجابات المناعية في الدراسات ما قبل السريرية وكذلك السريرية. التحديد الكمي التتر جسم شيجيلاسيدال سواء قبل أو بعد التعرض للمستضد (أما عن طريق التحصين أو العدوى) يسمح لفهم أوسع لجسم الوظيفية كيف يتم إنشاء استجابات ومساهمتها في الحصانة الواقية. تطور هذا النظام الموحد، قد ييسر كثيرا والرزن جيدا يتميز تصميم لقاح دوسنتاريا .

يظهر تخطيط لوحة 96-كذلك تستخدم في مقايسة نموذجية في الجدول 1- هذا التخطيط بابار مراقبة تكملة النشطة (التحكم ب) وآبار مراقبة تكملة إبطال الحرارة (التحكم) وخمس عينات مكررة. التسلسل هي تضعف عينات 3-fold أعلى اللوحة من "ح صف" صف السماح لتخفيف 8 لكل عينة لفحصها في وقت واحد. ويبين الشكل 1 عامين LBA لوحات بعد إضافة الاحتضان وتراكب بين عشية وضحاها. وقد حدث تطور اللون وجميع المستعمرات الباقين على قيد الحياة تظهر باللون الأحمر. قتل البكتيرية ينظر بشكل واضح لجميع عينات اختبار في تخفيف الثلاثة الأولى (الصفوف وح) وهي تضعف عينات أخرى حتى اللوحة، انخفاضا في قتل البكتيريا يعتبر المصل التي يتركز فيها أقل. واجهة البرنامج جميلة يتبين في الشكل 2. يمكن رؤية التهم الصغرى-مستعمرة من البرنامج الجميل في الشكل 3، وقد نظمت هذه التهم في الجدول 2. ويحسب متوسط عدد زيمبابوي لكل تمييع كل عينة ويتم حساب قيمة كي 50% في الجدول 3. يمكن تطبيق هذه القيمة كي 50% إلى كفوس متوسط لكل تخفيف المصل لتحديد القيم المطلوبة لحساب كي سباعي وفقا للصيغة المبينة في الشكل 4. النتيجة النهائية للمقايسة يرد في الجدول 4.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>6</td>
			<td>7</td>
			<td>8</td>
			<td>9</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
			<td>12</td>
		</tr>
<tr>
<td>A</td>
			<td>التحكم A</td>
			<td>التحكم ب</td>
			<td>تخفيف 8</td>
			<td>تخفيف 8</td>
			<td>تخفيف 8</td>
			<td>تخفيف 8</td>
			<td>تخفيف 8</td>
			<td>تخفيف 8</td>
			<td>تخفيف 8</td>
			<td>تخفيف 8</td>
			<td>تخفيف 8</td>
			<td>تخفيف 8</td>
		</tr>
<tr>
<td>ب</td>
			<td>التحكم A</td>
			<td>التحكم ب</td>
			<td>تمييع 7</td>
			<td>تمييع 7</td>
			<td>تمييع 7</td>
			<td>تمييع 7</td>
			<td>تمييع 7</td>
			<td>تمييع 7</td>
			<td>تمييع 7</td>
			<td>تمييع 7</td>
			<td>تمييع 7</td>
			<td>تمييع 7</td>
		</tr>
<tr>
<td>ج</td>
			<td>التحكم A</td>
			<td>التحكم ب</td>
			<td>تمييع 6</td>
			<td>تمييع 6</td>
			<td>تمييع 6</td>
			<td>تمييع 6</td>
			<td>تمييع 6</td>
			<td>تمييع 6</td>
			<td>تمييع 6</td>
			<td>تمييع 6</td>
			<td>تمييع 6</td>
			<td>تمييع 6</td>
		</tr>
<tr>
<td>د</td>
			<td>التحكم A</td>
			<td>التحكم ب</td>
			<td>تمييع 5</td>
			<td>تمييع 5</td>
			<td>تمييع 5</td>
			<td>تمييع 5</td>
			<td>تمييع 5</td>
			<td>تمييع 5</td>
			<td>تمييع 5</td>
			<td>تمييع 5</td>
			<td>تمييع 5</td>
			<td>تمييع 5</td>
		</tr>
<tr>
<td>ه</td>
			<td>التحكم A</td>
			<td>التحكم ب</td>
			<td>تمييع 4</td>
			<td>تمييع 4</td>
			<td>تمييع 4</td>
			<td>تمييع 4</td>
			<td>تمييع 4</td>
			<td>تمييع 4</td>
			<td>تمييع 4</td>
			<td>تمييع 4</td>
			<td>تمييع 4</td>
			<td>تمييع 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>و</td>
			<td>التحكم A</td>
			<td>التحكم ب</td>
			<td>تمييع 3</td>
			<td>تمييع 3</td>
			<td>تمييع 3</td>
			<td>تمييع 3</td>
			<td>تمييع 3</td>
			<td>تمييع 3</td>
			<td>تمييع 3</td>
			<td>تمييع 3</td>
			<td>تمييع 3</td>
			<td>تمييع 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>ز</td>
			<td>التحكم A</td>
			<td>التحكم ب</td>
			<td>تمييع 2</td>
			<td>تمييع 2</td>
			<td>تمييع 2</td>
			<td>تمييع 2</td>
			<td>تمييع 2</td>
			<td>تمييع 2</td>
			<td>تمييع 2</td>
			<td>تمييع 2</td>
			<td>تمييع 2</td>
			<td>تمييع 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>ح</td>
			<td>التحكم A</td>
			<td>التحكم ب</td>
			<td>تمييع 1</td>
			<td>تمييع 1</td>
			<td>تمييع 1</td>
			<td>تمييع 1</td>
			<td>تمييع 1</td>
			<td>تمييع 1</td>
			<td>تمييع 1</td>
			<td>تمييع 1</td>
			<td>تمييع 1</td>
			<td>تمييع 1</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">عينة 1</td>
			<td colspan="2">عينة 2</td>
			<td colspan="2">نموذج 3</td>
			<td colspan="2">نموذج 4</td>
			<td colspan="2">نموذج 5</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 1: تخطيط لوحة الإنزيم. العمودين 1 و 2 تحتوي على آبار مراقبة مكملة. التحكم الموجود في العمود 1 ويتم إلغاء تنشيطه الحرارة تكمل التحكم، الذي يحتوي على المخزن المؤقت للترتيبات الاحتياطية والبكتيريا وتكملة إبطال الحرارة. التحكم ب يقع في العمود 2 والنشط يكمل السيطرة، الذي يحتوي على المخزن المؤقت سباعي، والبكتيريا، وتكملة. تحتوي الأعمدة 3-12 على عينات المصل. كل عينة يتم تشغيل المكررة ومتسلسل المخفف 3-fold من صف ح للصف أ
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59164/59164fig1.jpg"> رقم 1: لوحات LBA بعد وضع اللون. الممثل فليكسنيري س. 3a البكتيرية الدقيقة-المستعمرات قد نمت بين عشية وضحاها إلى الحجم المناسب. تم إضافة تراكب أجار والمستعمرات قد وضعتها لون أحمر للحد مجمع عقاري في أجار تراكب. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59164/59164fig1large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59164/59164fig2.jpg"> رقم 2: NIST العداد مستعمرة المتكاملة (نيس) واجهة البرنامج- تمثيل رسومي لواجهة البرنامج جميلة. المناطق ذات الاهتمام (رويس) تتركز على المستعمرات لكل بقعة قبل فرز الأصوات. يمكن تصدير بيانات مباشرة من نافذة لطيفة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59164/59164fig2large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59164/59164fig3.jpg"> الشكل 3: LBA اللوحات البرمجيات لطيفة الأصوات التي تم فرزها في. يتم تحميل صور فوتوغرافية ملونة في برامج جميلة ومستعمرة تشكيل وحدات (كفوس) يتم حسابها تلقائياً. هذه الصورة يبين اثنين من لوحات LBA الممثل مع معلوماتهم العد مستعمرة. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59164/59164fig3large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>185</td>
			<td>167</td>
			<td>145</td>
			<td>151</td>
			<td>122</td>
			<td>134</td>
			<td>119</td>
			<td>142</td>
			<td>124</td>
			<td>115</td>
			<td>113</td>
			<td>123</td>
			<td>1:17496</td>
			<td>تخفيف 8</td>
		</tr>
<tr>
<td>186</td>
			<td>152</td>
			<td>145</td>
			<td>138</td>
			<td>132</td>
			<td>135</td>
			<td>108</td>
			<td>116</td>
			<td>100</td>
			<td>119</td>
			<td>105</td>
			<td>109</td>
			<td>1:5832</td>
			<td>تمييع 7</td>
		</tr>
<tr>
<td>179</td>
			<td>160</td>
			<td>145</td>
			<td>135</td>
			<td>109</td>
			<td>120</td>
			<td>54</td>
			<td>55</td>
			<td>71</td>
			<td>75</td>
			<td>79</td>
			<td>89</td>
			<td>1:1944</td>
			<td>تمييع 6</td>
		</tr>
<tr>
<td>193</td>
			<td>153</td>
			<td>146</td>
			<td>138</td>
			<td>87</td>
			<td>105</td>
			<td>5</td>
			<td>6</td>
			<td>6</td>
			<td>9</td>
			<td>19</td>
			<td>30</td>
			<td>1:648</td>
			<td>تمييع 5</td>
		</tr>
<tr>
<td>184</td>
			<td>129</td>
			<td>121</td>
			<td>143</td>
			<td>6</td>
			<td>7</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1:216</td>
			<td>تمييع 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>180</td>
			<td>145</td>
			<td>22</td>
			<td>24</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>1:72</td>
			<td>تمييع 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>207</td>
			<td>129</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>4</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>01:24</td>
			<td>تمييع 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>201</td>
			<td>140</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>1:8</td>
			<td>تمييع 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>التحكم A</td>
			<td>التحكم ب</td>
			<td colspan="2">عينة 1</td>
			<td colspan="2">عينة 2</td>
			<td colspan="2">نموذج 3</td>
			<td colspan="2">نموذج 4</td>
			<td colspan="2">نموذج 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 2: عدد مستعمرات البكتيرية. يتم تصدير التهم زيمبابوي من البرنامج الجميل إلى excel في تنسيق. ويمكن ترتيب هذه التهم إلى جدول يبين البكتيرية التهم لجميع عينات مكررة ومراقبة الآبار.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>التحكم A</td>
			<td>التحكم ب</td>
			<td>148</td>
			<td>128</td>
			<td>131</td>
			<td>120</td>
			<td>118</td>
			<td>1:17496</td>
			<td>تخفيف 8</td>
		</tr>
<tr>
<td>189</td>
			<td>147</td>
			<td>142</td>
			<td>134</td>
			<td>112</td>
			<td>110</td>
			<td>107</td>
			<td>1:5832</td>
			<td>تمييع 7</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">NSK (1-كترب/كترا): 22%</td>
			<td>140</td>
			<td>115</td>
			<td>55</td>
			<td>73</td>
			<td>84</td>
			<td>1:1944</td>
			<td>تمييع 6</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">كي 50% (كترب/2): 73</td>
			<td>142</td>
			<td>96</td>
			<td>6</td>
			<td>8</td>
			<td>25</td>
			<td>1:648</td>
			<td>تمييع 5</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>132</td>
			<td>7</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1:216</td>
			<td>تمييع 4</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>23</td>
			<td>3</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>1:72</td>
			<td>تمييع 3</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>01:24</td>
			<td>تمييع 2</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>4</td>
			<td>1:8</td>
			<td>تمييع 1</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>عينة 1</td>
			<td>عينة 2</td>
			<td>نموذج 3</td>
			<td>نموذج 4</td>
			<td>نموذج 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 3: حساب القيمة استقطاع كي 50% ومتوسطات عينة مكررة. تم حساب قيمة استقطاع كي 50% بأخذ متوسط جميع "ب مراقبة" الآبار والقسمة على 2. حسبت المتوسطات للتكرارات لكل تمييع كل عينة التي تم تشغيلها في التكرارات. يتم أيضا حساب قيمة NSK.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59164/59164fig4.jpg"> الشكل 4: التخطيطي للاستيفاء الخطي. رسم العدد من البكتيريا الباقين على قيد الحياة (المحور الصادي) في إضعاف كل من المصل اختبار (س) (الماس الأسود)، ونقاط فردية ترتبط بخط أسود متقطع ورقيقة. خطوط أفقية صلبة ومتقطع تشير إلى 0% و 50% مما أسفر عن مصرع، على التوالي. تخفيف المصل أعلاه (5 إضعاف) وأدناه (4 إضعاف) 50% مما أسفر عن مصرع الخط متصلاً بخط أحمر، وهو مبين جراثيم عيار (كي). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59164/59164fig4large.jpg" target="_blank">الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الرقم-</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>كي سباعي</td>
		</tr>
<tr>
<td>عينة 1</td>
			<td>72</td>
		</tr>
<tr>
<td>عينة 2</td>
			<td>216</td>
		</tr>
<tr>
<td>نموذج 3</td>
			<td>1994</td>
		</tr>
<tr>
<td>نموذج 4</td>
			<td>1994</td>
		</tr>
<tr>
<td>نموذج 5</td>
			<td>648</td>
		</tr>
</tbody></table>الجدول 4: سباعي النتائج تظهر جراثيم عيار (كي)- ترد القيم النهائية كي سباعي وقد حددت لكل عينة. يتم حساب هذه القيم باستخدام كفوس متوسط، وقيمة استقطاع كي 50%، والصيغة الخطية الاستيفاء.

Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay at JoVE.com

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

نقدم هنا بروتوكولا لقياس النشاط شيجيلاسيدال من الأجسام المضادة في المصل. مصل الدم يختلط بالبكتيريا وتكملة خارجية، المحتضنة، وهو مطلي بالخليط رد فعل على ألواح أجار. وتشكل البكتيريا قادرة على البقاء المستعمرات التي يتم حسابها باستخدام عداد الآلي مستعمرة، ويستخدم لتحديد عيار جراثيم.

الفائق دوسنتاريا-مقايسة جراثيم معينة

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

يفتقر مجال بحوث شيغيلا حالياً إلى مقايسات محددة جيداً لدراسة الدور الوظيفي للأجسام المضادة التي يولدها التحصين أو العدوى. يمثل هذا الفحص طريقة محددة بشكل جيد لتأهيل هذه الاستجابات المناعية وقياس النشاط المبيد للجراثيم من الأجسام المضادة المحددة Shigella. والميزة الرئيسية لهذا الفحص هو أنه يسمح لتحليل الإنتاجية العالية من عينات متعددة.التقنيات المستخدمة في هذا البروتوكول تقلل إلى حد كبير التدريب العملي على الوقت وعموما الوقت لقياس القتل البكتيري المباشر من الأجسام المضادة وعينات المصل. للبدء، احتضان العينات في حمام الماء الدافئ في 56 درجة مئوية لمدة 30 دقيقة لتسخين وتنشيط عينات الاختبار. الحصول على لوحة المقايسة و 20 ميكرولترات من المخزن المؤقت للماساي إلى أعمدة واحد من خلال اثني عشر من الصفوف ألف من خلال G.Add 20 microliters من المخزن المؤقت للماحصة إلى أعمدة واحد واثنين من الصف H.Load 30 ميكرولترات من كل عينة اختبار وتكرارها إلى الصف H من لوحة المقايسة.للبدء في تنفيذ عمليات تخفيف تسلسلية ثلاثية العينات من اختبار، استخدام ماصة متعددة القنوات لإزالة 10 ميكرولترات من الآبار 3H من خلال 12H. نقل العينات إلى الآبار المقابلة في الصف G والماصات صعودا وهبوطا 8 إلى 10 مرات لخلط العينة جيدا. ثم، إزالة 10 ميكرولترers من هذه الآبار.نقل إلى الآبار المقابلة في الصف F والماصات صعودا وهبوطا 8 إلى 10 مرات لخلط. مواصلة هذه العملية التخفيف المسلسل من خلال الصف A.After خلط الآبار في الصف A، وإزالة وتجاهل 10 ميكرولترات من الآبار 3A من خلال 12A بحيث يكون حجم النهائي في جميع الآبار هو 20 ميكرولترات. استرداد قارورة واحدة من المخزون البكتيري الهدف المجمدة وذوبان في درجة حرارة الغرفة.ثم، تمييع البكتيريا في 20 ملليلتر من العازلة المقايسة. وفقا ل العامل المخفف الأمثل المحدد سلفا. باستخدام ماصة متعددة القنوات، إضافة 10 ميكرولترات من البكتيريا المخففة إلى كل بئر من لوحة المقايسة.استرداد قارورة واحدة من الطفل الأرنب المجمدة مجاملة وقارورة واحدة من الحرارة المجمدة تنشيط BRC. استخدام المياه الجارية الباردة لإذابة قنينات إلى درجة حرارة الغرفة. ثم، مزيج 100 ميكرولترات من الحرارة تنشيط BRC مع 400 ميكرولترات من المخزن المؤقت المقايسة.إضافة 50 ميكرولترات من هذا 20 في المئة الحرارة تنشيط BRC حل لجميع الآبار في العمود الأول. مزيج ملليلتر واحد من BRC الأصلي مع أربعة ملليلتر من المخزن المؤقت للمقايسة. إضافة 50 ميكرولترات من هذا الخليط 20 في المئة إلى جميع الآبار في الأعمدة من اثنين إلى اثني عشر.وضع لوحة واحدة من لوحة شاكر لمدة 10 إلى 15 ثانية لخلط بلطف لوحة المقايسة. احتضان لوحة المقايسة في حاضنة الميكروبيولوجية لمدة ساعتين. وفي الوقت نفسه، إزالة الأغطية من اثنين من لوحات LB أغار ووضع لوحات الوجه في خزانة السلامة البيولوجية لمدة 40 إلى 60 دقيقة لتجف.عندما تكتمل الحضانة، قم بنقل صفيحة المقايسة إلى الثلج الرطب واحتضان لمدة 10 إلى 20 دقيقة لوقف التفاعل. باستخدام ماصة قناة اثني عشر، مزيج الآبار في الصف H ولوحة بقعة 10 ميكرولترات من خليط التفاعل على الجزء السفلي من لوحة LBA. إمالة على الفور لوحة والسماح للبقع لتشغيل لحوالي 1.5 إلى 2 سم.كرر هذا الإجراء للصفوف G و F و E، واكتشافها فوق الصف السابق. احتضان لوحات LBA في درجة حرارة الغرفة حتى يتم امتصاص الحل في لوحات LBA. ثم، وضع الأغطية على لوحات ونقلها رأسا على عقب إلى حاضنة الميكروبيولوجية لاحتضان بين عشية وضحاها.في اليوم التالي، إضافة 25 ملليلتر من تراكب أغار في 55 درجة مئوية، تحتوي على 100 ميكروغرام لكل ملليلتر TTC و 0.1 في المئة أزيد الصوديوم إلى كل لوحة LBA. احتضان في 37 درجة مئوية لمدة ساعتين للسماح للسماح للبكتيريا على قيد الحياة لتطوير لون أحمر. ثم استخدم كاميرا رقمية لتصوير اللوحات.نقل الصور إلى جهاز كمبيوتر واستخدام برنامج تعداد المستعمرة المتكاملة من NIST لتحليل الصور كما هو موضح في بروتوكول النص. تظهر لوحات LBA التمثيلية أن تطور اللون قد حدث بعد الحضانة الليلية وإضافة التراكب ، مع رؤية جميع المستعمرات الباقية باللون الأحمر. وينظر بوضوح القتل البكتيري لجميع العينات التي تم اختبارها في أول ثلاثة dilutions.وينظر إلى انخفاض في القتل البكتيري كما يتم تخفيف العينات مزيد من أعلى لوحة والمصل هو أقل تركيزا. ثم يتم تنفيذ عمليات حساب الكولكون الدقيقة باستخدام برنامج NIST. ثم يتم حساب متوسط عدد CFU لكل تخفيف لكل عينة، كما هو قيمة القتل 50 في المئة.ثم يتم تطبيق هذه القيمة القاتلة بنسبة 50 في المائة على متوسط وحدات CFUs لكل تخفيف للمصل لتحديد القيم اللازمة لحساب SBA KI. يعتمد هذا البروتوكول على طلاء بكتيري متناسق وموحد على LB Auger. وسوف تسمح جيدة طلاء بقعة وتقنية إمالة لنمو ميكروكولوس منفصلة ودقيقة عد مستعمرة. هذه التقنية يستخدم الشيغيلا حية وهدّي ويتطلب تقنية ااولة السليمة وPPE لضمان البكتيريا يتم التعامل معها بأمان وفقا لإجراءات BSL 2.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

الكمية عالي الإنتاجية الفحص السمسة وحيدة الخلية لخلايا T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

فحص فينوطيبيك مجهري للقياس الكمي للبكتيريا الفطرية داخل الخلايا المكيفة للفحص عالي الإنتاجية/عالي المحتوى

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

عالية الإنتاجية الفحص إلى النمط الظاهري<em&gt; السالمونيلا الملهبة لل</em&gt; جمعية التيفية الفأرية، والغزو، والنسخ المتماثل في الضامة

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

عالية الإنتاجية الكمي في الوقت الحقيقي RT-PCR الفحص لتحديد ملامح التعبير من أنواع الأول والثالث الانترفيرون الأنواع الفرعية

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

الإنتاجية العالية جين توصيف في<em&gt; المثقبية البروسية</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

كشف الإنتاجية العالية للجهاز التنفسي مسببات الأمراض في العينات الحيوانية التي كتبها النانو PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

ومضان القائم على الخلايا الليمفاوية الفحص مناسبة لفحص إنتاجية عالية من الجزيئات الصغيرة

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

وإنتاجية عالية الفحص المدعم لتقييم فعالية الدواء ضد بلعم Passaged<em&gt; المتفطرة السلية</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

الخلية الحرة البيوكيميائية المقايسة الانزيمية فلوروميتريك لقياس الفائق وبيروكسيد في البروتين الدهني العالي الكثافة

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

الفائق، والمحتوى السامي، المستندة إلى سائل C. ايليجانس باثوسيستيم

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...