Name: a high-throughput shigella-specific bactericidal assay
Uploaded: 2019-02-27T14:00:00
Duration: 6 min 11 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay at JoVE.com

עבודה זו מומן על ידי מענק של נתיב כדי M.H.N. מחקר זה נערך מחקר שיתופי, הסכם פיתוח בין את וולטר ריד צבא במכון למחקר אוניברסיטת אלבמה בבירמינגהם.

<ol>
	<li>Riddle, M. S., Sanders, J. W., Putnam, S. D., Tribble, D. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Incidence,+etiology,+and+impact+of+diarrhea+among+long-term+travelers+(US+military+and+similar+populations):+a+systematic+review.">Incidence, etiology, and impact of diarrhea among long-term travelers (US military and similar populations): a systematic review.</a> The American Journal of Tropical Medicine and Hygiene. 74 (5), 891-900 (2006).</li><li>Tickell, K. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+management+of+Shigella+infection+in+children+with+diarrhoea:+a+systematic+review+and+meta-analysis.">Identification and management of Shigella infection in children with diarrhoea: a systematic review and meta-analysis.</a> The Lancet Global Health. 5 (12), e1235-e1248 (2017).</li><li>Livio, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shigella+isolates+from+the+global+enteric+multicenter+study+inform+vaccine+development.">Shigella isolates from the global enteric multicenter study inform vaccine development.</a> Clinical Infectious Diseases. 59 (7), 933-941 (2014).</li><li>Barry, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+and+pitfalls+in+Shigella+vaccine+research.">Progress and pitfalls in Shigella vaccine research.</a> Nature Reviews Gastroenterology &amp; Hepatology. 10 (4), 245-255 (2013).</li><li>Noriega, F. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Strategy+for+cross-protection+among+Shigella+flexneri+serotypes.">Strategy for cross-protection among Shigella flexneri serotypes.</a> Infection and Immunity. 67 (2), 782-788 (1999).</li><li>Levine, M. M., Kotloff, K. L., Barry, E. M., Pasetti, M. F., Sztein, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Clinical+trials+of+Shigella+vaccines:+two+steps+forward+and+one+step+back+on+a+long,+hard+road.">Clinical trials of Shigella vaccines: two steps forward and one step back on a long, hard road.</a> Nature Reviews Microbiology. 5 (7), 540-553 (2007).</li><li>Sayem, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+host+immune+responses+to+epidemic+and+endemic+strains+of+Shigella+dysenteriae+type+I.">Differential host immune responses to epidemic and endemic strains of Shigella dysenteriae type I.</a> Journal of Health Population and Nutrition. 29 (5), 429-437 (2011).</li><li>Rahman, M. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+zinc+supplementation+as+adjunct+therapy+on+the+systemic+immune+responses+in+shigellosis.">Effects of zinc supplementation as adjunct therapy on the systemic immune responses in shigellosis.</a> The American Journal of Clinical Nutrition. 81 (2), 495-502 (2005).</li><li>Nahm, M. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=interlaboratory+evaluations,+and+application+of+a+simple,+high-throughput+Shigella+serum+bactericidal+assay.">interlaboratory evaluations, and application of a simple, high-throughput Shigella serum bactericidal assay.</a> mSphere. 3 (3), (2018).</li><li>Burton, R. L., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+and+validation+of+a+fourfold+multiplexed+opsonization+assay+(MOPA4)+for+pneumococcal+antibodies.">Development and validation of a fourfold multiplexed opsonization assay (MOPA4) for pneumococcal antibodies.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 13 (9), 1004-1009 (2006).</li><li>Tribble, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+a+Shigella+flexneri+2a+Invaplex+50+intranasal+vaccine+in+adult+volunteers.">Safety and immunogenicity of a Shigella flexneri 2a Invaplex 50 intranasal vaccine in adult volunteers.</a> Vaccine. 28 (37), 6076-6085 (2010).</li><li>Kim, H. W., Kim, K. H., Kim, J., Nahm, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+throughput+serum+bactericidal+assay+for+antibodies+to+Haemophilus+influenzae+type+b.">A high throughput serum bactericidal assay for antibodies to Haemophilus influenzae type b.</a> BMC Infectious Diseases. 16, 473 (2016).</li><li>Maslanka, S. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Standardization+and+a+multilaboratory+comparison+of+Neisseria+meningitidis+serogroup+A+and+C+serum+bactericidal+assays.">Standardization and a multilaboratory comparison of Neisseria meningitidis serogroup A and C serum bactericidal assays.</a> The Multilaboratory Study Group. Clinical Diagnostic Laboratory Immunology. 4 (2), 156-167 (1997).</li><li>Jang, M. S., Sahastrabuddhe, S., Yun, C. H., Han, S. H., Yang, J. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serum+bactericidal+assay+for+the+evaluation+of+typhoid+vaccine+using+a+semi-automated+colony-counting+method.">Serum bactericidal assay for the evaluation of typhoid vaccine using a semi-automated colony-counting method.</a> Microbial Pathogeneis. 97, 19-26 (2016).</li><li>Necchi, F., Saul, A., Rondini, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Development+of+a+high-throughput+method+to+evaluate+serum+bactericidal+activity+using+bacterial+ATP+measurement+as+survival+readout.">Development of a high-throughput method to evaluate serum bactericidal activity using bacterial ATP measurement as survival readout.</a> PLoS One. 12 (2), e0172163 (2017).</li><li>Riddle, M. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Safety+and+immunogenicity+of+a+candidate+bioconjugate+vaccine+against+Shigella+flexneri+2a+administered+to+healthy+adults:+a+single+blind,+randomized+phase+I+study.">Safety and immunogenicity of a candidate bioconjugate vaccine against Shigella flexneri 2a administered to healthy adults: a single blind, randomized phase I study.</a> Clinical and Vaccine Immunology. , (2016).</li><li>Shimanovich, A. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+and+Antigen-Specific+Serum+Antibody+Levels+as+Correlates+of+Protection+against+Shigellosis+in+a+Controlled+Human+Challenge+Study.">Functional and Antigen-Specific Serum Antibody Levels as Correlates of Protection against Shigellosis in a Controlled Human Challenge Study.</a> Clinical and Vaccine Immunology. 24 (2), (2017).</li></ol>

R.W.K הוא עובד של ממשלת ארה ב, וככזה הדיעות בפרסום זה הם אלה היוצרים אינן משקפות בהכרח את המדיניות הרשמית או המיקום של המחלקה של הצבא, משרד ההגנה, ולא ממשלת ארה ב.

הפרוטוקול המתואר כאן מדגים פונקציונלי assay המערכת החיסונית כדי להעריך את הפעילות shigellacidal של נוגדנים בסרום. ב וזמינותו הפגינו על נוגדנים חד-שבטיים זה פרוטוקול ספציפיות עבור 3a ס flexneri היו בשימוש9 יחד עם שליטה סרה האנושי של חיסון שיגלה הקודם ללמוד11. המקור של הסרום נבדק בחומר הזה assay עשוי להשתנות באופן נרחב מדגימות בעלי חיים פרה-קליניים דגימות קליניות האנושי, הפעילות shigellacidal של דגימת נסיוב ייפגע על ידי חיסונים חשיפות שחווה הפרט. אשיג קצת יתכנו בין הקשורים קשר הדוק אשר נגרמו מהזנים אליהם, במיוחד ס flexneri 2a ו- 3 א ס flexneri אבל אשיג קצת ניכרות אצל זנים אלו בהשוואה sonnei ס'9. הבסיס של SBA מתמקד ההפעלה של המפל המשלים על-ידי איגוד נוגדן-אנטיגן. לכן, הטיפול מהתרכובת BRC הוא אחד הצעדים קריטי רבים הכרוכים בביצוע של פרוטוקול זה. BRC נבחר לשימוש הזה assay בשל ביצועים עקביים רמות נמוכות של NSK אחרים אחרים מבחני12,13,14.  הפעילות של BRC הוא רגיש לטמפרטורה ועל האמצעים המתאימים כדי להבטיח כי להקפיא הפשרת מחזורים ממוזערים, כי BRC הוא aliquoted בודד שימוש באמצעי אחסון, כי aliquots BRC הם הקרת במהירות, מייד לפני השימוש בוזמינותו. מרקם של פעילות משלים תשפיע על הפארמצבטית של זה וזמינותו. עוד צעד קריטי להשפיע assay הפארמצבטית הוא ייצור דילול מניות חיידקי. חשוב כי לפני תחילת וזמינותו דילול מניות בקטריאלי המתאים נקבע, כהצלחה assay הוא בהתאם הייצור עקבית של פקדים A ו- B יש סעיפים CFU בממוצע CFU ~ 120 לכל מקום. על מנת לקבל כתמים כי הן אפשר לספור על-ידי התוכנה, זה גם הכרחי המשמשת צלחת חיידקים מתבצע בהצלחה. התצהיר של פתרון חיידקי, הטיה של הצלחת כך כתמים לרוץ ~ 2-3 ס מ הוא קריטי לייצור מושבות של התפלגות גודל נכון ונכון עבור ספירה מדויקת על ידי תוכנת נחמד. מאסטרינג כל השלבים האלה יבטיחו כי מדויק, עקביות בתוצאות מיוצרים על ידי פרוטוקול זה
גם כאשר כל השלבים הקריטיים מבוצעות טוב עדיין יתכנו מקרים שבהם יש צורך לשנות או לפתור בעיות בפרוטוקול זה. שינויים של פרוטוקול זה להעריך חיידקים אחרים עשויים לדרוש אופטימיזציה של לילה LBA צלחת הדגירה הטמפרטורה, כדי להבטיח את היווצרות מיקרו-מושבות. זנים אחרים של חיידקים או נוגדן מקורות, מלבד סרום, עשוי לדרוש אופטימיזציה של ריכוז המשלים. צריך גם לפקח NSK וערכים KIs של sera הבקרה כדי להבטיח וזמינותו עובדים כראוי. NSK צריך לא עולים יותר מ-70%. הקי של שליטה סרה לא אמור להשתנות מתכוון יותר ± 2SD. כדי להשיג תוצאות מוצלחות ועקבית בעת שימוש בפרוטוקול זה, יהיה צורך לבצע את כל הצעדים כמתואר פה עם תשומת לב מיוחדת לשלבים הקריטיים שפורטו לעיל.
בעוד פרוטוקול זה ממלא צריך חשובה בקהילה מחקר שיגלה , זה לא ללא המגבלות. פרוטוקול זה מתבסס על חומרים ביולוגיים ו, לכן, תמיד תהיה השתנות קצת קשה לשלוט. וריאציות בפעילות המשלים מגרשים וממקורות עשוי לתרום מבחני דרגות השונות. כדי להמתיק את זה, חשוב לטפל המשלים כראוי ולבדוק החדש הרבה משלים לפעילות לפני רכישה. זה גם עשוי להיות שימושי ליצירת בריכות של הרבה משלים עם פעילות ידוע לקבל באספקה הומוגנית. פרוטוקול זה פשוט על ידי עיצוב, אינו דורש שום ציוד מיוחד, המושבה אוטומטיות מונה התוכנה זמינה בחופשיות. בעוד הפשטות היא יתרון, המאפשר את פרוטוקול זה ייעשה כמעט בכל מעבדה, הוא עדיין דורש דגירה של לילה. תוארו מבחני האחרונות, הרבה דרישות דגירה קצר יותר, אך ידרוש ריאגנטים מיוחדת, הכנה15. הגבלה נוספת של זה וזמינותו היא במתכונתה הנוכחית שזה רק המסוגלת לחקור זן חיידקי יחיד בעת ובעונה אחת. בשטח שיגלה יש רצון ליצור חיסון multivalent, לאחר מבחני אימונולוגי כך שתוכל להעריך פתוגנים באופן מולטיפלקס הוא בעל ערך רב. Assay הזה יכול להיות שונה בעתיד כדי לענות על צורך זה, אבל במתכונתה הנוכחית, זה וזמינותו יחיד-פלקס.
בעוד assay הזה יש כמה מגבלות, עדיין יש יתרונות רבים על פני שיטות הקיימות או אלטרנטיבית. יתרונות אלו כוללים שיפורים רבים המשלבים כדי להפוך את ההוצאה להורג של שיטה זו שדורשת הרבה פחות יותר תפוקה גבוהה יותר SBAs המסורתי. השימוש של מניות חיידקי קפוא, תבנית assay צלחת 96-ובכן, את ציפוי על בצלחות פטרי מרובע גדול, מוספים המושבות המאפשר לצלם וממשיכים אוטומטי המושבה-, לעזור להפחית את החומרים ואת הזמן הדרוש כדי לסיים את זה וזמינותו. Assay הזה יש גם יתרונות על פני שיטות אחרות תפוקה גבוהה כי זה לא דורש שום נוגדנים מיוחדים או ציוד. הפרוטוקול המתואר יכולה להתבצע עם ריאגנטים בסיסי ותוכנה זמינה בחופשיות, מתן אפשרות עבור היישום שלה בכל סביבה מעבדה.
כל היתרונות פרוטוקול זה מספק תומך השימוש בחקירות רבות בעתיד. וזמינותו הוא אידיאלי עבור הבחינה של תגובות חיסוניות לאחר חיסון או זיהום טבעי. יישום זה מאפשר SBA להיות כלי רב ערך מחקר שיגלה חיסון, שכבר השתמשת בו כדי להעריך את החיסון immunogenicity בחיסונים ביו-המספר המשלים שיגלה איפה זה הוכיח את היכולת של חיסונים אלה זירוז הייצור של נוגדנים פונקציונלי16. פרוטוקול זה נבדק באופן מקיף על ידי מעבדות מרובים, הוכח לייצר תוצאות אמין, לשחזור9. פרוטוקול זה גם מפיקה תוצאות דומות כאשר הדגימות באותו נבדקים באמצעות מבחני אחרים האחרים17. עקביות נתונים שנוצרו על-ידי זה וזמינותו, והופכת את התאימות שלו לשיטות בוגרים אחרים חזקים כלי להערכת פעילות אחרים הדוגמאות סרום במדויק. הבדיקה בקלות גם ניתן להתאים כדי להעריך את סוגי מדגם נוספים. ואילו סרום זמין בקלות בניסויים קליניים למבוגרים, זה יכול להיות קשה להשיג מספיק סרום בניסויים התמקדות תינוקות וילדים קטנים; אחד של אוכלוסיות היעד בסופו של דבר עבור חיסונים שיגלה . בניסויים אלה, דם באופן שגרתי שנאסף על נייר סינון, ייבוש. היו הצלחות ראשוניות בתבנית דגימה באמצעות SBA מסוג זה. בנוסף דם, דגימות הרירית (כגון רוק, תמציות צואה ושתן) הם גם מטרה שהוא רלוונטי במחקר שיגלה חיסון. כיום, פרוטוקול זה יוערכו על שלושה אשר נגרמו מהזנים אליהם הרלוונטית קלינית ביותר של שיגלה אבל זה גם יכול להיות מותאם spp. שיגלה נוספים, כמו גם אחרים פתוגנים חיידקיים. עבודה עתידיות יתמקדו לייצור assay מולטיפלקס עם הרבה מאפיינים זהים לאלה וזמינותו מתוארת על ידי פרוטוקול זה. וזמינותו מרובבת יאפשר הערכה של מספר שיגלה אשר נגרמו מהזנים אליהם בו זמנית, נוסף שימור לדוגמה ואמצעי הידיים בזמן וזמינותו. יש גם עבודה לדרך כדי להעביר זה וזמינותו מעבדות ברחבי העולם. בהערכות הכללית יפיק יותר נתונים לקראת מוקדמות וזמינותו בקנה מידה מחקר גדול, בזמן בו זמנית מספר גדל והולך של מעבדות מיקרוביולוגיה ואימונולוגיה יש גישה זו SBA להעריך חיידקים, סרום דגימות אסף ממקומות שונים אנדמיים. וזמינותו המתוארים כאן ופשוט תפוקה גבוהה ויש לו את היכולת לשפר את ההערכה אימונולוגי שיגלה שדה, כמו גם יישומים רחבה יותר הערכה של אחרים פתוגנים חיידקיים.

שיגלה אשר נגרמו מהזנים אליהם, שיגלה flexneri 2a, flexneri ס' 3 א ו ס sonnei, מדגימים השכיחות אפידמיולוגיים ברחבי העולם. המחלה diarrheal הנגרמת על ידי אלה שיגלה מינים השפעות צבאי, מטיילים1, הוא הגורם המוביל למוות diarrheal בקרב ילדים מתחת לגיל 5 מדינות מתפתחות2. כיום יש אין חיסונים מורשה כדי להגן מפני שיגלה, עם זאת, ישנם מספר חיסונים המועמד בשלבים שונים של הפיתוח. רבים מן החיסונים, ואמצעים אחרים מניעתי כעת בפיתוח, מתמקדים נוגדנים המיוצרים כנגד שיגלה ליפופוליסכריד (LPS). LPS הוא מועמד אטרקטיבי החיסון כי זה אנטיגן פני השטח הגדולות ומשרה זיהום טבעי עם שיגלה נוגדנים ספציפיים LPS שניתן מגן מפני הדבקה חוזרת באופן ספציפי serotype. לכן, חיסון שיגלה מוצלח יהיה ככל הנראה צורך רב-עמודים ולנטיין והמטרה 3-4 שיגלה אשר נגרמו מהזנים אליהם לזירוז חסינות מפני 70-80% באופן גלובלי לאומיים זנים3,4, 5 , 6. זה דורש כי מבחני להעריך שיגלה חיסון המועמדים להיות ספציפיות עבור מרובים שונים אשר נגרמו מהזנים אליהם.
מבחני אימונולוגי הנוכחי להערכת המועמדים החיסון מתמקדים לכימות רמות של נוגדן titers, אבל ישנם כמה מבחני מאופיין היטב להערכה תפקודית נוגדנים. הבחינה של יכולת תפקודית נוגדן חשוב כי נוגדנים ספציפיים הפתוגן אחראיות זיהום דרך מספר מנגנונים תפקודית כולל איגוד אנטיגנים השטח חיידקים, ומניעת הדבקה על ו זיהום של תאי אפיתל, מיקוד תאים חיידקיים או opsonization ו- phagocytosis, ו ישירות להרוג פתוגנים על ידי איגוד ויזמות המפל המשלים. הריגת חיידקים באמצעות נוגדנים ישירה מתרחשת כאשר נוגדנים לאגד רכיבים משטח של חיידקים היעד וליזום את המפל המשלים שמוביל ההפעלה של zymogens רבים כי בסופו של דבר התוצאה במבנה הנקבוביות בבקטריאלי תא זה גורם פירוק ומוות בקטריאלי. זה הרג ישיר של חיידקים על ידי העברת נוגדנים וה משלים עשוי להיות מכריע בתחילת קו הגנה במהלך זיהום.
אנשים שאינם נגועים באופן טבעי יש נוגדנים עם פעילות shigellacidal סרה שלהם. אלה שיגלה -נוגדנים ספציפיים אותרו באמצעות הרג בתיווך משלים מסורתיים מבחני 7,8. הדבר מציין כי ייתכן תפקיד עבור נוגדנים אחרים בהגנה כנגד שיגלה. מבחני אחרים מסורתי פשוטים את ביצוע: סרום הוא חום-לא פעיל (להשמיד את פעילות משלים אנדוגני) ומערבבים אותו עם החיידק עניין. תערובת זו על ריכוז מסוים נוסף המשלים אקסוגני. תערובת התגובה מודגרות כדי לאפשר הריגת חיידקים, מצופה ואז לאשר המושבה יוצרי יחידות (CFUs). ברגע CFUs נספרים, ניתן לחשב בעל אינדקס הרג 50% (KI) וקבעה כייל SBA. הליך זה הוא פשוט יחסית, מבחני אלה יכול להיות עתירי וצורך לבצע, התוצאה עלולה להיות משתנה מאוד. בנוסף מגבלות אלו, אין מבחני פונקציונליים טוב מאופיין כיום קיימות עבור שיגלה. לכן, יש לנו בהצלחה פיתחו ואנו מוסמך וזמינותו פשוטה, תפוקה גבוהה כדי למדוד פעילות אחרים שיגלה שלושה ארגזים של זנים הרלוונטית קלינית ביותר9. פרוטוקול זה מתאר של SBA עם שינויים העשויים משפרים את יעילות assay הפארמצבטית. הראשון של שינויים אלה הוא השימוש של מניות חיידקי קפוא. הייצור של מניות שימוש אחד מבטל את הצורך התרבות חיידקים טריים כל assay תוך כדי הקטנת assay-כדי-assay השתנות. עוד בזמן ובעבודה שמירת היתרון של פרוטוקול זה הוא השימוש של תבנית assay 96-ובכן צלחת. דבר זה מאפשר דילול טורי של דגימות כך ניתן לבחון את מגוון של ריכוזים.  זה גם מאפשר השימוש פיפטות רב-ערוצי עבור ציפוי דוגמאות על בצלחות פטרי מרובע. כאשר פטרי מרובע אלה משמשים בשילוב עם מערכת תרבות המייצרת מיקרו-מושבות, מספר פלטות אגר הדרושות וזמינותו מצטמצם. זה, בשילוב עם התוכנה זמינה בחופשיות ספירת המושבה, שפותח במקור עבור opsonophagocytic מרובבת pneumococcal הורגת assay (MOPA)10, מאפשר הספירה המושבה מהירה, אוטומטית ואמין. כל השיפורים להפחית באופן משמעותי את הפעם תרגולים assay יצירת מערכת תפוקה גבוהה ומאפשר לוחות מרובים שיש להפעיל בעת ובעונה אחת.
בעוד פרוטוקול זה הותאם עבור שלושה אשר נגרמו מהזנים אליהם הרלוונטית קלינית ביותר של שיגלה, SBA המתוארים כאן ניתן להחיל בקלות רבים אחרים פתוגנים חיידקיים. בנוסף לשימוש פוטנציאלי של פרוטוקול זה עם חיידקים אחרים, פרוטוקול זה יש פוטנציאל להרחיב מעבר השימוש רק סרום כחומר מוצא, אשר יכול לכלול הניתוח של נוגדנים סוגי הדגימה רלוונטיים אחרים כמו דגימות הרירית, כולל דגימות צואה ורוק. השימוש הזה assay לחקור תגובות חיסוניות לאחר החיסון עשוי לתת תובנה רחבה יותר תגובות חיסוניות שנוצר על ידי חיסון מובילים בעיצוב רציונלית של חיסונים, עזרה בהבנה של חסינות טבעית כיצד מתפתח.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Gelatin</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G9391</td>
			<td>Type B, powder, BioReagent, suitable for cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>TTC (2,3,5-Triphenyltetrazolium chloride)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T8877</td>
			<td>&#8805;98.0% (HPLC)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sodium azide (NaN3)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>S2002</td>
			<td>&#8805;99.5%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Baby Rabbit Complement</td>
			<td>PelFreez</td>
			<td>31061-3</td>
			<td>3-4 week old</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>HBSS with Ca2+/Mg2+</td>
			<td>Invitrogen</td>
			<td>14065-56</td>
			<td>Without Phenol Red</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Agar (Lennox)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L2897</td>
			<td>Powder microbial growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bacto Agar</td>
			<td>BD</td>
			<td>214010</td>
			<td>Powdered, (C12H18O9)n</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Glycerol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5516</td>
			<td>For molecular biology, &#8805;99%</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LB Broth (Lennox)</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L3022</td>
			<td>Powder microbial growth medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Square Petri Dish</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Z617679-240EA</td>
			<td>120 mm x 120 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Assay Plate</td>
			<td>Costar</td>
			<td>3799</td>
			<td>96 well u-bottom plate with lid</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>NICE Software</td>
			<td>University of Alabama at Birmingham</td>
			<td></td>
			<td>ftp://ftp.nist.gov/pub/physics/mlclarke/NICE/</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a high-throughput shigella-specific bactericidal assay

סרום מבחני אחרים (SBAs) מודדים את הפעילות פונקציונליים של נוגדנים, שימשו במשך עשורים רבים. SBAs למדוד ישירות נוגדנים הרג פעילות על-ידי הערכת היכולת של נוגדנים בסרום לאגד חיידקים ולהפעיל המשלים. הפעלה זו התוצאה פירוק הריגת חיידקים היעד. מבחני אלה הם בעלי ערך מכיוון שהם מעבר לכימות בייצור נוגדן התירי את תפקודים ביולוגיים שיש נוגדנים אלה, ומאפשר לחוקרים ללמוד את התפקיד נוגדנים שעשויים לשחק למניעת זיהום. SBAs שימשו ללמוד תגובות מערכת החיסון עבור פתוגנים אנושיים רבים, אבל יש אין מתודולוגיה נפוצה ומקובלת שיגלה בזמן הנוכחי. מבחינה היסטורית SBAs היו מאוד עתירי עבודה, הדורשים זמן רב שלבים רבים לכמת במדויק את החיידקים ששרדו. פרוטוקול זה מתאר פשוט, עמיד, ואת תפוקה גבוהה assay כך מדויק נוגדנים פונקציונלי אמצעים בשביל שיגלה בנסיוב במבחנה. השיטה המתוארת כאן יתרונות רבים על SBAs מסורתיים, כולל השימוש של מניות חיידקי קפוא, 96. ובכן assay צלחות, מערכת מיקרו-תרבות וכן ספירת המושבה אוטומטית. כל השינויים האלה להפוך assay זו שדורשת פחות תפוקה גבוהה יותר. פרוטוקול זה הוא פשוט יותר ומהירה יותר לביצוע מאשר SBAs המסורתית תוך שימוש עדיין זמינים ראגנטים וטכנולוגיות פשוטה. הפרוטוקול יושם בהצלחה במעבדות עצמאיות מרובות והוא וזמינותו לשחזור ועמיד. הבדיקה ניתן להעריך תגובות חיסוניות במחקרים קליניים, כמו גם קליני. לכימות shigellacidal נוגדן titers הן לפני והן אחרי חשיפה אנטיגן (על ידי חיסון או זיהום) מאפשר הבנה רחבה יותר של נוגדן פונקציונלי איך התגובות נוצרות ותרומתם חיסון הגנתי. התפתחות זו סטנדרטית, מאופיין היטב assay עשויה להקל במידה רבה שיגלה חיסון עיצוב.

פריסה 96-ובכן צלחת בשימוש assay טיפוסי מוצג טבלה 1- פריסה זו יש הבארות פקד פעיל המשלים (שליטה ב), הבארות בקרת חום-לא פעיל המשלים (פקד) ודוגמאות חמש כפולים. דוגמאות הן באופן סדרתי מדולל מקופלים ל- 3 למעלה את הצלחת H שורה לחתור המאפשרות דילולים 8 של כל מדגם ייבדק בעת ובעונה אחת. איור 1 מראה שתי צלחות LBA לאחר התוספת הדגירה ולאחר בשכבת-העל של לילה. פיתוח צבע התרחש והם כל המושבות ששרד גלויים באדום. הריגת חיידקים הוא ראה בבירור עבור כל הדגימות שנבדקו ב שלושת דילולים (שורות F-H) כמו דגימות הן מדולל במעלה הצלחת, ירידה להרוג חיידקים נתפסת איפה סרום מרוכז פחות. ממשק התוכנה יפה ניתן לראות באיור2. מיקרו-המושבה סעיפים מתוך התוכנה נחמד ניתן לראות באיור3, כבר מאורגנות ההאשמות לתוך טבלה 2. הרוזן CFU הממוצע עבור כל דילול של כל מדגם מחושב ולא ערך קי 50% מחושבת בטבלה3. ערך קי זה 50% ניתן ליישם את CFUs בממוצע עבור כל בסרום כדי לקבוע את הערכים הדרושים לחישוב הקי SBA בהתאם לנוסחה המתואר באיור4. תוצאה סופית של וזמינותו מוצג בטבלה4.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>4</td>
			<td>5</td>
			<td>6</td>
			<td>7</td>
			<td>8</td>
			<td>9</td>
			<td>10</td>
			<td>11</td>
			<td>12</td>
		</tr>
<tr>
<td>A</td>
			<td>פקד</td>
			<td>שליטה B</td>
			<td>דילול 8</td>
			<td>דילול 8</td>
			<td>דילול 8</td>
			<td>דילול 8</td>
			<td>דילול 8</td>
			<td>דילול 8</td>
			<td>דילול 8</td>
			<td>דילול 8</td>
			<td>דילול 8</td>
			<td>דילול 8</td>
		</tr>
<tr>
<td>B</td>
			<td>פקד</td>
			<td>שליטה B</td>
			<td>דילול 7</td>
			<td>דילול 7</td>
			<td>דילול 7</td>
			<td>דילול 7</td>
			<td>דילול 7</td>
			<td>דילול 7</td>
			<td>דילול 7</td>
			<td>דילול 7</td>
			<td>דילול 7</td>
			<td>דילול 7</td>
		</tr>
<tr>
<td>C</td>
			<td>פקד</td>
			<td>שליטה B</td>
			<td>דילול 6</td>
			<td>דילול 6</td>
			<td>דילול 6</td>
			<td>דילול 6</td>
			<td>דילול 6</td>
			<td>דילול 6</td>
			<td>דילול 6</td>
			<td>דילול 6</td>
			<td>דילול 6</td>
			<td>דילול 6</td>
		</tr>
<tr>
<td>D</td>
			<td>פקד</td>
			<td>שליטה B</td>
			<td>דילול 5</td>
			<td>דילול 5</td>
			<td>דילול 5</td>
			<td>דילול 5</td>
			<td>דילול 5</td>
			<td>דילול 5</td>
			<td>דילול 5</td>
			<td>דילול 5</td>
			<td>דילול 5</td>
			<td>דילול 5</td>
		</tr>
<tr>
<td>E</td>
			<td>פקד</td>
			<td>שליטה B</td>
			<td>דילול 4</td>
			<td>דילול 4</td>
			<td>דילול 4</td>
			<td>דילול 4</td>
			<td>דילול 4</td>
			<td>דילול 4</td>
			<td>דילול 4</td>
			<td>דילול 4</td>
			<td>דילול 4</td>
			<td>דילול 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>F</td>
			<td>פקד</td>
			<td>שליטה B</td>
			<td>דילול 3</td>
			<td>דילול 3</td>
			<td>דילול 3</td>
			<td>דילול 3</td>
			<td>דילול 3</td>
			<td>דילול 3</td>
			<td>דילול 3</td>
			<td>דילול 3</td>
			<td>דילול 3</td>
			<td>דילול 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>G</td>
			<td>פקד</td>
			<td>שליטה B</td>
			<td>דילול 2</td>
			<td>דילול 2</td>
			<td>דילול 2</td>
			<td>דילול 2</td>
			<td>דילול 2</td>
			<td>דילול 2</td>
			<td>דילול 2</td>
			<td>דילול 2</td>
			<td>דילול 2</td>
			<td>דילול 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>H</td>
			<td>פקד</td>
			<td>שליטה B</td>
			<td>דילול 1</td>
			<td>דילול 1</td>
			<td>דילול 1</td>
			<td>דילול 1</td>
			<td>דילול 1</td>
			<td>דילול 1</td>
			<td>דילול 1</td>
			<td>דילול 1</td>
			<td>דילול 1</td>
			<td>דילול 1</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td colspan="2">דוגמה 1</td>
			<td colspan="2">דוגמה 2</td>
			<td colspan="2">דוגמה 3</td>
			<td colspan="2">דוגמה 4</td>
			<td colspan="2">דוגמה 5</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: פריסת צלחת Assay. עמודים 1 ו- 2 מכילים הבארות שליטה המשלים. פקד נמצא בעמודה 1 והוא להשבית החום משלימים שליטה, המכיל מאגר SBA, חיידקים, המשלים חום-לא פעיל. שליטה B ממוקם בטור 2 והוא הפעיל משלימים שליטה, המכיל מאגר SBA, חיידקים, המשלים. עמודות 3-12 מכילות הדוגמאות סרום. כל מדגם מנוהל על כפולות, באופן סדרתי מדולל מקופלים ל- 3 משורה H שורה A
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59164/59164fig1.jpg"> איור 1: צלחות LBA לאחר פיתוח צבע. נציג flexneri ס 3a חיידקי מיקרו-מושבות גדלו בן לילה לגודל המתאים. כיסוי אגר נוספה ופיתחו מושבות צבע אדום על ידי הפחתה של המתחם TTC, כיסוי אגר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59164/59164fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59164/59164fig2.jpg"> איור 2: ממשק התוכנה של NIST מונה המושבה משולב (NICE). ייצוג גרפי של ממשק התוכנה יפה. אזורים מעניינים (ROIs) מרוכזים על מושבות בכל מקום לפני שספר. ניתן לייצא נתונים ישירות מתוך חלון נחמד. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59164/59164fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59164/59164fig3.jpg"> איור 3: lba של צלחות שנספרו בתוכנה נחמדה. הדימויים תצלום צבע מוטענים לתוך תוכנת נחמד, יחידות ויוצרים מושבה (CFUs) נספרים באופן אוטומטי. תמונה זו מציגה שתי צלחות lba של נציג שלהם מידע ספירה של המושבה. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59164/59164fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>185</td>
			<td>167</td>
			<td>145</td>
			<td>151</td>
			<td>122</td>
			<td>134</td>
			<td>119</td>
			<td>142</td>
			<td>124</td>
			<td>115</td>
			<td>113</td>
			<td>123</td>
			<td>1:17496</td>
			<td>דילול 8</td>
		</tr>
<tr>
<td>186</td>
			<td>152</td>
			<td>145</td>
			<td>138</td>
			<td>132</td>
			<td>135</td>
			<td>108</td>
			<td>116</td>
			<td>100</td>
			<td>119</td>
			<td>105</td>
			<td>109</td>
			<td>1:5832</td>
			<td>דילול 7</td>
		</tr>
<tr>
<td>179</td>
			<td>160</td>
			<td>145</td>
			<td>135</td>
			<td>109</td>
			<td>120</td>
			<td>54</td>
			<td>55</td>
			<td>71</td>
			<td>75</td>
			<td>79</td>
			<td>89</td>
			<td>1:1944</td>
			<td>דילול 6</td>
		</tr>
<tr>
<td>193</td>
			<td>153</td>
			<td>146</td>
			<td>138</td>
			<td>87</td>
			<td>105</td>
			<td>5</td>
			<td>6</td>
			<td>6</td>
			<td>9</td>
			<td>19</td>
			<td>30</td>
			<td>1:648</td>
			<td>דילול 5</td>
		</tr>
<tr>
<td>184</td>
			<td>129</td>
			<td>121</td>
			<td>143</td>
			<td>6</td>
			<td>7</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1:216</td>
			<td>דילול 4</td>
		</tr>
<tr>
<td>180</td>
			<td>145</td>
			<td>22</td>
			<td>24</td>
			<td>2</td>
			<td>3</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>1:72</td>
			<td>דילול 3</td>
		</tr>
<tr>
<td>207</td>
			<td>129</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>2</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>4</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>1:24</td>
			<td>דילול 2</td>
		</tr>
<tr>
<td>201</td>
			<td>140</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>4</td>
			<td>4</td>
			<td>1:8</td>
			<td>דילול 1</td>
		</tr>
<tr>
<td>פקד</td>
			<td>שליטה B</td>
			<td colspan="2">דוגמה 1</td>
			<td colspan="2">דוגמה 2</td>
			<td colspan="2">דוגמה 3</td>
			<td colspan="2">דוגמה 4</td>
			<td colspan="2">דוגמה 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>בטבלה 2: סעיפים של מושבות חיידקים. ספירות CFU מיוצאים מתוך התוכנה נחמד להצטיין בתבנית. ניתן לארגן ההאשמות לתוך טבלה המציגה שבקטריאלי נחשב עבור כל פקד בארות ודוגמאות כפולים.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>פקד</td>
			<td>שליטה B</td>
			<td>148</td>
			<td>128</td>
			<td>131</td>
			<td>120</td>
			<td>118</td>
			<td>1:17496</td>
			<td>דילול 8</td>
		</tr>
<tr>
<td>189</td>
			<td>147</td>
			<td>142</td>
			<td>134</td>
			<td>112</td>
			<td>110</td>
			<td>107</td>
			<td>1:5832</td>
			<td>דילול 7</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">NSK (1-CtrB/CtrA): 22%</td>
			<td>140</td>
			<td>115</td>
			<td>55</td>
			<td>73</td>
			<td>84</td>
			<td>1:1944</td>
			<td>דילול 6</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">50% קי (CtrB/2): 73</td>
			<td>142</td>
			<td>96</td>
			<td>6</td>
			<td>8</td>
			<td>25</td>
			<td>1:648</td>
			<td>דילול 5</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>132</td>
			<td>7</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>1:216</td>
			<td>דילול 4</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>23</td>
			<td>3</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
			<td>0</td>
			<td>1:72</td>
			<td>דילול 3</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>1</td>
			<td>2</td>
			<td>1</td>
			<td>3</td>
			<td>1</td>
			<td>1:24</td>
			<td>דילול 2</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>0</td>
			<td>0</td>
			<td>1</td>
			<td>1</td>
			<td>4</td>
			<td>1:8</td>
			<td>דילול 1</td>
		</tr>
<tr>
<td></td>
			<td></td>
			<td>דוגמה 1</td>
			<td>דוגמה 2</td>
			<td>דוגמה 3</td>
			<td>דוגמה 4</td>
			<td>דוגמה 5</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 3: חישוב ערך סף של הקי 50% וממוצעים מדגם כפולים. ערך הסף של הקי 50% מחושב על-ידי לקיחת הממוצע של כל פקד B בארות חילוק 2. ממוצעים של כפילויות חושבו עבור כל דילול של כל מדגם שהופעל על שכפל. NSK ערך מחושב גם.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59164/59164fig4.jpg"> איור 4: סכימטי של האינטרפולציה הלינארית. מספר החיידקים ששרדו (ציר y)-כל דילול של נסיוב שנבדקו (ציר x) היא להתוות (יהלומים שחורים), נקודות בודדות מחוברות על ידי קו שחור דק, מקווקו. הקווים האופקיים מקווקו ומוצקה מציינים 0% ל- 50% להרוג, בהתאמה. דילולים סרום לעיל (דילול 5) ולא מתחת (דילול 4) 50% להרוג קו מחוברים באמצעות קו אדום, ומצוין כייל נוגדנים אחרים (KI). <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59164/59164fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>SBA קי</td>
		</tr>
<tr>
<td>דוגמה 1</td>
			<td>72</td>
		</tr>
<tr>
<td>דוגמה 2</td>
			<td>216</td>
		</tr>
<tr>
<td>דוגמה 3</td>
			<td>1994</td>
		</tr>
<tr>
<td>דוגמה 4</td>
			<td>1994</td>
		</tr>
<tr>
<td>דוגמה 5</td>
			<td>648</td>
		</tr>
</tbody></table>בטבלה 4: SBA תוצאות כייל נוגדנים אחרים מראה (KI). ערכים SBA קי הסופי שנקבע עבור כל דגימה ומוצגים. ערכים אלה מחושבים באמצעות CFUs הממוצע את ערך הסף של הקי 50%, הנוסחה האינטרפולציה הלינארית.

Watch this Scientific Journal Video about A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay at JoVE.com

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

כאן אנו מציגים פרוטוקול כדי למדוד את הפעילות Shigellacidal של נוגדנים בסרום. סרום מעורב עם חיידקים, המשלים אקסוגני, מתפשט, ואת תערובת התגובה הוא מצופה על פלטות אגר. חיידקים קיימא יוצרות מושבות הנספרות, באמצעות מונה המושבה אוטומטית, כדי לקבוע את כייל נוגדנים אחרים.

תפוקה גבוהה שיגלה-Assay אחרים ספציפיים

Serum bactericidal assays (SBAs) measure the functional activity of antibodies and have been used for many decades. SBAs directly measure antibody killing ...

בתחום המחקר Shigella חסרים כיום בדיקות מוגדרות היטב לבחינת התפקיד התפקודי של נוגדנים הנוצרים על ידי חיסון או זיהום. מבחן זה מייצג שיטה מוגדרת היטב כדי להעפיל תגובות חיסוניות אלה ולמדוד פעילות bactericidal של נוגדנים ספציפיים Shigella. היתרון העיקרי של תוואי זה הוא שהוא מאפשר ניתוח תפוקה גבוהה של דגימות מרובות.הטכניקות המשמשות בפרוטוקול זה מפחיתות מאוד את זמן ההתמקמה הידיים ואת זמן ההתמקמה הכולל כדי למדוד הרג חיידקים ישיר של נוגדנים ודגימות סרום. כדי להתחיל, דגירה הדגימות באמבט מים חמים ב 56 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות כדי לחמם ולהפעיל את דגימות הבדיקה. השג לוחית בדיקה ו- 20 מיקרוליטרים של מאגר הבדיקה לעמודות 1 עד 12 שורות A עד G.Add 20 מיקרוליטרים של מאגר הבדיקה לעמודות 1 ו-2 של H.Load 30 מיקרוליטרים של כל דגימת בדיקה ושכפל לשורה H של לוח הבדיקה.כדי להתחיל לבצע דילולים סדרתיים משולשים של דגימות הבדיקה, השתמש בפיפיטה רב-ערוצית כדי להסיר 10 מיקרוליטרים מ בארות 3H עד 12H. העבר את הדגימות ל בארות המתאימות בשורה G ו pipette למעלה ולמטה 8 עד 10 פעמים כדי לערבב את המדגם היטב. לאחר מכן, להסיר 10 microliters מ בארות אלה.העברה ל בארות המתאימות בשורה F ו pipette למעלה ולמטה 8 עד 10 פעמים לערבב. המשך תהליך דילול סדרתי זה דרך שורה A.לאחר ערבוב בארות בשורה A, להסיר ולהשליך 10 microliters מ בארות 3A עד 12A, כך הנפח הסופי בכל בארות הוא 20 microliters. לאחזר בקבוקון אחד של מלאי חיידקי יעד קפוא ולהפשיר אותו בטמפרטורת החדר.לאחר מכן, לדלל את החיידקים ב 20 מיליליטר של חיץ מים. על פי גורם הדילול האופטימלי קבוע מראש. בעזרת פיפטה רב-ערוצית, הוסיפו 10 מיקרוליטרים של חיידקים מדוללים לכל באר של צלחת ההתב"צ.לאחזר בקבוקון אחד של מחמאות ארנב תינוק קפוא בקבוקון אחד של חום קפוא מופעל BRC. השתמש במים זורמים קרים כדי להפשיר את הבקבוקונים לטמפרטורת החדר. לאחר מכן, יש לערבב 100 מיקרוליטרים של BRC המופעלים באמצעות חום עם 400 מיקרוליטרים של מאגר בדיקה.הוסף 50 מיקרוליטרים של פתרון BRC זה המופעל בחום של 20 אחוז לכל הבארים בעמודה הראשונה. מערבבים מיליליטר אחד של BRC מקורי עם ארבעה מיליליטר של מאגר מוצף. הוסף 50 microliters של תערובת זו 20 אחוז לכל בארות בעמודים 2 עד 12.מניחים את הצלחת אחת שייקר צלחת במשך 10 עד 15 שניות כדי לערבב בעדינות את צלחת ההבטחה. להטמום את צלחת ההתזה באינקובטור מיקרוביולוגי במשך שעתיים. בינתיים, להסיר את המכסים משני צלחות אגר LB ולה מניחים את הצלחות עם הפנים כלפי מעלה ארון בטיחות ביולוגי במשך 40 עד 60 דקות להתייבש.כאשר הדגירה הושלמה, מעבירים את צלחת ההתלהמות לקרח רטוב ודולרים במשך 10 עד 20 דקות כדי לעצור את התגובה. באמצעות פיפטה שתים עשרה ערוצים, מערבבים את בארות בשורה H וצלחת ספוט 10 microliters של תערובת התגובה על החלק התחתון של צלחת LBA. מיד להטות את הצלחת ולאפשר כתמים לרוץ על 1.5 עד 2 ס"מ.חזור על הליך זה עבור שורות G, F ו- E, איתור אותם מעל השורה הקודמת. הדגירה צלחות LBA בטמפרטורת החדר עד הפתרון נספג לתוך צלחות LBA. לאחר מכן, לשים את המכסים על הצלחות ולהעביר אותם במהופך לתוך אינקובטור מיקרוביולוגי כדי להחמם לילה.למחרת, להוסיף 25 מיליליטר של כיסוי אגר ב 55 מעלות צלזיוס, המכיל 100 מיקרוגרם למיליליטר TTC ו 0.1 אחוז נתרן אזיד לכל צלחת LBA. דגירה ב 37 מעלות צלזיוס במשך שעתיים כדי לאפשר לחיידקים ששרדו לפתח צבע אדום. לאחר מכן, השתמש במצלמה דיגיטלית כדי לצלם את הצלחות.העבר את התמונות למחשב ולהשתמש בתוכנת ספירת המושבה המשולבת של NIST כדי לנתח את התמונות כמתואר בפרוטוקול הטקסט. צלחות LBA נציג להדגים כי פיתוח צבע התרחשה לאחר דגירה לילה ותוספת כיסוי, עם כל המושבות ששרדו להיות גלוי באדום. הרג חיידקים נראה בבירור עבור כל הדגימות שנבדקו בשלושת הדילולים הראשונים.ירידה בהריגת חיידקים נתפסת כאשר דגימות מדוללות עוד יותר במעלה הצלחת והנסיוב פחות מרוכז. ספירות מיקרו-מושבה מבוצעות לאחר מכן באמצעות תוכנת NIST. לאחר מכן מחושבת ספירת CFU הממוצעת עבור כל דילול של כל מדגם, וכך גם ערך ההרג של 50 אחוז.ערך הרג זה של 50 אחוז מוחל לאחר מכן על יחידות ה- CFUs הממוצעות עבור כל דילול סרום כדי לקבוע את הערכים הדרושים לחישוב SBA KI. פרוטוקול זה מסתמך על ציפוי חיידקי עקבי ואחיד על LB Auger. ציפוי נקודתי טוב וטכניקת הטיה יאפשרו צמיחה של מיקרו-כלים דיסקרטיים וספירת מושבות מדויקת. טכניקה זו משתמשת שיגלה ארסית חיה ודורש טכניקה aseptic המתאים PPE כדי להבטיח את החיידקים מטופלים בבטחה על פי BSL 2 נהלים.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

A High-throughput Shigella-specific Bactericidal Assay

Quantitative High-throughput Single-cell Cytotoxicity Assay For T Cells

Assay כמותית תפוקה גבוהה מתא בודד Cytotoxicity לתאי T

Cancer immunotherapy can harness the specificity of  immune response to target and eliminate tumors. Adoptive cell therapy (ACT)  based on the adoptive ...

A Microscopic Phenotypic Assay for the Quantification of Intracellular Mycobacteria Adapted for High-throughput/High-content Screening

בדיקה פנוטיפית מיקרוסקופית לכימות של מיקובקטריה תאית המותאמת להקרנה בתפוקה גבוהה/תוכן גבוה

Despite the availability of therapy and vaccine, tuberculosis (TB) remains one of the most deadly and widespread bacterial infections in the world. Since ...

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

High-throughput Assay to Phenotype Salmonella enterica Typhimurium Association, Invasion, and Replication in Macrophages

Assay תפוקה גבוהה להפנוטיפ<em&gt; Enterica סלמונלה</em&gt; Typhimurium איגוד, פלישה, ושכפול בהמקרופאגים

Salmonella species are zoonotic pathogens and leading causes of food borne illnesses in humans and livestock1. Understanding the mechanisms underlying ...

High-throughput Quantitative Real-time RT-PCR Assay for Determining Expression Profiles of Types I and III Interferon Subtypes

תפוקה גבוהה בזמן אמת כמותי RT-PCR Assay לקביעת פרופילי ביטוי של סוגי I ו- III תת סוגי אינטרפרון

Described in this report is a qRT-PCR assay for the analysis of seventeen human IFN subtypes in a 384-well plate format that incorporates highly specific ...

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

High-throughput Gene Tagging in Trypanosoma brucei

תפוקה גבוהה ג&#39;ין תיוג ב<em&gt; Trypanosoma brucei</em

Improvements in mass spectrometry, sequencing and bioinformatics have generated large datasets of potentially interesting genes. Tagging these proteins ...

High-throughput Detection of Respiratory Pathogens in Animal Specimens by Nanoscale PCR

איתור תפוקה גבוהה של פתוגנים הנשימה בדגימות בעלי חיים על ידי ננו PCR

Nanoliter scale real-time PCR uses spatial multiplexing to allow multiple assays to be run in parallel on a single plate without the typical drawbacks of ...

A Fluorescence-based Lymphocyte Assay Suitable for High-throughput Screening of Small Molecules

Assay לימפוציטים הקרינה מבוסס מתאים להקרנה תפוקה גבוהה של מולקולות קטנות

High-throughput screening (HTS) is currently the mainstay for the identification of chemical entities capable of modulating biochemical reactions or ...

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

A High-throughput Compatible Assay to Evaluate Drug Efficacy against Macrophage Passaged Mycobacterium tuberculosis

Assay תואם תפוקה גבוהה כדי להעריך יעילות התרופה נגד Macrophage passaged<em&gt; שחפת Mycobacterium</em

The early drug development process for anti-tuberculosis drugs is hindered by the inefficient translation of compounds with in vitro activity to ...

Cell-free Biochemical Fluorometric Enzymatic Assay for High-throughput Measurement of Lipid Peroxidation in High Density Lipoprotein

ללא תא הביוכימי Fluorometric Assay אנזימטי למדידה תפוקה גבוהה של שומנים בדם Peroxidation של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה

Low high-density lipoprotein cholesterol (HDL-C) levels are one of the most powerful independent negative predictors of atherosclerotic cardiovascular ...

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

A High-throughput, High-content, Liquid-based C. elegans Pathosystem

תפוקה גבוהה, גבוהה-תוכן, בנוזל C. elegans Pathosystem

The number of new drugs identified by traditional, in vitro screens has waned, reducing the success of this approach in the search for new weapons to ...