Name: expression, solubilization, and purification of eukaryotic borate transporters
Uploaded: 2019-03-07T15:15:00
Duration: 8 min 55 s
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この研究は、デービッドソン ・ カレッジでスタートアップ資金によって支えられました。

1. メディアと重要なバッファーの準備
<ol><li>ガラクトースと脱イオン水の 200 g を 500 mL の容量に追加することによって 40% ガラクトースの 500 mL を準備します。ホット プレートや電子レンジを使用して、ソリューションにガラクトースの率を高めます。0.2 μ m フィルター滅菌ガラスのビンを上部から成る真空ろ過装置と滅菌フィルター。 注: すべてのメディア ソリューションは、脱イオン水を使用して準備されます。</li>
	<li>グルコースと水の 200 g を 500 mL の容量に追加することによって 40% ブドウ糖 500 mL を準備します。オートクレーブ滅菌します。</li>
	<li>4 の 2 L フラスコに、ヒスチジン (CSM 彼)、3.35 g 酵母窒素アンモニウムの硫酸塩 (YNB + 窒素)、475 ミリリットルの水でなく完全な補完物 0.4 g を追加します。オートクレーブ。2% の最終的なグルコース濃度を達成するためにグルコースを 40 %25 mL を追加します。</li>
	<li>追加、ガラス瓶、50 g ペプトンと 25 グラム酵母エキスと 375 mL に水します。オートクレーブ。5 x 10% ガラクトースを含む酵母ペプトン (YP) ソリューションを与える 40% ガラクトースの 125 mL を追加します。</li>
	<li>0.04 g を 250 mL のフラスコに追加 CSM-彼の 0.335 g YNB + 窒素・ 47.5 mL に水。オートクレーブ。2.5 mL 40% ブドウ糖 50 mL CSM 彼を得るための追加 YNB + 2% ブドウ糖。</li>
	<li>800 mL の水で、トリス基本 121.14 g を混合することによって 1 M トリス pH 7.0 の 1 L を準備します。PH は、7.0 に達するまでは、濃塩酸を追加します。1 L の最終巻に水を追加し、0.2 μ m フィルターを通過します。</li>
	<li>400 mL の水と EDTA の 73.06 g を混ぜて 0.5 M エチレンジアミン四酸 (EDTA) pH 8.0 の 500 mL を準備します。EDTA が解散し、pH 8.0 に達するまでは、水酸化ナトリウムのペレットを追加します。500 mL の最終巻に水を追加し、0.2 μ m フィルターを通過します。</li>
	<li>200 証拠エタノール PMSF の 1.74 g を混ぜて 100 mM phenylmethanesulfonyl フッ化物 (PMSF) 100 mL を準備します。-20 ° C にてストア</li>
	<li>225 mL の 2 倍の 50 mM トリス pH 7.0, 1.4 M NaCl、20% グリセロールと 1 mM EDTA pH 8.0 で構成されるビーズ洗浄バッファーを準備します。</li>
	<li>20 mM 4 Morpholinoethanesulfonic 酸水和物 (MES) pH 6.5 では、100 mM の NaCl、2% グリセロールと 0.03 %n-ドデシル-ベータ-D-Maltopyranoside (DDM) から成る、サイズ排除クロマトグラフィー バッファー (S200) 100 mL を準備します。</li>
	<li>100 mL の 50 mM トリス pH 7.0, 500 mM, NaCl と 10% グリセロールから成る膜再懸濁バッファーを準備します。</li>
	<li>1.6 mL 2-メルカプトエタノール、0.03 g ブロモフェノールの青、2.4 mL 1 M トリス pH 6.8 グリセロール 3 mL 3 mL 20% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS) を混ぜて × SDS ページ読み込み染料 3 の 10 mL を準備します。</li>
</ol>2.酵母のホウ酸トランスポーターの発現
<ol><li>50 ml の CSM 彼の 3 つの変換されたイースト コロニーを接種 + 30 ° C で 190 rpm で一晩 YNB + 2% グルコース メディアやふれ</li>
	<li>次の日は、600 の波長で光の密度を決定する分光光度計を使用して nm (外径600) 各 4 2 L フラスコをそれぞれ含む CSM 彼の 500 mL の 0.01 外径600に接種して YNB + 2% グルコース メディア。</li>
	<li>すべてのグルコースを消費し、高密度成長する細胞を許可する 30 h 30 ° C で 190 rpm で横に振る。 注: 成長時間が長くより大きいセルの結果の結果が、大きい収穫膜利回り、最終的に大きい精製タンパク質が得られます。</li>
	<li>5 x YP 培地 2% ガラクトースの最終的な誘導濃度 10% ガラクトースの 125 mL を追加することによって式を誘導します。16 h 30 ° C で 190 rpm で横に振る。</li>
	<li>4,000 x gで 15 分間で回転による収穫細胞では、100 mL の冷たい水で細胞を再懸濁します。 注: この時点で細胞が凍結される-80 ° C で無期限に、またはセル換散および膜の収穫に引き続き、準備。我々 は通常細胞の 40-45 g を収穫します。</li>
</ol>3. 酵母の膜の収穫
<ol><li>プロテアーゼ阻害剤として行動する 2 つのセルの巻き上がり 1 M トリス pH 7.0 では、0.5 M の EDTA の 0.45 mL 11.25 mL と 100 mM PMSF、後者の 2.25 mL を加えます。225 mL の 50 mM Tris pH 7.0 では、1 mM EDTA、および 1 mM PMSF のセル再懸濁バッファー内の結果の最終巻に水を追加します。 注: ビーズ叩いて、換散を抵抗する場合は部分的に固定されたまま、ので、凍結細胞を使用してに徹底的に、常温で約 1 時間の解凍が細胞を許可するかどうか。</li>
	<li>ビーズを破っての 450 mL 金属キャニスターにセルの巻き上がりを追加します。冷たい 0.5 mm のガラスビーズを残りのボリュームの締めくくり。</li>
	<li>ローターとビーズの商工会議所を組み立てるし、氷水に浸します。ライセートの過熱を防ぐために 2 分残りピリオドで区切られた 6 の 1 分のパルスを実行します。</li>
	<li>ガラス瓶の中にプラスチック製の使い捨てボトル上部フィルターねじ込みによる吸引ろ過装置を組み立てます。残りのプラスチック製のデバイスを渡すライセートを許可しながら、ビーズをキャプチャできるため、ろ過膜を削除します。ライセートからアセンブリを真空の適用中にビーズ暴行部屋の内容を注ぐことによってビーズを分離します。</li>
	<li>225 ml 50 mM Tris pH 7.0 では、1 mM EDTA、1 mM PMSF、1.4 M の NaCl および 20% のグリセロールを含む洗浄バッファー x 2 のビード暴行商工会議所を洗います。それらを洗浄するためにビーズの上に商工会議所の内容を空にします。 注意: 洗浄分離 〜 450 mL 細胞の最終巻と大幅増加収穫された膜が得られます。最終濃度 50 mM Tris pH 7.0 では、1 mM EDTA、1 mM PMSF、10% グリセロールと 700 mM の NaCl、塩分濃度を高めることの主な目的は周辺膜蛋白質を分離します。</li>
	<li>細胞ライセート 15,000 × gで 15 分間スピンダウンします。ポリカーボネート瓶と膜を収集する超遠心機で 135,000 x gで 1 h のスピンに上澄みを注ぐ。 注: 超遠心機が利用できない場合膜は 53,000 x g、床モデルの遠心分離機の達成力で 3 時間回して収集可能性があります。</li>
	<li>上澄みを廃棄し、膜ペレットとボトルの重量を量る。50 mM Tris pH 7.0 では、500 mM の NaCl、および 10% グリセロールを含む膜再懸濁約 35 mL バッファー内膜ペレットを再懸濁します、ガラス douncer に追加します。収穫された膜の質量を決定する空遠沈管の重量を量る。 注: 効率的な膜収穫、膜の重量に等しくなります膜収穫用セルの重量約 20%。このプロトコルは 40-45 g の典型的な細胞収率を与える、従って私達は同様に 8-9 g 膜の収率を期待します。</li>
	<li>Dounce 均質膜、そして因数-80 ° C で不明確に保存されるかもしれない今 50 mL の円錐管に 注: この実験では、通常 2 つの因数作られています、1 つの元のセルの準備から実行する 2 つの別々 の蛋白質精製できるように。</li>
</ol>4. 可溶化およびタンパク質の精製
<ol><li>ビーカーに攪拌棒と n-ドデシル-β-D-Maltopyranoside (DDM) 使用されている g 膜ごとの 150 mg を追加します。蛋白質または 4 ° C で氷の上を保つため、すべての回で。 注: DDM は吸湿性、使用しないときは-20 ° C で乾燥剤をガラスの瓶に保存する必要があります。また、純粋な蛋白質のかなりの量を取得する浄化膜の 4-5 g 間で使用する一般的なです。</li>
	<li>膜を融解し、g 膜膜再懸濁バッファー 1 mM PMSF と 20 mM のイミダゾール pH 8.0 補われるあたり 15 mL の最終巻。DDM とビーカーに膜を追加し、4 ° C で 1 時間攪拌 注: DDM 濃度 1 %w/v になりますが、膜タンパク質の可溶化 g 膜ごと追加洗剤量を認識するより重要であります。</li>
	<li>非溶解材料をペレットへの 4 ° C で 135,000 x gで 25 分のスピンします。上清を 5 μ m のシリンジ フィルターをフィルターします。</li>
	<li>蠕動ポンプによってサンプル 1 mL 固定化ニッケル アフィニ ティー ・ カラムに 1 mL/min の流量に設定負荷平衡 0.05%、20 mM のイミダゾール pH 8.0、10% グリセロール 20 mM Tris pH 7.0, 500 mM の NaCl の DDM。 注: 低発現蛋白質のため改良された純度・収量を用いて観察された 1 mL 5 mL 列、およびコバルト イオンではなくニッケルではなくアフィニ ティー ・ クロマトグラフィーのため。</li>
	<li>0.05%、80 mM のイミダゾール pH 8.0、10% グリセロール 20 mM Tris pH 7.0 では、500 mM の NaCl を含む洗浄バッファーの 10 列ボリュームを洗い流す DDM。 注: 10 彼タグ付きタンパク質の洗浄時に使用できるイミダゾールの集中は一般的に高く評価されており、改良された純度の結果よりも高い。</li>
	<li>0.05%、300 mM のイミダゾール pH 8.0、10% グリセロール 20 mM Tris pH 7.0 では、200 mM の NaCl を含むバッファーにタンパク質を溶出 DDM。10 1 mL で溶出液を収集し、, 可溶化ライセートと洗って分数とともに 4 20% トリス-グリシン-SDS のページ ゲルでランします。</li>
	<li>通常 5-6 mL の濃縮液 500 μ L 以下 4 ° C で冷蔵ベンチトップ遠心分離機で 50 kDa カットオフ コンセントレーターのボリューム、プール ピーク画分 注: 500 μ L は典型的な最大ボリューム サイズ排除クロマトグラフィ (SEC) カラムに注入です。この時点で蛋白質は-80 ° C で不明確に保存されるかもしれないまたは秒に続き</li>
	<li>0.2 μ m 回転カラム フィルターを通してタンパク質をフィルターし、S200 バッファーのサイズ排除カラム (例えば、 Superdex 200) に注入: 0.03%、2% のグリセロール、20 mM Mes pH 6.5 では、100 mM の NaCl DDM。 メモ: 以降グルタルアルデヒド架橋試金、緩衝剤は第一級アミンを含まれてはいません。Mes のトリスを交換するときにここで行うと、必要に応じてバッファーを交換する機会です。</li>
	<li>ピーク分数 4 20% トリス-グリシンの SDS ページのゲルを実行します。ゲルを染色、純粋なピーク画分を収集、4 ° C で 50 kDa カットオフ コンセントレーターに集中</li>
	<li>-80 ° C で無期限にストアの 280 nm の波長で吸光度を測定することによってタンパク質の濃度を測定します。</li>
</ol>5. グルタルアルデヒド架橋法
<ol><li>S200 バッファー、S200 バッファー、1 μ L の水または 20% ドデシル硫酸ナトリウム (SDS)、1.5% グルタルアルデヒドの 1 μ L に続いての 5 μ L で 0.5 mg/mL 蛋白質の 3 μ L を混合することによって 10 μ L 反応を準備します。 注: これは 0.15 mg/mL タンパク質と 0.15% グルタルアルデヒドの 1 x 反作用を与えます。SDS の前処理を含むサンプルは重要なマイナス コントロールし混合し、グルタルアルデヒドを追加する前に 5 分間室温でインキュベートする必要があります。</li>
	<li>室温で 30 分間反応を孵化させなさい。ローディングの染料、グルタルアルデヒドを消光 Tris バッファーの過剰を含む SDS ページのゲル x 3 の 5µL を追加することで反応を停止させます。</li>
	<li>1 レーンあたり 1.5 μ g のタンパク質を読み込む 4 20% トリス-グリシン-SDS のページ ジェルの上に 15 μ L すべてをロードします。200 V で 30 分間染色でゲルを実行し、変性の単量体のサイズの 2 倍で動作するバンドの証拠によってダイマー架橋の程度を決定します。 注: グルタルアルデヒド滴定と時間経過が行われる最初 homomeric トランスポーターの最適な条件を見つけること。</li>
</ol>

<ol>
	<li>Drew, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).</li><li>Goehring, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies.">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).</li><li>Andr&#233;ll, J., Tate, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies.">Overexpression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Molecular Membrane Biology. 30 (1), 52-63 (2013).</li><li>Lyons, J. A., Shahsavar, A., Paulsen, P. A., Pedersen, B. P., Nissen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+strategies+for+structural+studies+of+eukaryotic+membrane+proteins.">Expression strategies for structural studies of eukaryotic membrane proteins.</a> Current Opinion in Structural Biology. 38, 137-144 (2016).</li><li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins.">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14 (4), 673-681 (2006).</li><li>Fairbanks, G., Steck, T. L., Wallach, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+analysis+of+the+major+polypeptides+of+the+human+erythrocyte+membrane.">Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane.</a> Biochemistry. 10 (13), 2606-2617 (1971).</li><li>Thurtle-Schmidt, B. H., Stroud, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+Bor1+supports+an+elevator+transport+mechanism+for+SLC4+anion+exchangers.">Structure of Bor1 supports an elevator transport mechanism for SLC4 anion exchangers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (38), 10542-10546 (2016).</li><li>Coudray, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+SLC4+transporter+Bor1p+in+an+inward-facing+conformation.">Structure of the SLC4 transporter Bor1p in an inward-facing conformation.</a> Protein Science. 26 (1), 130-145 (2016).</li><li>Arakawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+anion+exchanger+domain+of+human+erythrocyte+band+3.">Crystal structure of the anion exchanger domain of human erythrocyte band 3.</a> Science. 350 (6261), 680-684 (2015).</li><li>Huynh, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CryoEM+structure+of+the+human+SLC4A4+sodium-coupled+acid-base+transporter+NBCe1.">CryoEM structure of the human SLC4A4 sodium-coupled acid-base transporter NBCe1.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Zhao, R., Reithmeier, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+characterization+of+the+anion+transporter+homologue+YNL275w+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Expression and characterization of the anion transporter homologue YNL275w in Saccharomyces cerevisiae.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 281 (1), 33-45 (2001).</li><li>Takano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+boron+transporter+for+xylem+loading.">Arabidopsis boron transporter for xylem loading.</a> Nature. 420, 337-340 (2002).</li><li>Nakagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+specificity+of+the+expression+of+Os+BOR1,+a+rice+efflux+boron+transporter+gene,+is+regulated+in+response+to+boron+availability+for+efficient+boron+uptake+and+xylem+loading.">Cell-type specificity of the expression of Os BOR1, a rice efflux boron transporter gene, is regulated in response to boron availability for efficient boron uptake and xylem loading.</a> Plant Cell. 19 (8), 2624-2635 (2007).</li><li>Hays, F. A., Roe-Zurz, Z., Stroud, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+and+purification+of+integral+membrane+proteins+in+yeast.">Overexpression and purification of integral membrane proteins in yeast.</a> Methods in Enzymology. 470, (2010).</li><li>Chang, Y. -. N., Geertsma, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+class+of+seven+transmembrane+segment+inverted+repeat+carriers.">The novel class of seven transmembrane segment inverted repeat carriers.</a> Biological Chemistry. 398 (2), 165-174 (2017).</li><li>Robertson, J. L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+function+and+structure+of+a+monomeric+ClC+transporter.">Design, function and structure of a monomeric ClC transporter.</a> Nature. 468 (7325), 844-847 (2010).</li><li>Last, N. B., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Monomerization+of+a+ClC-Type+Fluoride+Transporter.">Functional Monomerization of a ClC-Type Fluoride Transporter.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (22), 3607-3612 (2015).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimeric+structure+of+the+uracil:proton+symporter+UraA+provides+mechanistic+insights+into+the+SLC4/23/26+transporters.">Dimeric structure of the uracil:proton symporter UraA provides mechanistic insights into the SLC4/23/26 transporters.</a> Cell Research. 27 (8), 1020-1033 (2017).</li></ol>

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ここで、我々 は 3 つの異なる真核生物のホウ酸トランスポーターの同質性に浄化、詳細なプロトコルを共有しています。ここに示すプロトコルは、純度の向上、歩留り向上最適化結果および出芽酵母1,14、不可欠な膜タンパク質の発現のための他のプロトコルから派生されます。ここで最適化されたパラメーター、細胞培養成長量と時間、ビーズ溶解手順、セル換散バッファー組成および親和性の浄化で蛋白質の浄化、グラム膜、金属イオンに対して使用する洗剤の量を識別アフィニ ティー ・ カラムと架橋アッセイ運送者オリゴマーのポリコームタンパク状態を評価することによって相同物と洗剤の適合性を評価するための実装のボリューム。プロトコルは、植物と菌類の種組成から複数 SLC4 同族体の成功。不可欠な膜蛋白質の浄化のためのすべての戦略の制限は、普遍的な膜蛋白質の浄化の方法には、動作する保証は存在しないことです。私達のプロトコルが15をターゲット シーケンス id および SLC4 トランスポーターそしてこうして SLC4、SLC23、および SLC26 家族構造に近いタンパク質が有望なことができるため、成功する可能性が高いことは可能です。同様より進化のホウ酸トランスポーターから遠い膜トランスポーターがあります、プロトコルが式システム、洗剤、またはその他の重要なパラメーター4を変えることによって異なる、このようでなければならないとしている可能性が高く。
プロトコルは、蛋白質の浄化、彼タグの最も一般的に使用される親和性タグの活用します。初期溶出画分中の不純物の存在、にもかかわらずニッケル親和性、広範な洗浄およびそれに続く SEC 浄化の組み合わせは、高純度のタンパク質の結果します。10-His タグによりより厳格なイミダゾールを洗うため洗浄によって 8 彼- または 6-彼-タグを許可で削除することができますよりもより多くの背景結合蛋白質できますように。純粋な分数の私たちの選択は、ほとんどの非常に純粋なゲルの分数は、ピークの秒端数に対応の保守的な側に誤る。わずかにより少なく純粋な蛋白質のトレードオフはあるものの、プールおよび複数の分数を集中して最終的な蛋白質収量を大きくできます。ここで示される方法有効数量ではそのタグを切断し、別にトランスポーターを交換から成る浄化の違いとその結晶構造7の決定につながった AtBor1 の精製結晶回折7を改善する洗剤です。
我々 のプロトコルは、同族体と使用可溶化し、それらを浄化する洗剤の選択の重要な考慮事項を発生させます。それは比較的穏やかな、可で成功した多くの場合、さまざまな膜タンパク質の構造と機能の研究で使用されていますので、DDM は洗剤の共通の最初の選択肢です。洗剤が膜は貧しい人々 の選択であるかどうかを決定する、評価の一般的な方法は蛋白質が、SEC クロマト グラム上の単一単分散ピークではなく void ボリュームまたは多ピークの範囲で大きなピークを与えるかどうかを誤って折りたたまれた、または不安定な蛋白質を示します。微妙な考察は、ScBor1 の私たちの浄化によって発生します。それは大量と良好なルックスと単分散構造研究のための魅力的なターゲットをことを示唆している、SEC のクロマト グラム上で浄化します。ただし、我々 の架橋分析精製時のモノマーであること明らかにします。それは ScBor1 ことができるネイティブ セルの単量体として存在することが可能ですが、研究を示す SLC4 トランスポーターとそのホモログが二量体7,8,9,10をする可能性があります。結晶化と AtBor1 の構造を解決後に架橋の試金の開発が発生しました。しかし、我々 は架橋試金で AtBor1 と比較して ScBor1 を評価することがされていた貴重な時間と研究の取り組みは、後者の場合、最終的に、失敗は、ScBor1 ではなく AtBor1 の追求にリダイレクトされている可能性があります結晶化と回折の実験。この試金はこうして同族体または構造の研究を進めてときにタンパク質がその疑いのネイティブ構造を維持して条件の優先順位を設定するために使用する洗剤を区別する研究者を助けることができます。さらに、アッセイは、どのアミノ酸が多量体形成インターフェイスとモノマーを義務づけるに鉛を不安定にアミノ酸置換を見つけるために、多量体形成の重要なプローブを使用できます。このようなアプローチは、膜輸送体16,17,18homomeric アセンブリの機能的意義をプローブに使用されています。
本手法の一般的な利点は、酵母を多様な機能1の多くの挑戦的な膜蛋白質の表現を有効にするのに示されていることです。さらに、その低コストと成長時間少ないティッシュ文化または高価な成長媒体を必要とする表現の戦略を使用することができることができる多くの研究努力のためのアクセシビリティも向上します。ここで説明されている手順は比較的高価であり、アプローチの可能性を強調している 1 週間で実行できます。これらのプロトコルの実装は、他の困難な膜タンパク質の構造と機能の研究を有効にすることができます。

精製膜タンパク質の十分な量を得ることが困難まま受容体、イオン チャンネル、トランスポーターの構造と機能研究の追求の重大なボトルネックになります。後続の in vitro研究1,2,3,4 を有効にするのに十分に表現する画面と検索候補の膜タンパク質を適度に高いスループットのパイプラインの多くのプロトコルが存在します。.通常、タンパク質の N 末端または C 末端緑色蛍光タンパク質 (GFP) でタグ付けされて、ゲルの蛍光または蛍光検出サイズ排除クロマトグラフィー (FSEC)5のいずれかの表現のレベルが監視されます。このようなアプローチは、高発現するタンパク質、中程度または低蛋白質を表現するまたは悪いまたは全く表現蛋白質に膜タンパク質の候補者のトリアージを有効にします。このアプローチは、実験的なデザインがどの蛋白質表現最高を選択するつもりで候補者の遺伝子の多数を調査する場合は、動作します。ただし、いくつかのケースでの実験的アプローチは、その蛋白質の表現のレベルが中程度または低い範囲内に挑戦することができます特定の膜タンパク質を勉強を前提と。さらに、時々 これらのケースで発現レベル最小限しか大きくできます切り捨て、thermostabilizing の突然変異やコドン最適化を介して構造を変えることによって。それは、したがって、そこそこよくのみを表現する膜タンパク質の膜蛋白質の発現と精製プロトコルを最適化するために必要な場合。
トランスポーターの SLC4 家族には炭酸トランスポーター陰イオン交換器 1 (バンド 3 として知られている)、赤血球6で最も多い膜タンパク質、細胞呼吸の重要なドライバーが含まれています。SLC4 家族は植物に重要なナトリウム結合 SLC4 トランスポーター7,8,9 だけでなく、陰イオン交換器 1 に類似した構造を示すことが示されているホウ酸トランスポーターと相同、10。ここで酵母や植物は、3 つの異なるホウ酸トランスポーターを浄化する酵母を使用最適化された蛋白質の発現と精製のプロトコルを報告します。我々 は収量と同質性に浄化の効率を最適化するために行った詳細キー手順で強調表示します。また、我々 はグルタルアルデヒドを使用して精製タンパク質洗剤脂質複合体のコンテキストでこれらの運送者ポリコームタンパク アセンブリを監視する化学架橋アッセイを報告します。架橋実験は、浄化後の運送者オリゴマー ポリコームタンパク状態を評価することによって相同物と洗剤の適合性を評価できます。
このプロトコルでは、目的のトランスポーターは、出芽酵母における発現の GAL1 プロモーターの誘導制御の下で派生 2 μ プラスミドにクローン化されていますを前提としています。これらの手順の DNA を使用したフルレングスの野生型のホウ酸トランスポーター酵母Bor1 をエンコード (ScBor1)11、シロイヌナズナBor1 (AtBor1)12、およびイネの Bor3 (OsBor3)13.各構成体の C 末端は 10-His タグを付加し、胸の谷間のトロンビン サイト トランスポーターとタグの間 10-彼 - の除去を有効に挿入目的します。プロトコルはまた、プラスミド、DSY 5 式ひずみ出芽酵母の完全な補足選択培地 (CSM) にヒスチジンに欠けているに既に変換されていることを仮定します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:823px;" width="822">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">M3148</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate (MES)</td>
			<td style="width:199px;">Acros</td>
			<td>172591000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#196;kta Pure 25 L FPLC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29018224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Amicon Ultra 15 mL, 50 kDa MWCO concentrator</td>
			<td style="width:199px;">Millipore</td>
			<td>UFC905024</td>
			<td>for concentrating nickel column fractions</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Amicon Ultra 4 mL, 50 kDa MWCO concentrator</td>
			<td style="width:199px;">Millipore</td>
			<td>UFC805024</td>
			<td>for concentrating S200 fractions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Bacto Peptone</td>
			<td style="width:199px;">BD Diagnostics</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bacto Yeast Extract</td>
			<td style="width:199px;">BD Diagnostics</td>
			<td>288620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:343px;">Glass Erlenmeyer flask, 2L</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS44442L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Benchtop centrifuge</td>
			<td style="width:199px;">Sorvall</td>
			<td style="width:115px;">Legend RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bottle top filter</td>
			<td style="width:199px;">Nalgene</td>
			<td>595-4520</td>
			<td>the membrane is removed and used to filter glass beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>114391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Complete supplement mixture without histidine</td>
			<td>Sunrise Science</td>
			<td>1006-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-Galactose</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>RDD016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol, 200 proof</td>
			<td style="width:199px;">Pharmco-Aaper</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gel tank SDS-PAGE system</td>
			<td style="width:199px;">Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass bead-beating cell disruptor</td>
			<td style="width:199px;">BioSpec</td>
			<td>1107900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass beads, 0.5mm</td>
			<td style="width:199px;">BioSpec</td>
			<td colspan="2">11079105&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:343px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:199px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:115px;">16019</td>
			<td>sent as an 8% solution under nitrogen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Glycerol</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">HiTrap IMAC FF column, 1 mL</td>
			<td style="width:199px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:115px;">17-0921-02</td>
			<td>charged with nickel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imidazole</td>
			<td style="width:199px;">Acros</td>
			<td>12202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Instant Blue gel stain</td>
			<td style="width:199px;">Expedeon</td>
			<td style="width:115px;">ISB1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">JA-10 rotor</td>
			<td style="width:199px;">Beckman</td>
			<td>369687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:343px;">JA-14 rotor</td>
			<td style="width:199px;">Beckman</td>
			<td>339247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Microcentrifuge tubes, 1.5mL</td>
			<td style="width:199px;">Thermo Scientific</td>
			<td>3451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Microcentrifuge, refrigerated</td>
			<td style="width:199px;">Fisher</td>
			<td>13-100-676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-Protean Tris-glycine gels, 4-20%</td>
			<td style="width:199px;">Bio-Rad</td>
			<td>456-1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minipuls 3 peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F155005</td>
			<td>used for loading lysate onto affinity column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside (DDM)</td>
			<td style="width:199px;">Inalco</td>
			<td>1758-1350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nickel(II) Sulfate Hexahydrate</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>227676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:343px;">Orbital shaking incubator with temperature control</td>
			<td style="width:199px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:115px;">C24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">p423 GAL1 plasmid with borate transporter insert</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td>available from authors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td style="width:199px;">Acros</td>
			<td>215740050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Polycarbonate ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:199px;">Beckman</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Polypropylene bottles, 250mL</td>
			<td style="width:199px;">Beckman</td>
			<td style="width:115px;">356011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Polypropylene bottles, 500mL</td>
			<td style="width:199px;">Beckman</td>
			<td>355607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:343px;">Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards</td>
			<td style="width:199px;">Bio-Rad</td>
			<td>1610375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">S. cerevisiae expression strain DSY-5</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td>available from authors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spin column with 0.2 &#181;m filter, 0.5mL</td>
			<td style="width:199px;">Millipore</td>
			<td>UFC30GV0S</td>
			<td>for filtering protein before injecting onto S200 column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sterile Falcon tubes, 15mL</td>
			<td style="width:199px;">Lab Depot</td>
			<td style="width:115px;">TLD431696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sterile Falcon tubes, 50mL</td>
			<td style="width:199px;">Lab Depot</td>
			<td style="width:115px;">TLD431698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superdex 200 10/300 GL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5175-01</td>
			<td>used for SEC purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe filter, 5&#181;m</td>
			<td style="width:199px;">Pall</td>
			<td>4650</td>
			<td>for filtering lysate before loading affinity column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Tris-base</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:343px;">Type 70 Ti rotor</td>
			<td style="width:199px;">Beckman</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:343px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:199px;">Beckman</td>
			<td style="width:115px;">L8-70M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">YNB+Nitrogen without amino acids</td>
			<td>Sunrise Science</td>
			<td>1501-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, solubilization, and purification of eukaryotic borate transporters

蛋白質の溶質のキャリア 4 (SLC4) 家族炭酸トランスポーターと典型的なタンパク質陰イオン交換器 1 (AE1、バンド 3 として知られている)、赤色の血液細胞で最も多い膜タンパク質が含まれています。SLC4 家族は相同ホウ酸のトランスポーターは、植物および菌類の特徴とされています。表現し、膜輸送タンパク質構造や機能研究に適した分量の同質性に浄化の重要な技術的な課題が残っています。ここで洗剤、及びs. からのホウ酸トランスポーターの同族体の精製酵母酵母の膜の分離、タンパク質の可溶化におけるホウ酸輸送体の過剰発現の詳細な手順を説明します。酵母、シロイヌナズナとイネ。我々 はまた、グルタルアルデヒド架橋 homomeric トランスポーターの多量体形成を分析するための実験を詳しく説明します。私たちの一般的な手順はすべての 3 つのタンパク質に適用することができ、有効性に最適化されています。ここで開発戦略の多くは、他の困難な膜タンパク質の研究のため利用できます。

ニッケルのアフィニ ティー ・ クロマトグラフィーの実行から溶出画分の典型的なゲルは、すべて 3 つのタンパク質部分精製 (図 1A) を表示します。はしごの右にし、ライセート、よくノザンかない蛋白質のために典型的であるホウ酸トランスポーターに対応する重要なバンド表示されない各場合でです。80 mM 洗浄車線比較的高いイミダゾールの集中にもかかわらず 10 彼タグ付きタンパク質の最小の損失を示しています。ホウ酸のトランスポーターに対応するバンドは溶出画分に容易に明らかであり、溶出蛋白質の大部分を含むとみなされる分数が S200 ゲルろ過カラムに注入する前に集中しています。この段階でタンパク質が充分に精製多く下流用 S200 列 (図 1B) に注入する前に集中してサンプルで余分なバンドによって示される。ただし、サイズ排除カラムに試料を注入する高純度 (図 1B C) の溶出画分を明らかにします。クロマト グラムとホウ酸輸送体のそれぞれに対応するジェルが掲載されています。アフィニ ティー ・ クロマトグラフィーの溶出時にサンプルの適度な純度、にもかかわらず蛋白質はゲル濾過カラムから溶出時に高純度。批判的に、クロマト グラムは、ボイド ボリュームで保持されるほとんどのタンパク質で主に単一単分散ピークとして移行する各蛋白質を明らかにします。一般的に、安定と折り畳まれたタンパク質は、不安定、誤って折りたたまれた、または集約されたタンパク質が void のボリュームで複数の非対称ピークまたは大きなピークを与える一般的に、単分散と優れたピーク対称を与えます。ScBor1、および約 1 mg 各精製の AtBor1 と OsBor3 の L カルチャごとの酵母培養の L あたり約 2 mg 精製蛋白質の最終的な収量を入手するが一般的です。これらの番号は 1 つに由来する膜の 4-5 g の 1 つの因数から精製された蛋白質の量の元のセルの準備の半分。
架橋実験精製 homomeric トランスポーターが容易に評価ソリューション (図 2) にそのアセンブリを持つことができますを示しています。SDS の前処理を含むサンプルの目的は、架橋がソリューションにたたんだ状態に依存して架橋したがってが発生しないこと多量体形成は過酷な洗剤によって破壊されるときを示すことです。結果、3 つのホウ酸トランスポーター、ScBor1 の 1 つはない二量体化他の 2 つ、AtBor1 と OsBor3、架橋ダイマー化を表示し、これらの条件で DDM で精製したときを区別します。すべてのタンパク質がクロスリンク可能性がありますを参照してくださいすることが可能です。この例では、AtBor1 が完了するクロスリンク間 OsBor3 モノマーの微量が表示、されます。架橋の程度が、互いに近接のリジン残基の数によって異なります、他の架橋試薬が異なる膜タンパク質を架橋して効率的に可能。
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59166/59166fig1.jpg"> 図 1.3 つのホウ酸トランスポーターの親和性とサイズ排除クロマトグラフィー精製をニッケルします。各垂直パネル (A)、(B) と (C) ScBor1、AtBor1、および OsBor3 のためのデータが含まれています。(A) ニッケルのアフィニ ティー ・ カラム。M 左に指定された kDa の重みを持つ分子量マーカーの梯子であります。L はライセート、原油、W は 80 mM のイミダゾール洗浄。他のすべての番号付きの車線は、300 mM のイミダゾールと溶出 1 mL の一部分に対応します。分数上記バーを結合し、列に注射用集中種別を示します。(B) P は、S200 列に注入する前に高濃度タンパク質を示します。溶出の秒端数は、ゲルの車線である (C) のクロマト グラム分数に合わせて金具右へ。ボイド ボリュームは 8 mL の直後後です。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59166/59166fig1large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59166/59166fig2.jpg"> 図 2.精製のトランスポーター ポリコームタンパク アセンブリを評価するアッセイを架橋します。分子量の梯子は、左側に表示されます。とりわけどのタンパク質が存在し、グルタルアルデヒド追加または SDS のグルタルアルデヒド加算の前に前処理サンプルがあったかどうか、他のレーンが表示されます。矢印は、AtBor1、OsBor3 のモノマー、ダイマーの位置を示します。ScBor1 は AtBor1、OsBor3 より小さい蛋白質を期待どおりに実行します。<a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59166/59166fig2large.jpg" target="_blank">この図の拡大版を表示するのにはここをクリックしてください</a>。

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Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

式、可溶化、および真核生物ホウ酸輸送体の浄化

ここで表現し、可溶化、酵母を用いた SLC4 トランスポーター家族に相同性を有するいくつかの真核生物のホウ酸トランスポーターを浄化するプロトコルを提案します。ポリコームタンパク アセンブリの精製 homomeric タンパク質を評価する化学架橋法についても述べる。これらのプロトコルは、他の困難な膜タンパク質の合わせることができます。

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

下流の用途に十分な量の膜タンパク質を得るは、依然として重要な技術的課題です。このプロトコルは、均質性に複数の膜輸送タンパク質の精製を可能にする。この技術の主な利点は、サッカロミセス・セレビシエは、多くの主要な実験変数の最適化を可能にする膜タンパク質の時間と費用対効果の高い真核生物発現系であるということです。ヒスチジンを含まない完全な補充選択的培地の50ミリリットルで、3つの形質転換酵母コロニーを接種することから始める。1分あたり190回転、摂氏30度で一晩インキュベーションのために酵母窒素ベースと2%グルコースを補充。翌日のカルチャを削除します。分光光度計を使用して、600ナノメートルまたはOD 600で光学密度を決定します。500ミリリットルの培養培地を含む4つの2リットルフラスコをそれぞれ0.01のOD600に接種する。その後、細胞がブドウ糖のすべてを消費し、高密度に成長できるように、30°Cで毎分190回転で培養を30時間振ります。ホウ酸トランスポーター発現を誘導するには、5 x酵母ペプトン培地の125ミリリットルを加え、16時間摂氏30度で毎分190回転で10%ガラクトースを補う。その後、遠心分離によって酵母細胞を収穫し、100ミリリットルの冷水でペレットを再懸濁します。渦巻きは、酵母ペレットを再懸濁し、ペレットを含むすべてのボトルでこれを行うために溶液を連続的に移す。酵母膜を収穫するには、まず、1モルトリス11.25ミリリットル、0.45ミリリットルの0.5モルEDTA、100ミリモルPMSFの2.25ミリリットルを再懸濁細胞に加えます。225ミリリットルの最終体積に水を加え、450ミリリットルの金属ビーズを叩くキャニスターに細胞を移します。冷たい0.5ミリメートルガラスビーズで残りのボリュームを上げ、ローターでビーズのビーディングチャンバーを組み立てます。チャンバーを氷浴に浸し、ライセートの過熱を防ぐために2分間の休憩時間で区切られた6つの1分間のパルスを実行します。最後のパルスの後、ガラス瓶にねじ込まれたプラスチック製の使い捨てボトルトップフィルターからろ過膜を取り外し、真空を適用しながらビーズビーディングチャンバーの内容物をアセンブリに注ぎます。その後、2つのxビーズ洗浄バッファーをチャンバーに加えて旋回し、ビーズに追加して洗い流します。225ミリリットルの洗浄バッファーでビーズのビーディングチャンバーをすすいで、チャンバーの内容物でビーズを洗います。遠心分離によってリセートを収集し、膜の収集のための超遠心分離のためのポリカーボネートボトルに上清をデカント。超遠心分離の終わりに上清を捨て、膜の再懸濁液の約35ミリリットルで膜を再懸濁する前に、膜ペレットでボトルを秤量します。ガラスDouncerに懸濁液を加え、その後、膜にホモジュネートのアリコートを均質化し、50ミリリットルの円錐管にしてマイナス80°Cの貯蔵を行います。空の遠心分離機ボトルの重量を量って、収穫された膜の質量を決定します。タンパク質の可溶化と精製のために、氷上のビーカーに膜1グラム当たり攪拌棒と150ミリグラムのDDMを加え、解凍した膜を膜再懸濁液の15ミリリットルの最終体積に再懸濁させ、膜1グラムあたり1ミリモルPMSFと20ミリモルイミダゾールを補う。膜溶液をビーカーに加え、氷浴で1時間攪拌します。続いて非可溶化材料をペレットに遠心分離する。4°Cの冷たい部屋で、5マイクロメートルのシリンジフィルターを通して上澄み液をろ過し、1ミリリットル固定化ニッケル親和性カラムにサンプルをロードするために毎分1ミリリットルの流量に設定された蠕動ポンプを使用し、洗浄バッファーの10カラム体積でカラムを洗浄し、溶出バッファーでタンパク質を希釈する。10 1ミリリットル分の分画で溶出物を収集する。収集したゲル分数を4〜20%Tris-Glycine SDSページゲルに加え、可溶化した溶解物と室温で分画を洗浄し、収集した分画を500マイクロリットル以下の体積に引き上げ、ベンチトップ遠心分離器のベンチトップ遠心分離器で500マイクロリットル以下の体積に引き上げます。0.2マイクロメートルのスピンカラムフィルターを介して濃縮タンパク質をフィルターし、S-200バッファで平衡化されたサイズ排除カラムに濾過物を注入します。2番目の4〜20%Tris-Glycine SDSページゲルでピーク画分を実行した後、ゲルを染色し、ちょうど実証したように摂氏4度で50キロダルトンカットオフ濃縮器に濃度のための純粋なピーク画分を収集します。次に、280ナノメートルの波長でタンパク質サンプルの吸光度を測定し、サンプルを80°Cの陰度で無期限に保存する前に濃度を測定します。グルタルアルデヒド架橋アッセイを実行するには、まず、解凍したタンパク質の1ミリリットル当たり0.5ミリグラムをS-200バッファーの3マイクロリットルに加え、S200バッファーの5マイクロリットルに添加します。20%ドデシル硫酸ナトリウム1マイクロリットルと1.5%グルタルアルデヒドの1マイクロリットルを添加して、陰性対照反応を完了します。1マイクロリットルの水と1.5%グルタルアルデヒド1マイクロリットルを添加して、実験サンプルを完成させます。室温で30分後、3x SDSページゲルローディングダイの5マイクロリットルで反応を終了させ、過剰なトリスバッファーを含み、グルタルアルデヒドをクエンチし、溶液の15マイクロリットルすべてを4〜20%Tris-Glycine SDSページゲルにロードします。次いで、染色前に200ボルトでゲルを30分間実行し、変性モノマーの2倍の大きさで走るバンドによって証明されるように、ダイマー架橋の程度を決定する。ゲルにゲル染色を加えた低速軌道シェーカーで振ってゲルを汚す。ここでニッケル親和性クロマトグラフィーから排除された分画の典型的なゲルは、溶解物の画分を有する3つの部分的に精製されたタンパク質を示し、十分に発現しないタンパク質に対して期待されるようにホウ酸輸送体に相当する有意なバンドを実証していない。各ゲルのアドミリモル洗浄レーンは、比較的高いエミッタの古い濃度にもかかわらず、10個のヒスチジンタグ付きタンパク質の損失を最小限に抑えることを示しています。ホウ酸トランスポーターに対応するバンドは、排除された分数で容易に明らかである。S200カラム注入の前に、各サンプルの余分なバンドによって示されるように、タンパク質は多くの下流アプリケーションのために不十分に精製されます。しかし、サイズ排除カラムへの注入後、高純度の分画を排除することが観察される。架橋は、精製されたホモメリックトランスポーターが互いに近接するリジン残基の数に依存する架橋の程度で容易に溶液中のアセンブリを持つことができることを示す細胞収穫が始まると、タンパク質は常に冷たく保たなければならないことを覚えておくことが重要である。4°Cの部屋で氷の上に、またはデリケースのいずれかで。この手順に従って、膜タンパク質は、X線結晶学またはクライオ電子顕微鏡を含む生物物理学的、生化学的または構造的方法によってさらに特徴付けることができる。均質なタンパク質のミリグラム量の精製を可能にすることによって、これらの技術は、シロイヌナズナ1輸送体の結晶構造を決定するために使用された。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

にバインドされた熱安定、発現、精製、およびヒトセロトニントランスポーターの結晶化<em&gt; S</em&gt; - シタロプラム

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

真核細胞からのタンパク質複合体のタンデムアフィニティー精製

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

S100A12の発現、精製および抗菌活性

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

哺乳類 Bestrophin イオン チャネルの発現と精製

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

真核生物 mRNA 蛋白質複合体を回復するオリゴヌクレオチド系タンデム型 RNA の隔離プロシージャ

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

式と単一粒子の低温電子顕微鏡による構造決定のための人間脂質感受性陽イオン チャネル TRPC3 の精製

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

ヌクレアーゼフリー酸素スカベンジャープロトカテク酸プロトカテクエート3,4-ジオキシゲナーゼの発現と精製

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

フマリアルセトーアセテートヒドロラーゼドメイン含有タンパク質の発現、精製、結晶化、酵素アッセイ

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

大腸菌における異種発現による膜トランスポーターの特性評価と膜小胞の産生

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Mechanical Separation and Protein Solubilization of the Outer and Inner Perivitelline Sublayers from Hen's Eggs

鶏卵からの外側および内側のペリビテリンサブ層の機械的分離とタンパク質可溶化

The perivitelline layer that surrounds the egg yolk plays a fundamental role in fertilization, in egg defense, and in the development of the avian embryo. ...