Name: expression, solubilization, and purification of eukaryotic borate transporters
Uploaded: 2019-03-07T15:15:00
Duration: 8 min 55 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters at JoVE.com

Denne forskningen ble støttet av oppstart midler på Davidson College.

1. forberedelse av media og viktig buffere
<ol><li>Forberede 500 mL av 40% galaktose ved å legge 200 g galaktose og de-ionisert vann til et totalt volum på 500 mL. Bruk en kokeplate eller mikrobølgeovn for å øke hastigheten på galaktose å komme inn i løsningen. Sterilt filter med en vakuum filtrering apparater som består av en 0,2 µm filter topp knyttet til en steril glassflaske. Merk: Alle medieløsninger tilberedes med de-ionisert vann.</li>
	<li>Forberede 500 mL av 40% glukose ved å legge 200 g glukose og vann til et totalt volum på 500 mL. Autoclave å sterilisere.</li>
	<li>I hver av de fire 2 L flasker, legge 0,4 g av komplette tilskudd blanding uten histidin (CSM-hans), 3,35 g gjær nitrogen base med ammonium sulfate (YNB + nitrogen) og 475 mL vann. Autoclave. Legg til 25 mL av 40% glukose å oppnå en siste glukose konsentrasjon på 2%.</li>
	<li>Legge til en glassflaske og 50 g pepton 25 g gjærekstrakt og vann til 375 mL. Autoclave. Legge til 125 mL av 40% galaktose å gi 5 x gjær pepton (YP) løsning som inneholder 10% galaktose.</li>
	<li>Legge til en 250 mL kolbe, 0.04 g CSM-hans, 0.335 g YNB + nitrogen og vann til 47,5 mL. Autoclave. Legge til 2,5 mL av 40% glukose å få 50 mL av CSM-hans + YNB + 2% glukose.</li>
	<li>Forberede 1 L 1M Tris pH 7.0 ved å blande 121.14 g Tris base med 800 mL vann. Legge til konsentrert saltsyre til pH når 7.0. Legge vann til et endelig antall 1 L og går gjennom filtere 0,2 µm.</li>
	<li>Forberede 500 mL 0,5 M ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA) pH 8.0 ved å blande 73.06 g av EDTA med 400 mL vann. Legge til natriumhydroksid pellets til EDTA er oppløst og pH når 8.0. Legge vann til et endelig antall 500 mL og går gjennom filtere 0,2 µm.</li>
	<li>Forberede 100 mL 100 mM phenylmethanesulfonyl fluor (PMSF) ved å blande 1,74 g PMSF med 200 bevis etanol. Butikken på 20 ° C.</li>
	<li>Forberede 225 mL av 2 x perle vaskebuffer består av 50 mM Tris pH 7.0, 1.4 M NaCl, 20% glyserol og 1 mM EDTA pH 8.0.</li>
	<li>Forberede 100 mL størrelse utelukkelse kromatografi bufferen (S200 buffer) består av 20 mM 4-Morpholinoethanesulfonic syre hydrat (MES) pH 6,5, 100 mM NaCl, 2% glyserol og 0,03% n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside (DDM).</li>
	<li>Forberede 100 mL membran rørets buffer består av 50 mM Tris pH 7.0, 500 mM NaCl, og 10% glyserol.</li>
	<li>Forberede 10 mL av en 3 x SDS siden lasting fargestoff ved å blande 3 mL 20% natrium dodecyl sulfate (SDS), 3 mL glyserol, 2,4 mL 1M Tris pH 6.8, 0,03 g bromophenol blå og 1.6 mL 2-mercaptoethanol.</li>
</ol>2. overuttrykte Borate Transporter i S. cerevisiae
<ol><li>Vaksinere tre transformert gjær koloniene i 50 mL av CSM-hans + YNB + 2% glukose media og riste overnatting på 190 rpm på 30 ° C.</li>
	<li>Dagen bruker et spektrofotometer for å bestemme optisk densitet ved en bølgelengde på 600 nm (OD600) og vaksinere et OD600 av 0,01 av fire 2 L flasker som alle inneholder 500 mL CSM-hans + YNB + 2% glukose media.</li>
	<li>Rist på 190 rpm på 30 ° C i 30 timer til at cellene å konsumere alle glukose og vokse til en høy tetthet. Merk: Lengre vekst tid resultater i større celle gir, større høstet membran avkastning, og til slutt større renset protein gir.</li>
	<li>Indusere uttrykk ved å legge til 125 mL av 5 x YP media med 10% galaktose for en siste induksjon konsentrasjon av 2% galaktose. Rist på 190 rpm på 30 ° C i 16 h.</li>
	<li>Høste celler av snurrende 4000 x g i 15 min. Resuspend cellene i 100 mL kaldt vann. Merk: på dette punktet celler kan være frosset om-80 ° C på ubestemt tid, eller prep kan fortsette i cellen lyse og membran høsting. Vi høster vanligvis 40-45 g av celler.</li>
</ol>3. høsting av gjær membraner
<ol><li>Legge til celle rørets: 11.25 mL 1M Tris pH 7.0, 0,45 mL 0,5 M EDTA, og 2,25 mL av 100 mM PMSF, sistnevnte to fungere som proteasehemmere. Tilsett vann til et endelig antall 225 mL, som resulterer i en celle rørets buffer på 50 mM Tris pH 7.0, 1 mM EDTA, og 1 mM PMSF. Merk: Hvis bruk av frosne celler lar celler å tine grundig, ca 1 time i rom temperatur, fordi hvis de forblir delvis frossen, de vil motstå lysis av perle juling.</li>
	<li>Legge til celle rørets i en 450 mL metall beholder for perle slo. Toppen av gjenværende volumet med kaldt 0,5 mm glassperler.</li>
	<li>Sett sammen en perle-juling kammer med rotoren og dyppe i en isbadet. Utføre seks 1 min pulser, atskilt med 2 min hvileperioder å hindre overoppheting av lysate.</li>
	<li>Sett sammen et vakuum filtrering apparatet ved hjelp av en plast disponibel flaske topp filter skrus inn en glassflaske. Fjerne membran filtrering, fordi gjenværende plast enheten kan fange perlene mens lysate skjedde. Skille perler fra den lysate ved å helle innholdet i perle juling kammeret til samlingen mens du bruker vakuum.</li>
	<li>Vask perle juling kammeret med 225 mL en 2 x vaskebuffer som inneholder 50 mM Tris pH 7.0 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 1.4 M NaCl og 20% glyserol. Tømme innholdet i kammeret til perler å vaske dem. Merk: Vask gir et endelig antall ~ 450 mL lysed celler og betydelig øker høstet membran gir. De siste konsentrasjonene er 50 mM Tris pH 7.0 1 mM EDTA, 1 mM PMSF, 10% glyserol og 700 mM NaCl hovedformål å heve saltkonsentrasjon er å distansere ytre membran proteiner.</li>
	<li>Nedspinning cellen lysate i 15 min 15.000 x g. Hell nedbryting i polykarbonat flasker og spinn 1t 135,000 x g i en ultracentrifuge å samle membraner. Merk: Hvis en ultracentrifuge ikke er tilgjengelig, membraner kan samles ved spinning for 3t 53,000 x g, en kraft som er oppnåelig i gulvet modell sentrifuger.</li>
	<li>Forkaste nedbryting og veier med et membran pellets. Resuspend membran pellets i ca 35 mL membran rørets buffer inneholder 50 mM Tris pH 7.0, 500 mM NaCl, og 10% glyserol og legge til et glass douncer. Veie tom sentrifuge rør for å finne masse membraner høstet. Merk: I en effektiv membran harvest, vekten av membraner tilsvare omtrent 20% vekten av celler brukes for at membran innhøsting. Denne protokollen gir typiske celle avkastning på 40-45 g, og dermed forventer vi likeledes en avkastning på 8-9 g membraner.</li>
	<li>Dounce homogenize membraner, og aliquot til 50 mL konisk rør som kan nå lagres på ubestemt tid på-80 ° C. Merk: Dette eksperimentet, vanligvis to dele utføres, slik at to separate protein rene utføres fra en opprinnelige cellen forberedelse.</li>
</ol>4. solubilization og rensing av Protein
<ol><li>Legge til en rør bar og 150 mg av n-Dodecyl-β-D-Maltopyranoside (DDM) per g membranen brukes et beger. Holde protein på isen eller i 4 ° C hele tiden. Merk: DDM er hygroskopisk og skal lagres i en glasskrukke med fuktighet på 20 ° C når den ikke er i bruk. Det er også vanlig å bruke mellom 4-5 g av membraner i en rensing å få en betydelig mengde ren protein.</li>
	<li>Tine membraner og føre til et endelig antall 15 mL per g membran membran rørets buffer med 1 mM PMSF og 20 mM imidazole pH 8.0. Legge til membraner kanne med DDM og røres i 1 h på 4 ° C. Merk: DDM konsentrasjonen være 1% w/v, men for solubilization av membran proteiner er det mer viktig å være klar over masse vaskemiddel lagt til g membran.</li>
	<li>Spinn for 25 min 135,000 x g på 4 ° C pellets ikke-solubilized materiale. Filtrere nedbryting gjennom en 5 µm sprøyten.</li>
	<li>Last prøven ved peristaltiske pumpen satt til en strømningshastighet på 1 mL/min på en 1 mL immobilisert nikkel affinitet kolonne equilibrated i 20 mM Tris pH 7.0, 500 mM NaCl, 10% glyserol, 20 mM imidazole pH 8.0 og 0,05% DDM. Merk: For lavere uttrykke proteiner, forbedret renhet og gir ble observert med en 1 mL i stedet for 5 mL kolonnen og nikkel i stedet for kobolt ioner for affinitet kromatografi.</li>
	<li>Vask kolonnen med 10 kolonnen mengder en vaskebuffer inneholder 20 mM Tris pH 7.0, 500 mM NaCl, 10% glyserol, 80 mM imidazole pH 8.0 og 0,05% DDM. Merk: Imidazole konsentrasjonen som kan brukes under vasker for en 10-hans-merket protein er høyere enn er vanligvis verdsatt og resultater i forbedret renhet.</li>
	<li>Elute proteinet i bufferen som inneholder 20 mM Tris pH 7.0, 200 mM NaCl, 10% glyserol, 300 mM imidazole pH 8.0 og 0,05% DDM. Samle eluate i ti 1 mL fraksjoner og kjøre på en 4-20% Tris-glycine SDS side gel sammen med solubilized lysate og vask fraksjoner.</li>
	<li>Bassenget peak fraksjoner, vanligvis om 5-6 mL og konsentrat til 500 µL eller mindre volum i en 50 kDa cutoff konsentrator i en Borstemmaskin sentrifuge kjøling på 4 ° C. Merk: 500 µL er et typisk maksimum volum injisert i størrelse utelukkelse kromatografi (SEC) kolonner. På dette punktet protein kan lagres på ubestemt tid ved-80 ° C eller fortsette til SEC.</li>
	<li>Filtrere protein gjennom et kolonnefilter 0,2 µm spinn og injisere på en størrelse utelukkelse kolonne (eksempelvis Superdex-200) equilibrated S200 buffer: 20 mM Mes pH 6,5, 100 mM NaCl, 2% glyserol og 0,03% DDM. Merk: For de etterfølgende glutaraldehyde cross-linking analysen, bufring agenten må ikke inneholde en primær Amin. SEC er en mulighet til å utveksle buffere eventuelt som gjort her når bytte Tris for Mes.</li>
	<li>Kjør peak fraksjoner på 4-20% Tris-glycine SDS-siden gel. Stain gel, samle ren peak fraksjoner og konsentrere i en 50 kDa-cutoff konsentrator på 4 ° C.</li>
	<li>Bestemme protein konsentrasjonen av måling absorbans ved en bølgelengde på 280 nm, og butikken på ubestemt tid på-80 ° C.</li>
</ol>5. glutaraldehyde Cross-linking analysen
<ol><li>Forberede en 10 µL reaksjon ved å blande 3 µL 0,5 mg/mL protein i S200 buffer, 5 µL S200 bufferen, 1 µL av vann eller 20% natrium dodecyl sulfate (SDS), etterfulgt av 1 µL av 1,5% glutaraldehyde. Merk: Dette vil gi en 1 x reaksjon på 0,15 mg/mL protein og 0,15% glutaraldehyde. Prøver som inneholder en behandling eksponeringsmåter skal er viktig negative kontroller og blandes og ruges i romtemperatur i 5 minutter før du legger til glutaraldehyde.</li>
	<li>Inkuber reaksjonen i 30 min ved romtemperatur. Avslutte reaksjonen ved å legge 5µL 3 x SDS side gel lasting fargestoff, som inneholder et overskudd av Tris buffer som slukker glutaraldehyde.</li>
	<li>Last alle 15 µL på 4-20% Tris-glycine SDS side gel, som lastes 1,5 µg protein per kjørefelt. Kjør gel på 200 V for 30 min. flekken og fastslå omfanget av dimer cross-linking av et band som kjører på to ganger størrelsen på de denaturert monomer. Merk: En glutaraldehyde titrering og tid selvfølgelig kan utføres først for å finne de beste forutsetninger for en homomeric transporter.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Drew, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=GFP-based+optimization+scheme+for+the+overexpression+and+purification+of+eukaryotic+membrane+proteins+in+Saccharomyces+cerevisiae.">GFP-based optimization scheme for the overexpression and purification of eukaryotic membrane proteins in Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature Protocols. 3 (5), 784-798 (2008).</li><li>Goehring, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Screening+and+large-scale+expression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies.">Screening and large-scale expression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Nature Protocols. 9 (11), 2574-2585 (2014).</li><li>Andr&#233;ll, J., Tate, C. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+of+membrane+proteins+in+mammalian+cells+for+structural+studies.">Overexpression of membrane proteins in mammalian cells for structural studies.</a> Molecular Membrane Biology. 30 (1), 52-63 (2013).</li><li>Lyons, J. A., Shahsavar, A., Paulsen, P. A., Pedersen, B. P., Nissen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+strategies+for+structural+studies+of+eukaryotic+membrane+proteins.">Expression strategies for structural studies of eukaryotic membrane proteins.</a> Current Opinion in Structural Biology. 38, 137-144 (2016).</li><li>Kawate, T., Gouaux, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence-detection+size-exclusion+chromatography+for+precrystallization+screening+of+integral+membrane+proteins.">Fluorescence-detection size-exclusion chromatography for precrystallization screening of integral membrane proteins.</a> Structure. 14 (4), 673-681 (2006).</li><li>Fairbanks, G., Steck, T. L., Wallach, D. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electrophoretic+analysis+of+the+major+polypeptides+of+the+human+erythrocyte+membrane.">Electrophoretic analysis of the major polypeptides of the human erythrocyte membrane.</a> Biochemistry. 10 (13), 2606-2617 (1971).</li><li>Thurtle-Schmidt, B. H., Stroud, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+Bor1+supports+an+elevator+transport+mechanism+for+SLC4+anion+exchangers.">Structure of Bor1 supports an elevator transport mechanism for SLC4 anion exchangers.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 113 (38), 10542-10546 (2016).</li><li>Coudray, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure+of+the+SLC4+transporter+Bor1p+in+an+inward-facing+conformation.">Structure of the SLC4 transporter Bor1p in an inward-facing conformation.</a> Protein Science. 26 (1), 130-145 (2016).</li><li>Arakawa, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Crystal+structure+of+the+anion+exchanger+domain+of+human+erythrocyte+band+3.">Crystal structure of the anion exchanger domain of human erythrocyte band 3.</a> Science. 350 (6261), 680-684 (2015).</li><li>Huynh, K. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CryoEM+structure+of+the+human+SLC4A4+sodium-coupled+acid-base+transporter+NBCe1.">CryoEM structure of the human SLC4A4 sodium-coupled acid-base transporter NBCe1.</a> Nature Communications. 9 (1), (2018).</li><li>Zhao, R., Reithmeier, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+and+characterization+of+the+anion+transporter+homologue+YNL275w+in+Saccharomyces+cerevisiae.">Expression and characterization of the anion transporter homologue YNL275w in Saccharomyces cerevisiae.</a> American Journal of Physiology Cell Physiology. 281 (1), 33-45 (2001).</li><li>Takano, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Arabidopsis+boron+transporter+for+xylem+loading.">Arabidopsis boron transporter for xylem loading.</a> Nature. 420, 337-340 (2002).</li><li>Nakagawa, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cell-type+specificity+of+the+expression+of+Os+BOR1,+a+rice+efflux+boron+transporter+gene,+is+regulated+in+response+to+boron+availability+for+efficient+boron+uptake+and+xylem+loading.">Cell-type specificity of the expression of Os BOR1, a rice efflux boron transporter gene, is regulated in response to boron availability for efficient boron uptake and xylem loading.</a> Plant Cell. 19 (8), 2624-2635 (2007).</li><li>Hays, F. A., Roe-Zurz, Z., Stroud, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Overexpression+and+purification+of+integral+membrane+proteins+in+yeast.">Overexpression and purification of integral membrane proteins in yeast.</a> Methods in Enzymology. 470, (2010).</li><li>Chang, Y. -. N., Geertsma, E. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+novel+class+of+seven+transmembrane+segment+inverted+repeat+carriers.">The novel class of seven transmembrane segment inverted repeat carriers.</a> Biological Chemistry. 398 (2), 165-174 (2017).</li><li>Robertson, J. L., Kolmakova-Partensky, L., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Design,+function+and+structure+of+a+monomeric+ClC+transporter.">Design, function and structure of a monomeric ClC transporter.</a> Nature. 468 (7325), 844-847 (2010).</li><li>Last, N. B., Miller, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+Monomerization+of+a+ClC-Type+Fluoride+Transporter.">Functional Monomerization of a ClC-Type Fluoride Transporter.</a> Journal of Molecular Biology. 427 (22), 3607-3612 (2015).</li><li>Yu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dimeric+structure+of+the+uracil:proton+symporter+UraA+provides+mechanistic+insights+into+the+SLC4/23/26+transporters.">Dimeric structure of the uracil:proton symporter UraA provides mechanistic insights into the SLC4/23/26 transporters.</a> Cell Research. 27 (8), 1020-1033 (2017).</li></ol>

Forfatterne ikke avsløre.

Her har vi delt detaljert protokoller som resulterer i rensing å homogenitet av tre distinkte eukaryote borate transportører. Protokollene som presenteres her er avledet fra andre protokoller for uttrykket av integrert membran proteiner i S. cerevisiae1,14, og vår optimaliseringer resultatet både forbedret renhet og bedre avlinger. Parameterne optimalisert her inkluderer celle kultur vekst volumer og ganger, perle-juling lysis prosedyrer, buffer komposisjon under cellen lyse og protein rensing, mengden av vaskemiddel brukes per gram membran, metall ion identifisere i affinitet rensing, volum affinitet, og gjennomføringen av en cross-linking analysen vurdere homolog og vaskemiddel egnethet ved å vurdere multimeric staten oligomeric transportører. Protokollene er vellykket for flere SLC4 homologs fra anlegget og fungal arter. En begrensning av alle strategier for rensing av integrert membran proteiner er at det finnes ingen universell membran protein rensing metode som er garantert å fungere. Det er mulig at våre protokoller er mer sannsynlig å være vellykket for proteiner nærmere i sekvens identitet og struktur til SLC4 transportører, og dermed medlemmer av SLC4, SLC23 og SLC26 kan være lovende mål15. Likeledes den mer evolusjonært fjernt fra borate transportører en membran transporter kan være, jo mer sannsynlig protokollen må være annerledes, som ved å variere uttrykk systemet, vaskemiddel eller andre nøkkelparametere4.
Protokollen utnytter den vanligste affinity koden i protein rensing, hans-koden. Til tross for tilstedeværelsen av urenheter i første eluted fraksjoner, kombinasjoner av nikkel affinitet, omfattende vask og påfølgende SEC rensing resulterer i høyrenset protein. En 10-hans-koden gir den strengere imidazole vasker og dermed kan fjerne mer bakgrunn bindende proteiner enn kan fjernes i vask tillatt av 8-hans - eller 6-hans-tags. Våre valg for ren fraksjoner feile på høyre side av de fleste svært ren gel fraksjoner, som tilsvarer peak SEC fraksjoner. Siste protein gir kan økes ved pooling og konsentrere seg mer fraksjoner, men med bytteforholdet litt mindre ren protein. Metodene presenteres her aktivert rensing av AtBor1 som førte til fastsettelse av sitt krystall struktur7, rensing forskjeller kutte av hans-koden og utveksle transporter til en annen vaskemiddel å forbedre krystall Diffraksjon7.
Våre protokollen reiser viktige hensyn for valg av homologs og vaskemiddel til solubilize og renser dem. DDM er et vanlig førstevalg for vaskemiddel fordi det er relativt milde, ofte vellykket på solubilizing, og har vært brukt i strukturelle og funksjonelle studier av en rekke membran proteiner. Bestemme om et vaskemiddel er et dårlig valg for en membran, er en felles metode for evaluering om protein gir en enkelt monodisperse peak på et sekund chromatogram, ikke en stor topp i ugyldig volumet eller et polydisperse topper, som Angi misfolded eller ufrankert protein. En mer subtil vurdering er oppdratt av våre rensing av ScBor1. Det renser i store mengder og ser gunstig og monodisperse på et sekund chromatogram, noe som tyder på det kan være et attraktivt mål for strukturelle studier. Våre cross-linking analysen viser imidlertid at det er en monomer når renset. Det er mulig at ScBor1 kunne innfødt eksisterer som en monomer i cellen, indikerer studier at SLC4 transportører og deres homologs er sannsynlig å være dimers7,8,9,10. Vår utvikling til cross-linking analysen skjedde etter bandets og løse strukturen i AtBor1. Imidlertid hadde vi vært i stand til å vurdere ScBor1 med AtBor1 med cross-linking analysen, verdifull tid og forskning innsats kan ha blitt omadressert å jakten på AtBor1 i stedet for ScBor1, som til slutt ikke lyktes i krystallisering og Diffraksjon eksperimenter. Denne analysen kan dermed hjelpe forskerne å skille mellom homologs eller vaskemidler bruke når forfølge strukturelle studier for å prioritere forhold som protein opprettholder sin mistenkt innfødt konformasjon. Analysen kan i tillegg brukes til å undersøke hvilke aminosyrer er avgjørende for multimerization, for å finne aminosyre erstatninger som destabilisere multimerization grensesnittet og føre til forplikte monomerer. En slik tilnærming er brukt til å undersøke funksjonelle betydningen av homomeric montering membran transportører16,17,18.
En generell nytte av vår metode er at gjær har vist å aktivere uttrykk for mange utfordrende membran proteiner av forskjellige funksjon1. I tillegg fremme sin lave kostnader og vekst ganger sin tilgjengelighet for mange forskningsinnsats som kan være mindre i stand å bruke uttrykket strategier som krever vev kultur eller dyre vekst medier. Prosedyrene presenteres her er relativt billig og kan utføres i én uke som understreker muligheten for tilnærming. Implementering av disse protokollene kan hjelpe aktiverer strukturelle og funksjonelle studier av andre utfordrende membran proteiner.

Problemer å skaffe tilstrekkelige mengder renset membran proteiner er en kritisk flaskehals i jakten på strukturelle og funksjonelle studier av reseptorer, ionekanaler og transportører. Mange protokoller finnes for middels høy gjennomstrømming rørledninger skjermen og finne kandidat membran proteiner som uttrykker godt nok for å aktivere påfølgende i vitro studier1,2,3,4 . Vanligvis proteiner er merket med en N - eller C-terminalen grønne fluorescerende protein (GFP), og uttrykket nivåer overvåkes ved-gel fluorescens eller fluorescens-gjenkjenning størrelse utelukkelse kromatografi (FSEC)5. Disse aktiverer triaging membran protein kandidater til høy uttrykke proteiner, moderat eller lav uttrykke proteiner, eller proteiner som uttrykker dårlig eller ikke i det hele tatt. Denne tilnærmingen fungerer bra når eksperimentell design er å undersøke stort antall kandidat gener å velge hvilken protein uttrykker best. Men i noen tilfeller forutsetter en eksperimentell tilnærming på å studere en bestemt membran protein, som kan være utfordrende når den protein uttrykk nivåer er i området moderat eller lav. I tillegg, kan noen ganger i disse tilfellene uttrykk nivåer bare minimal økes ved å endre Konstruer via truncations, thermostabilizing mutasjoner eller codon optimalisering. Det er derfor noen ganger nødvendig å optimalisere membran protein uttrykk og rensing protokoller for membran proteiner som uttrykker bare moderat godt.
SLC4 familien av transportører inkluderer den bikarbonat transporter Anion Exchanger 1 (også kjent som Band 3), mest tallrike membran proteinet i røde blodceller6og en sentral pådriver for cellular respirasjon. SLC4 familien er homologe med borate transportører, som er avgjørende for planter og har vist seg å en lignende struktur til Anion Exchanger 1 og natrium-kombinert SLC4 transportører7,8,9 ,10. Her rapporterer vi optimalisert protein uttrykk og rensing protokoller bruker S. cerevisiae å rense tre forskjellige borate transportører i gjær og planter. Vi markere i detalj hovedtrinnene vi tok for å optimalisere avkastningen og effektiviteten av renselser å homogenitet. I tillegg rapportere vi en kjemisk cross-linking analysen bruker glutaraldehyde for å overvåke multimeric montering av disse transportører i sammenheng med en renset protein-vaskemiddel-lipid kompleks. Cross-linking eksperimentet kan hjelpe vurdere homolog og vaskemiddel egnethet ved å vurdere multimeric staten oligomeric transportører etter rensing.
Denne protokollen forutsetter at den ønskede transporter er blitt klonet i en 2 µ avledet plasmider under induserbart kontroll GAL1 uttrykk i S. cerevisiae. For disse prosedyrene, DNA ble brukt koding full lengde vill-type borate transportører Saccharomyces cerevisiae Bor1 (ScBor1)11, Arabidopsis thaliana Bor1 (AtBor1)12og Oryza sativa Bor3 (OsBor3)13 . C-terminalen i hver konstruksjon er lagt med en 10-hans-tag og en trombin cleavage området settes inn mellom transporter og 10-hans-koden å aktivere fjerning hvis ønsket. Protokollen vil også anta at plasmider allerede blitt forvandlet til DSY-5 uttrykk belastningen av S. cerevisiae på komplett supplerende selektiv medier (CSM) mangler histidin.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:823px;" width="822">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">2-mercaptoethanol</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">M3148</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">4-Morpholinoethanesulfonic acid hydrate (MES)</td>
			<td style="width:199px;">Acros</td>
			<td>172591000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">&#196;kta Pure 25 L FPLC</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>29018224</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Amicon Ultra 15 mL, 50 kDa MWCO concentrator</td>
			<td style="width:199px;">Millipore</td>
			<td>UFC905024</td>
			<td>for concentrating nickel column fractions</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Amicon Ultra 4 mL, 50 kDa MWCO concentrator</td>
			<td style="width:199px;">Millipore</td>
			<td>UFC805024</td>
			<td>for concentrating S200 fractions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Bacto Peptone</td>
			<td style="width:199px;">BD Diagnostics</td>
			<td>211677</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Bacto Yeast Extract</td>
			<td style="width:199px;">BD Diagnostics</td>
			<td>288620</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:343px;">Glass Erlenmeyer flask, 2L</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>CLS44442L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Benchtop centrifuge</td>
			<td style="width:199px;">Sorvall</td>
			<td style="width:115px;">Legend RT</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bottle top filter</td>
			<td style="width:199px;">Nalgene</td>
			<td>595-4520</td>
			<td>the membrane is removed and used to filter glass beads</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Bromophenol blue</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>114391</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Complete supplement mixture without histidine</td>
			<td>Sunrise Science</td>
			<td>1006-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">D-Galactose</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G0750</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D-Glucose</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>RDD016</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethanol, 200 proof</td>
			<td style="width:199px;">Pharmco-Aaper</td>
			<td>111000200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ethylenediaminetetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>EDS-500G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Gel tank SDS-PAGE system</td>
			<td style="width:199px;">Bio-Rad</td>
			<td>1658004</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass bead-beating cell disruptor</td>
			<td style="width:199px;">BioSpec</td>
			<td>1107900</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass beads, 0.5mm</td>
			<td style="width:199px;">BioSpec</td>
			<td colspan="2">11079105&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:343px;">Glutaraldehyde</td>
			<td style="width:199px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td style="width:115px;">16019</td>
			<td>sent as an 8% solution under nitrogen</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Glycerol</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>G7893</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">HiTrap IMAC FF column, 1 mL</td>
			<td style="width:199px;">GE Healthcare</td>
			<td style="width:115px;">17-0921-02</td>
			<td>charged with nickel</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Hydrochloric acid</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>258148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Imidazole</td>
			<td style="width:199px;">Acros</td>
			<td>12202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Instant Blue gel stain</td>
			<td style="width:199px;">Expedeon</td>
			<td style="width:115px;">ISB1L</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">JA-10 rotor</td>
			<td style="width:199px;">Beckman</td>
			<td>369687</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:343px;">JA-14 rotor</td>
			<td style="width:199px;">Beckman</td>
			<td>339247</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Microcentrifuge tubes, 1.5mL</td>
			<td style="width:199px;">Thermo Scientific</td>
			<td>3451</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Microcentrifuge, refrigerated</td>
			<td style="width:199px;">Fisher</td>
			<td>13-100-676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini-Protean Tris-glycine gels, 4-20%</td>
			<td style="width:199px;">Bio-Rad</td>
			<td>456-1096</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Minipuls 3 peristaltic pump</td>
			<td>Gilson</td>
			<td>F155005</td>
			<td>used for loading lysate onto affinity column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">n-Dodecyl-beta-D-Maltopyranoside (DDM)</td>
			<td style="width:199px;">Inalco</td>
			<td>1758-1350</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Nickel(II) Sulfate Hexahydrate</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>227676</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:343px;">Orbital shaking incubator with temperature control</td>
			<td style="width:199px;">New Brunswick</td>
			<td style="width:115px;">C24</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">p423 GAL1 plasmid with borate transporter insert</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td>available from authors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Phenylmethanesulfonyl fluoride (PMSF)</td>
			<td style="width:199px;">Acros</td>
			<td>215740050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Polycarbonate ultracentrifuge tubes</td>
			<td style="width:199px;">Beckman</td>
			<td>355618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Polypropylene bottles, 250mL</td>
			<td style="width:199px;">Beckman</td>
			<td style="width:115px;">356011</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Polypropylene bottles, 500mL</td>
			<td style="width:199px;">Beckman</td>
			<td>355607</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:343px;">Precision Plus Protein Kaleidoscope Standards</td>
			<td style="width:199px;">Bio-Rad</td>
			<td>1610375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">S. cerevisiae expression strain DSY-5</td>
			<td style="width:199px;"></td>
			<td style="width:115px;"></td>
			<td>available from authors</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium chloride</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>S7653</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium dodecyl sulfate</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">L3771</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sodium hydroxide</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:115px;">S8045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Spin column with 0.2 &#181;m filter, 0.5mL</td>
			<td style="width:199px;">Millipore</td>
			<td>UFC30GV0S</td>
			<td>for filtering protein before injecting onto S200 column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sterile Falcon tubes, 15mL</td>
			<td style="width:199px;">Lab Depot</td>
			<td style="width:115px;">TLD431696</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Sterile Falcon tubes, 50mL</td>
			<td style="width:199px;">Lab Depot</td>
			<td style="width:115px;">TLD431698</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Superdex 200 10/300 GL column</td>
			<td>GE Healthcare</td>
			<td>17-5175-01</td>
			<td>used for SEC purification</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Syringe filter, 5&#181;m</td>
			<td style="width:199px;">Pall</td>
			<td>4650</td>
			<td>for filtering lysate before loading affinity column</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:343px;">Tris-base</td>
			<td style="width:199px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td>T1503</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:343px;">Type 70 Ti rotor</td>
			<td style="width:199px;">Beckman</td>
			<td>337922</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:343px;">Ultracentrifuge</td>
			<td style="width:199px;">Beckman</td>
			<td style="width:115px;">L8-70M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">YNB+Nitrogen without amino acids</td>
			<td>Sunrise Science</td>
			<td>1501-500</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

expression, solubilization, and purification of eukaryotic borate transporters

Stoff transportør 4 (SLC4)-familie av proteiner kalles bikarbonat transportører og inkluderer arketypiske protein Anion Exchanger 1 (AE1, også kjent som Band 3), mest tallrike membran proteinet i røde blodceller. SLC4 familien er homologe med borate transportører, som har vært preget i planter og sopp. Det er fortsatt en stor teknisk utfordring å uttrykke og rense membran transport proteiner til homogenitet i mengder egnet for strukturelle eller funksjonelle studier. Her beskriver vi detaljerte prosedyrer for overuttrykte borate transportører Saccharomyces cerevisiae, isolering av gjær membraner, solubilization protein av vaskemiddel og rensing av borate transporter homologs fra S. cerevisiae, Arabidopsis thalianaog Oryza sativa. Vi også gi deg en glutaraldehyde cross-linking eksperiment for å analysen multimerization av homomeric transportører. Våre generalisert prosedyrer kan brukes på alle tre proteiner og er optimalisert for effekt. Mange av strategiene utviklet her kan benyttes for å studere andre utfordrende membran proteiner.

Typisk gelé eluted fraksjoner utføre nikkel affinitet kromatografi viser alle tre proteiner delvis renset (figur 1A). Til høyre for stigen er den lysate, som i hvert fall ikke viser en betydelig band tilsvarer den borate transporter som er typisk for proteiner som ikke overexpress godt. 80 mM vask kjørefelt viser minimale tap av 10-hans-merket protein tross den relativt høye imidazole konsentrasjonen. Band tilsvarer borate transportører er åpenbart i elut fraksjoner, og anses for å inneholder hoveddelen av eluted protein fraksjoner er konsentrert før injisere på kolonnen S200 gel filtrering. På dette stadiet, er proteiner utilstrekkelig renset for mange nedstrøms programmer, som indikert av ekstra band i konsentrert prøven før injisere på kolonnen S200 (figur 1B). Sprøytebruk prøven på størrelse utelukkelse kolonnen viser imidlertid elut fraksjoner av høy renhetsgrad (figur 1ABC). Chromatograms og deres tilsvarende gels for hver av borate transportører presenteres. Tross moderat renheten av prøvene på elueringsrør fra affinitet Ture er protein svært ren på eluting fra kolonnen gel filtrering. Kritisk, avsløre chromatograms hver protein overføre hovedsakelig som en enkelt monodisperse topp med lite protein beholdt i ugyldig volumet. Et stabilt og foldet protein generelt gir en monodisperse og symmetrisk topp, mens ustabil, misfolded eller aggregert protein vil vanligvis gi flere asymmetrisk topper eller en stor topp i ugyldig volumet. Det er vanlig å få en endelig avkastning ca 2 mg renset protein per L gjær kultur for ScBor1, og ca 1 mg hver renset AtBor1 og OsBor3 per L kultur. Disse tallene er mengden av protein renset fra en aliquot av 4-5 g av membraner, som stammer fra en halvdel av vår opprinnelige cellen forberedelse.
Cross-linking eksperimentet viser at renset homomeric transportører kan ha sine montering i løsning lett vurdert (figur 2). Formålet med eksemplene som inneholder en behandling eksponeringsmåter er å vise at cross-linking er avhengig av en foldet tilstand i løsningen og at cross-linking derfor ikke oppstår når multimerization blir forstyrret av en korroderende. Resultatene vises skille at en av tre borate transportører, ScBor1, ikke er dimerized når renset ved DDM i disse forholdene, mens de andre to, AtBor1 og OsBor3, link og Vis dimerization. Det er mulig å se at ikke alle protein kan link. I dette eksemplet er sporstoffer mengder OsBor3 monomer synlig, mens AtBor1 cross-links til ferdigstillelse. Omfanget av cross-linking avhenger av antall lysin rester i nærhet til hverandre, og det er mulig at andre cross-linking reagenser kan effektivt link forskjellige membran proteiner.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59166/59166fig1.jpg"> Figur 1 . Nikkel tilhørighet og størrelse utelukkelse kromatografi rensing for tre borate transportører. Hver loddrett panel (A), (B) og (C) inneholder data for ScBor1, AtBor1 og OsBor3. (A) nikkel affinitet kolonnen. M er en stige av molekylvekt merkene med vekter i kDa angitt til venstre. L er råoljen lysate W er 80 mM imidazole vask. Alle andre nummererte baner tilsvarer 1 mL brøker elut med 300 mM imidazole. Stolper over fraksjoner angir som ble valgt til kombineres og konsentrert for injeksjoner til kolonnen. (B) P angir konsentrert protein før injisere på kolonnen S200. Elut SEC fraksjoner er til høyre, med parentes å knytte gel baner med chromatogram fraksjoner i (C). Ugyldig volumet er like etter 8 mL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59166/59166fig1large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59166/59166fig2.jpg"> Figur 2 . Cross-Linking analysen vurderer renset transportører for multimeric montering. En stige med molekylvekt angis til venstre. Over alle andre baner vises som protein er tilstede og om utvalget har glutaraldehyde lagt eller en behandling eksponeringsmåter før glutaraldehyde tillegg. Pilene angir plasseringen av monomer og dimer for AtBor1 og OsBor3. ScBor1 er et mindre protein enn AtBor1 og OsBor3 og kjører som forventet. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59166/59166fig2large.jpg" target="_blank">Klikk her for å se en større versjon av dette tallet.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters at JoVE.com

Expression, Solubilization, and Purification of Eukaryotic Borate Transporters

Uttrykk, Solubilization og rensing av eukaryote Borate transportører

Her presenterer vi en protokoll for å uttrykke solubilize og rense flere eukaryote borate transportører med homologi til SLC4 transporter familien bruke gjær. Vi beskriver også en kjemisk cross-linking analysen for å vurdere renset homomeric proteiner for multimeric montering. Disse protokollene kan tilpasses for andre utfordrende membran proteiner.

The Solute Carrier 4 (SLC4) family of proteins is called the bicarbonate transporters and includes the archetypal protein Anion Exchanger 1 (AE1, also ...

Å skaffe tilstrekkelige mengder membranproteiner for nedstrøms applikasjoner er fortsatt en betydelig teknisk utfordring. Denne protokollen gjør det mulig å rense flere membrantransportproteiner til homogenitet. En viktig fordel med denne teknikken er at Saccharomyces cerevisiae er en tid og kostnadseffektivt eukaryotisk uttrykkssystem for membranproteiner som tillater optimalisering av mange viktige eksperimentelle variabler.Begynn med å inokulere tre forvandlede gjærkolonier, i 50 milliliter komplett supplerende selektivt medium uten histidin. Supplert med gjær nitrogen base og 2% glukose for en overnatting inkubasjon ved 190 rotasjoner per minutt og 30 grader Celsius. Fjern kulturen dagen etter.Bruk et spektrofotometer for å bestemme den optiske tettheten ved 600 nanometer eller OD 600. Og inokuler hver av fire to-liters kolbe som inneholder 500 milliliter kulturmedium til en OD 600 av 0,01. Deretter rister kulturene ved 190 rotasjoner per minutt ved 30 grader Celsius i 30 timer for å tillate cellene å konsumere all glukose og å vokse til høy tetthet.For å indusere borate transportør uttrykk, tilsett 125 milliliter av fem x gjær pepton medium, supplert med 10% galaktose ved 190 rotasjoner per minutt ved 30 grader Celsius i 16 timer. Høst deretter gjærcellene ved sentrifugering og gjenoppusser pelleten i 100 milliliter kaldt vann. Virvle i virvel for å gjenbruke gjærpelleten og overfør løsningen for å gjøre dette med alle flasker som inneholder pellets.For å høste gjærmembranene, legger du først til 11,25 milliliter av en molar Tris, 0,45 milliliter på 0,5 molar EDTA og 2,25 milliliter på 100 millimolar PMSF til de resuspenderte cellene. Tilsett vann til et endelig volum på 225 milliliter og overfør cellene til en 450 milliliter metallperle som slår beholderen. Topp av det gjenværende volumet med kalde 0,5 millimeter glassperler og monter perleperlekammeret med en rotor.Dypp kammeret i et isbad og utfør seks ett minutts pulser, atskilt med to minutters hvileperioder for å forhindre overoppheting av lysatet. Etter den siste pulsen, fjern filtreringsmembranen fra et plast engangsflasketoppfilter skrudd inn i en glassflaske og hell innholdet i perleperlekammeret på enheten mens du påfører vakuum. Skyll deretter med de to x perle vaskebufferen ved å legge til kammeret virvlende og deretter legge til perlene.Skyll perleperlekammeret med 225 milliliter vaskebuffer og vask perlene med innholdet i kammeret. Samle lysate ved sentrifugering og dekantere supernatant i polykarbonatflasker for ultracentrifugation for innsamling av membranene. På slutten av ultracentrifugation kaste supernatant og veie flaskene med membranen pellets før resuspending membranene i ca 35 milliliter membran gjenoppliving buffer.Tilsett suspensjonene til et glass Douncer, deretter Dounce homogenisere membranene en aliquot homogenatet i en 50 milliliter konisk rør for negativ 80 grader Celsius lagring. Vei de tomme sentrifugeflaskene for å bestemme massen av de høstede membranene. For proteinsluktisering og rensing, tilsett en rørestang og 150 milligram DDM per gram membran til et beger på is og gjenoppliving av de tinte membranene til et endelig volum på 15 milliliter membranrefusjonsbuffer, supplert med en millimolar PMSF og 20 millimolar imidazoler per gram membran.Tilsett membranløsningen til begeret i en time med omrøring i et isbad. Etterfulgt av sentrifugering for pellet det ikke-solubiliserte materialet. I et 4 grader celsius kaldt rom, filtrere supernatant gjennom en fem mikrometer sprøyte filter og bruke en peristaltisk pumpe satt til en strømningshastighet på en milliliter per minutt for å laste prøven på en en milliliter immobilisert nikkel affinitet kolonne Deretter vaske kolonnen med 10 kolonne volumer av vaskebuffer og fortynne proteinet i elution buffer.Samle eluatet i ti en milliliter fraksjoner. Kjør de oppsamlede tilberedte gelfraksjonene på en fire til 20% Tris-Glycine SDS-sidegel sammen med solubilisert lysate og vaskfraksjoner ved romtemperatur, og trekk toppen samlet utstrålende fraksjoner for konsentrasjon til en 500 mikro liter eller mindre volum i en 50 kilo dalton cutoff konsentrator i en benkeplate sentrifuge på fire grader Celsius. Filtrer det konsentrerte proteinet gjennom et 0,2 mikrometerspinnkolonnefilter og injiser filtratet på en størrelsesekskluderingskolonne som er likevektet i en S-200-buffer.Etter å ha kjørt toppfraksjonene på en annen fire til 20% Tris-Glycine SDS sidegel, flekk gelen og samle de rene toppfraksjonene for konsentrasjon i en 50 kilo Dalton cutoff konsentrator ved fire grader Celsius som nettopp demonstrert. Mål deretter absorpsjonen av proteinprøven ved en 280 nanometer bølgelengde for å bestemme konsentrasjonen før du lagrer prøven på ubestemt tid ved negative 80 grader Celsius. For å utføre en glutaraldehyd kryss-linking analyse, først, legge til 0,5 milligram per milliliter tint protein i tre mikroliter s-200 buffer til fem mikroliter S200 buffer.Fullfør den negative kontrollreaksjonen med tilsetning av en mikroliter på 20% natrium dodecylsulfat og en mikroliter på 1,5% glutaraldehyd. Fullfør eksperimentelle prøver med tilsetning av en mikro liter vann og en mikro liter 1,5% glutaraldehyd. Etter 30 minutter ved romtemperatur avslutte reaksjonen med fem mikroliter av 3x SDS side gel lasting dø som inneholder et overskudd av Tris buffer å slukke glutaraldehyd og laste alle 15 mikro liter av løsningen på en fire til 20% Tris-Glycine SDS side gel.Deretter kjører gelen på 200 volt i 30 minutter før farging for å bestemme omfanget av dimer krysskobling som det fremgår av et bånd som går på dobbelt så stor som denaturert monomer. Flekk gelen ved å riste på en langsom orbital shaker med gelflekk lagt til gelen. Her viser typiske geler for de unnslappe fraksjonene fra nikkelaffinitetskromatografi tre delvis rensede proteiner med lysatefraksjonene som ikke viser et betydelig bånd som tilsvarer borattransportøren som forventet for proteiner som ikke over uttrykker godt.Annonsen millimolar vaske kjørefelt i hver gel viser minimalt tap av ti histidin merket protein til tross for deres relativt høye emittere gamle konsentrasjon. Mens båndene som tilsvarer boratetransportørene er lett synlige i de unnslappe brøkene. Før S200 kolonne injeksjon, proteinene er utilstrekkelig renset for mange nedstrøms applikasjoner som angitt av ekstra bånd i hver prøve.Etter injeksjonen i størrelsesekskludering kolonner imidlertid, unngikk fraksjoner av høy renhet kan observeres. Kryssbinding viser at de rensede homomeriske transportørene kan få sin montering i løsning lett vurdert med omfanget av krysskobling er avhengig av antall lysinrester i nærheten av hverandre Det er viktig å huske at når cellehøstingen begynner, må proteinet holdes kaldt til enhver tid. Enten på is i et fire grader Celsius rom eller i en deli tilfelle.Etter denne prosedyren kan membranproteinene ytterligere karakteriseres av biofysiske, biokjemiske eller strukturelle metoder, inkludert røntgenkrystallografi eller kryoelektronmikroskopi. Ved å muliggjøre rensing av mg mengder homogent protein, ble disse teknikkene brukt til å bestemme krystallstrukturen til Arabidopsis thaliana en transportør.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Purification, and Crystallization of the Human Serotonin Transporter Bound to S-citalopram

Thermostabilization, Expression, Rensing, og Krystallisering av Human Serotonin Transporter Bound til<em&gt; S</em&gt; -citalopram

The serotonin transporter is a sodium and chloride-coupled transporter that &#34;pumps&#34; extracellular serotonin into cells. S-citalopram is a drug ...

Tandem Affinity Purification of Protein Complexes from Eukaryotic Cells

Tandem Affinity Rensing av protein komplekser fra eukaryote celler

The purification of active protein-protein and protein-nucleic acid complexes is crucial for the characterization of enzymatic activities and de novo ...

Expression, Purification, and Antimicrobial Activity of S100A12

Ekspresjon, rensing og antimikrobiell aktivitet av S100A12

Calgranulin proteins are important mediators of innate immunity and are members of the S100 class of the EF-hand family of calcium binding proteins. Some ...

Expression and Purification of Mammalian Bestrophin Ion Channels

Uttrykk og rensing av pattedyr Bestrophin Ion kanaler

The human genome encodes four bestrophin paralogs, namely BEST1, BEST2, BEST3, and BEST4. BEST1, encoded by the BEST1 gene, is a Ca2+-activated Cl- ...

An Oligonucleotide-based Tandem RNA Isolation Procedure to Recover Eukaryotic mRNA-Protein Complexes

En Oligonucleotide-baserte Tandem RNA isolasjon prosedyre å gjenopprette eukaryote mRNA Protein komplekser

RNA-binding proteins (RBPs) play key roles in the post-transcriptional control of gene expression. Therefore, biochemical characterization of mRNA-protein ...

Expression and Purification of the Human Lipid-sensitive Cation Channel TRPC3 for Structural Determination by Single-particle Cryo-electron Microscopy

Uttrykk og rensing av menneskelige Lipid-sensitive kasjon kanal-TRPC3 for strukturelle vilje av Single-partikkel Cryo-elektronmikroskop

Transient receptor potential channels (TRPCs) of the canonical TRP subfamily are nonselective cation channels that play an essential role in calcium ...

Expression and Purification of Nuclease-Free Oxygen Scavenger Protocatechuate 3,4-Dioxygenase

Uttrykk og rensing av Nuklease-gratis Oxygen renovasjons Protocatechuate 3, 4-Dioxygenase

Single molecule (SM) microscopy is used in the study of dynamic molecular interactions of fluorophore labeled biomolecules in real time. However, ...

Expression, Purification, Crystallization, and Enzyme Assays of Fumarylacetoacetate Hydrolase Domain-Containing Proteins

Uttrykk, rensing, krystallisering, og enzym analyser av Fumarylacetoacetate Hydrolase domene-inneholdende proteiner

Fumarylacetoacetate hydrolase (FAH) domain-containing proteins (FAHD) are identified members of the FAH superfamily in eukaryotes. Enzymes of this ...

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Characterization of Membrane Transporters by Heterologous Expression in E. coli and Production of Membrane Vesicles

Karakterisering av membran transportører av Heterologous uttrykk i E. coli og produksjon av membran blemmer

Several methods have been developed to functionally characterize novel membrane transporters. Polyamines are ubiquitous in all organisms, but polyamine ...

Mechanical Separation and Protein Solubilization of the Outer and Inner Perivitelline Sublayers from Hen's Eggs

Mekanisk separasjon og proteinslukbilisering av de ytre og indre perivitelline underlag fra hønseegg

The perivitelline layer that surrounds the egg yolk plays a fundamental role in fertilization, in egg defense, and in the development of the avian embryo. ...