Name: flow cytometric measurement of ros production in macrophages in response to fc&#947;r cross-linking
Uploaded: 2019-03-07T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃŽÂ³R Cross-linking at JoVE.com

الكتاب يود أن يشكر الأعضاء الآخرين في "المختبر" تينو ارانخويث بمن فيهم مادلين H. ميلر وعمر كاردونا، جودي أنجي وروبين سينغ لمساعدتهم في مختبر الماوس وصيانتها صيانة مستعمرة. وقدم الدعم لهذا البحث بمنحه R00 HL122365 وأموال بدء التشغيل إلى J.T.T-أ.

وأقر البروتوكول للتعامل مع الحيوانات رعاية الحيوان المؤسسية واستخدام اللجنة (إياكوك) من جامعة وسط فلوريدا.
1-جيل نخاع العظام المستمدة الضامة (بمدمس)
<ol><li>
إعداد وسائط الثقافة
	<ol>
<li>تحضير الوسائط الأساسية D10F: إضافة إلى تعديل النسر المتوسطة (دميم دولبيكو)، إبطال الحر...

<ol>
	<li>Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+Oxygen+Species+and+Neutrophil+Function.">Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).</li><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress.">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).</li><li>Robinson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+in+phagocytic+leukocytes.">Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).</li><li>Thomas, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phagocyte+respiratory+burst:+Historical+perspectives+and+recent+advances.">The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances.</a> Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).</li><li>Fang, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+actions+of+reactive+oxygen+species.">Antimicrobial actions of reactive oxygen species.</a> MBio. 2 (5), (2011).</li><li>Iles, K. E., Forman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+signaling+and+respiratory+burst.">Macrophage signaling and respiratory burst.</a> Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).</li><li>Curnutte, J. T., Whitten, D. M., Babior, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+superoxide+production+by+granulocytes+from+patients+with+chronic+granulomatous+disease.">Defective superoxide production by granulocytes from patients with chronic granulomatous disease.</a> New England Journal of Medicine. 290 (11), 593-597 (1974).</li><li>Good, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatal+(chronic)+granulomatous+disease+of+childhood:+a+hereditary+defect+of+leukocyte+function.">Fatal (chronic) granulomatous disease of childhood: a hereditary defect of leukocyte function.</a> Seminars in Hematology. 5 (3), 215-254 (1968).</li><li>Holmes, B., Page, A. R., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+the+metabolic+activity+of+leukocytes+from+patients+with+a+genetic+abnormality+of+phagocytic+function.">Studies of the metabolic activity of leukocytes from patients with a genetic abnormality of phagocytic function.</a> Journal of Clinical Investigation. 46 (9), 1422-1432 (1967).</li><li>Windhorst, D. B., Page, A. R., Holmes, B., Quie, P. G., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pattern+of+genetic+transmission+of+the+leukocyte+defect+in+fatal+granulomatous+disease+of+childhood.">The pattern of genetic transmission of the leukocyte defect in fatal granulomatous disease of childhood.</a> Journal of Clinical Investigation. 47 (5), 1026-1034 (1968).</li><li>Dikalov, S. I., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species.">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).</li><li>Held, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Reactive+Oxygen+Species:+Measurement+of+ROS+in+cells.">An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in cells.</a> White Paper. , (2015).</li><li>Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+reactive+oxygen+species+measurement+in+biological+systems.">Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).</li><li>Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2',7'-Dichlorodihydrofluorescein+as+a+fluorescent+probe+for+reactive+oxygen+species+measurement:+Forty+years+of+application+and+controversy.">2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy.</a> Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).</li><li>Zielonka, J., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroethidine-+and+MitoSOX-derived+red+fluorescence+is+not+a+reliable+indicator+of+intracellular+superoxide+formation:+another+inconvenient+truth.">Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).</li><li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification+and+labeling+of+mouse+bone+marrow+neutrophils+for+functional+studies+and+adoptive+transfer+experiments.">Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).</li></ol>

دكفه2-دا والكشف على أساس DHE من روس هو14،تقنية المستخدمة على نطاق واسع15. سهولة الاستخدام وتكيف هذه المسابر روس للأشكال الميكروسكوبية الحركية، ساهم التحليل سيتوميتريك المجهري أو تدفق الأسفار شعبيتها. ومع ذلك، في دراساتنا لوظائف FcγR بوساطة بلعم، هناك لا ?...

الأنواع الأكسجين التفاعلية (روس) هي جزيئات التفاعل أو الجذور الحرة التي هي الآثار الجانبية للتنفس الهوائي (استعرض في 1). وتشمل هذه انيون دسموتاز، بيروكسيد، بيروكسيد الهيدروجين، هيدروكسيل متطرفة، وأيونات الهيدروكسيل، بين أمور أخرى. الظروف الفسيولوجية العادية، تنتج أساسا من الميتوكوندريا ونيكوتيناميد الأدنين dinucleotide الفوسفات (NADPH) أوكسيداسيس روس وهي سرعة سميته بمختلف الإنزيمات والبروتينات مثل الفاءق دسموتاز والجلوتاثيون. يمكن أن يؤدي إنتاج مبالغ فيها من روس أو خلل في القدرة على إزالة روس الأكسدة، حيث تشجع الأنواع الأكسجين التفاعلية الضرر من البروتينات والدهون والحمض النووي مما يؤدي إلى إجهاد الخلوية أو الموت والمرض المرضية الدول. ومع ذلك، فإنه حاليا يقدر أن روس ويمكن أيضا بمثابة إشارات الجزيئات (إشارة الأكسدة والاختزال)، ويمكن أن تؤثر بوساطة روس تعديل مختلف الجزيئات والمواد الوسيطة المسار الأيض الخلوي، والانتشار، البقاء على قيد الحياة، التهاب إشارات، والشيخوخة2. روس في خلايا متجولة، دوراً أساسيا في توفير نشاط مضادات الميكروبات أثناء ما يسمى "انفجر الجهاز التنفسي"1،3،4،،من56. خلال استجابة البالعات للمنبهات الخارجية، ترانسلوكاتي مكونات أوكسيديز نادف المعقدة (p40phox, p47 بطاقات مجانيةphox، p67phox) من سيتوسول للغشاء فاجوسومال الذي يحتوي على gp91phox و p22phox الوحدات الفرعية، وجنبا إلى جنب مع إجراءات Rac1/2، تشكل إنزيم أوكسيديز نادف تعمل بكامل طاقتها معقدة. ثم يستخدم أوكسيديز نادف المجمعة نادف لتقليل الأكسجين إلى فائق أكسيد داخل المنقبضة فاجوسومال. فائق أكسيد الأنيونات مباشرة يمكن أن يسبب ضررا أو أن ديسموتاتيد إلى فوق أكسيد الهيدروجين. فائق أكسيد وفوق أكسيد الهيدروجين يمكن أن تتفاعل مع الجزيئات الأخرى لتوليد جذور الهيدروكسيل عالي التفاعل. هو وساطة الأضرار برد فعل هذه روس مع كتل الحديد-الكبريت في البروتينات أو بالتسبب في قاعدة أكسدة الحمض النووي، ويؤدي في النهاية إلى الأيض الميكروبي مقيد أو الموت ل ميكروب5. وتتجلى أهمية إنزيم أوكسيديز نادف المعقدة وروس أنتجت خلال انفجار الجهاز التنفسي سريرياً في المرضى الذين يعانون من المرض الحبيبي المزمن (رودمان)7،،من89، 10-تملك الأفراد مع رودمان الطفرات في gp91phox، أسفر عن نقص في إنتاج روس والقابلية للالتهابات المتكررة مع البكتيريا والفطريات التي ليست عادة اهتمام بالأفراد الأشخاص. ولذلك، ما إذا كانت دراسة يجري عنصر مؤكسد الإجهاد أو إشارة الأكسدة والاختزال أو الدفاع المضيف، قادرة على قياس إنتاج روس في الوقت الحقيقي مسعى مفيدة.
وقد استخدمت فحوصات متعددة لقياس إنتاج روس أو نتائج الأكسدة11،،من1213. ومن بين هذه، واحدة من الأكثر استخداماً هو مسبار فلورسنت 2 '، 7' ديتشلوروديهيدروفلوريسسين اسيتات (دكفه2-دا)14. هذا الجزيء عديم اللون ومحبتين. نشر دكفه2-دا عبر غشاء الخلية يسمح لها بأن تبت esterases داخل الخلايا، التي ديسيتيلاتيس إلى دكفه2، جعلها الخلية غير منفذة. الأعمال التي تقوم بها أنواع متعددة من روس (فوق أكسيد الهيدروجين، بيروكسينيتريتي وجذور الهيدروكسيل، وأكسيد النيتريك وأكسي الجذور) في دكفه2 أكسدة أنه في منتدى التعاون الإنمائي هو الفلورسنت (المبلغ عنها سابقا/م: 485-500 نانومتر/515-530 نانومتر) ويمكن الكشف عنها باستخدام تدفق سيتوميتير مجهزة بعامل تصفية قياسية المحددة ل fluorescein (قناة FL1). فائق أكسيد لا تتفاعل بشدة مع دكفه2 ولكن يمكن أن تتفاعل مع آخر مسبار ديهيدروثيديوم (DHE) أن تسفر عن المنتج فلورسنت 2-هيدروكسيثيديوم (فضلا عن سائر المنتجات الفلورسنت مستقلة عن فائق أكسيد الأكسدة)15. منتجات أكسدة DHE الفلورسنت يمكن الكشف عنها باستخدام الطول موجي إثارة 518 شمال البحر الأبيض المتوسط وطول موجي انبعاثات من 605 نانومتر (قناة FL2). على الرغم من أن بسيطة نسبيا لاستخدام والاستفادة من هذه التحقيقات للكشف عن روس يتطلب المعرفة بقصورها وإدماج حذراً من تلطيخ الإجراءات والضوابط في المقايسة محددة يجري تنفيذها لصالح التجريبية والنتائج والاستنتاجات. البروتوكول التالي يوضح استخدام مجموعة أدوات متوفرة تجارياً توظيف هذه المسابر 2 مصممة لقياس روس بالتدفق الخلوي. نحن وصمة عار معبي الضامة المشتقة من نخاع العظام بهذه التحقيقات والحث على إنتاج روس عن طريق FcγR العابرة للربط. يقدم الممثل البيانات التي تم الحصول عليها باستخدام هذا البروتوكول، ونؤكد الاحتياطات الملائمة التي يتعين اتخاذها لإجراء التجارب الناجحة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:623px;" width="623">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-BSA IgG1</td>
			<td style="width:121px;">Innovative Research</td>
			<td style="width:119px;">IBSA9E2C2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-mouse CD16/32</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:121px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">565853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">123108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647&#160;</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">101218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">beta-mercaptoethanol (BME)</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M3148-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">C57BL/6J&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Jackson labs</td>
			<td>Stock No.000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CM-H2DCFDA</td>
			<td style="width:121px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">C6827</td>
			<td>Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dihydroethidium (DHE)</td>
			<td style="width:121px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">D11347</td>
			<td>Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM 1x</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM no phenol red</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31053-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMF Anhydrous&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">61094-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FITC Rat IgG2a, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L glutamine</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LADMAC cells</td>
			<td style="width:121px;">ATCC</td>
			<td>CRL-2420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MEM</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mouse IFN-g</td>
			<td style="width:121px;">GoldBio</td>
			<td style="width:119px;">1360-06-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td style="width:121px;">EMD Milipore</td>
			<td style="width:119px;">106425</td>
			<td>Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Novocyte flow cytometer with autosampler</td>
			<td style="width:121px;">Acea</td>
			<td style="width:119px;">2060R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pyocyanin (ROS inducer)</td>
			<td style="width:121px;">Cayman chemical</td>
			<td style="width:119px;">10009594</td>
			<td>Can be a substitute for inducer in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ROS-ID total ROS/superoxide detection kit</td>
			<td style="width:121px;">ENZO</td>
			<td style="width:119px;">ENZ-51010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium pyruvate (100mM)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric measurement of ros production in macrophages in response to fc&#947;r cross-linking

انفجر الجهاز التنفسي أو الأكسدة المستخدمة في وصف الاستهلاك السريع للأوكسجين، وتوليد أنواع الأكسجين التفاعلية (روس) البالعات في الاستجابة للمحفزات المناعية المختلفة. روس التي تم إنشاؤها أثناء عملية التنشيط المناعي تمارس نشاط مضادات الميكروبات القوية أساسا من خلال قدرة روس على إتلاف الحمض النووي والبروتينات، مما تسبب في وفاة من الكائنات الحية الدقيقة. أن تكون قادرة على قياس إنتاج روس تكاثر ومع سهولة ضروري من أجل تقييم إسهام مختلف المسارات والجزيئات إلى هذه الآلية للدفاع المضيف. في هذه الورقة، ونحن تثبت استخدام المسابير الفلورسنت والتدفق الخلوي للكشف عن إنتاج روس. على الرغم من أن تستخدم على نطاق واسع، قياس الفلورسنت من روس المعروف إشكالية، لا سيما فيما يتعلق بقياس روس الناجم عن حوافز محددة ولا ميتوجينيك. نقدم منهجية مفصلة للكشف عن روس المتولدة نتيجة تنشيط FcγR محددة بدءاً من جيل بلعم فتيلة وتلطيخ، FcγR العابرة للربط، وتنتهي مع تحليل تدفق سيتوميتريك.

استخدام البروتوكول الواردة ضمن، نقدم بيانات تمثيلية مما يدل على تدفق سيتوميتريك الكشف عن إنتاج روس الناتجة عن تحفيز WT C57BL/6J بمدمس من خلال FcγR. كما هو متوقع، نلاحظ تغيرات طفيفة في الأسفار FL1 أو FL2 فوق مستويات الخلفية في الخلايا أونستيمولاتيد (الشكل 3 ألف، مقارنة مقابل "الملون،...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃŽÂ³R Cross-linking at JoVE.com

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃƒÅ½Ã‚Â³R Cross-linking

وتوضح هذه الدراسة استخدام التدفق الخلوي للكشف عن إنتاج الأنواع (روس) الأكسجين التفاعلية الناجمة عن تفعيل FcγR. يمكن استخدام هذا الأسلوب لتقييم التغييرات في مضادات الميكروبات والأكسدة والاختزال مما يشير إلى وظيفة البالعات ردا على مجمعات محصنة، والكائنات المجهرية أوبسونيزيد، أو العابرة للربط FcγR مباشرة.

تدفق سيتوميتريك قياس الإنتاج روس في الضامة ردا على FcγR العابرة للربط

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...

قياس أنواع الأكسجين التفاعلية أو ROS هو مشكلة معروفة. في هذا الفيديو، سوف نبرهن على القياس القابل للاستنساخ لـ ROS استجابةً لوصلة مستقبلات FC-gamma باستخدام مسابير الفلورسنت والتنظير الكيسي. المزايا الرئيسية لهذه التقنية هي إعادة إنتاج المقايسة واستخدام هذه الطريقة مع محفزات محدّدة محددة ، وليس فقط ميتوجين أو محرضات ROS المعروفة.يعد إنتاج ROS dysregulated أمرًا أساسيًا لتطوير العديد من الأمراض مثل مرض الحبيبات المزمن أو CGD. قياس بدقة يمكن أن تشكل ROS جزء واحد من التشخيص الجزيئي ل CGD. دراسة FC-بوساطة إنتاج ROS مهم في دراسة نقص المناعة, مثل CGD, ولكن أيضا في دراسة أمراض المناعة الذاتية, أو الأمراض العصبية, حيث أن الكثير من روس يؤدي إلى الإجهاد التأ المؤسد والتهاب.توقيت الفحص أمر بالغ الأهمية. أنصح شخص يحاول هذا البروتوكول للمرة الأولى أن يعد بدقة والقيام بتجربة وهمية إذا كان ذلك ممكنا. المرئية مظاهرة من هذا الأسلوب أمر بالغ الأهمية من أجل التأكيد على الخطوات من الفحص التي تحتاج إلى اهتمام خاص مثل توقيت الفحص.للبدء، قم بإعداد الضامة المشتقة من نخاع العظم باستخدام الوسائط المشروطة كما هو موضح في بروتوكول النص المصاحب. بعد فتيلة الضامة بين عشية وضحاها، الطامح عظمى وغسل الخلايا مرة واحدة مع برنامج تلفزيوني. المصل تجويع الخلايا عن طريق استبدال وسائل الإعلام مع نفس حجم DMEM المصل المنخفض.لكل فأر، سيتم التعامل مع لوحة واحدة مع المضادة BSA IgG1 في حين أن المصل تجويع بينما سيتم ترك الآخر دون علاج. إضافة دمم المصل منخفضة فقط إلى لوحات غير المعالجة وإضافة DMEM المصل المنخفض التي تحتوي على 2.5 ميكروغرام لكل ملليلتر من مورين المضادة لـ BSA IgG1 إلى لوحات المعالجة. تأكد من تضمين لوحة واحدة غير معالجة إضافية لكل تجربة لتكون بمثابة التحكم في تعويض السيمترات التدفق.احتضان لوحات أربع ساعات في 37 درجة مئوية، 5٪ CO2. خلال فترة الحضانة التي تستغرق أربع ساعات، أعد حل 2X من مسبارات أنواع الأكسجين التفاعلية. لكل 10 ملليلتر من DMEM المصل المنخفضة اللازمة، إضافة أربعة ميكرولترات من كاشف الكشف عن الإجهاد التأسدي وأربعة ميكرولترات من كاشف كشف أكسيد فائق.ثم، إعداد حلول مسبار 2X التي تحتوي فقط على كاشف الكشف عن الإجهاد التأسدي أو تحتوي على كاشف الكشف عن أكسيد فائق فقط. بعد فترة الحضانة التي تستغرق أربع ساعات، حصد الخلايا عن طريق كشط الأطباق بلطف، وجمعها في أنابيب ذات قيعان مستديرة ذات خمسة ملليلتر. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 750 مرات ز لمدة خمس دقائق.تأكد من تتبع الخلايا التي تم التعامل معها مع مورين المضادة لـ BSA IgG1. بعد ذلك، قم بغسل كريات الخلايا بمليلترين من PBS للتخلص من أي بقايا مضادة لـ BSA من الخلايا المعالجة. أجهزة الطرد المركزي الأنابيب في 750 مرات ز لمدة خمس دقائق.ثم، التعرق برنامج تلفزيوني وإعادة بناء بيليه الخلية في 600 ميكرولترات من DMEM المصل المنخفض. من تعليق الخلية 600 ميكرولتر، aliquot 200 ميكرولترات في أنابيب خمسة ملليلتر المستديرة القاعية. من الخلايا غير المعالجة، واتخاذ 200 ميكرولترات للأنابيب المسمى unstimulated، 200 ميكرولترر للأنابيب المسمى محفز إيجابي، و 200 ميكرولتررس للأنابيب المسمى تحريض إيجابي بالإضافة إلى مثبطات.ثم, من الخلايا المعالجة المضادة BSA IgG1, اتخاذ 200 ميكرولترات لأنابيب المسمى FC-غاما مستقبلات الربط عبر, و 200 ميكرولترات للأنابيب المسمى FC-غاما مستقبلات عبر الربط بالإضافة إلى مثبطات. من الخلايا غير المعالجة لاستخدامها في ضوابط التعويض، واتخاذ 200 ميكرولترات للأنبوب المسمى غير الملطخة غير المُحفزة، و200 ميكرولترر للتحكم في محفز زائد أخضر، و200 ميكرولترر لمراقبة محفز البرتقال زائد. إعداد 2X محلول تحريض إيجابي عن طريق تمييع pyocyanin واحد إلى 100 في كل من حلول مسبار 2X لتركيز 500 ميكرومولار.ثم، إعداد حل BSA 2X عن طريق تخفيف حل الأسهم BSA في حل مسبار 2X للحصول على تركيز 2X من اثنين ميكروغرام لكل ملليلتر. قبل البدء في التحفيز المحدد، مثل FC-gamma مستقبلات الربط المتبادل، تأكد من أن جميع الكواشف والخلايا جاهزة ووضع الأنابيب على الجليد في الترتيب الذي سيتم تحفيزها. بالنسبة لمقياسات التدفق التي اصطُنِق بها جهاز ampler، لاحظ الوقت الذي يستغرقه مقياس السيتا لتحليل عينة واحدة والانتقال إلى العينة التالية.تأكد من تضمين أي خلط وجسم غسل الخطوات. التوقيت أمر بالغ الأهمية لهذه الأقوال. من أجل كل حالة يمكن التحكم فيها بشكل جيد ، يجب إجراء التحفيز في 30 دقيقة بالضبط لكل حالة.تحفيز الخلايا في النظام ودمج الوقت الفاصل بين الاكتساب العينة بواسطة مقياس التدفق. إذا كان أداء التعويض اليدوي في هذه المرحلة، وتحفيز أنابيب التحكم لاستخدامها في التعويض عن طريق إضافة 200 ميكرولترات من حل مسبار 2X التي تحتوي على كاشف الكشف عن الإجهاد التأسدي والمحفز في أنابيب ملحوظ الأخضر زائد محفز. ثم، إضافة 200 ميكرولترات من 2X حل مسبار يحتوي على كاشف الكشف عن أكسيد فائق والمحفز في أنابيب ملحوظ البرتقالي زائد مستحث.احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في الظلام. باستخدام تدفق البرمجيات cytometry ، وتوليد وتسمية ثلاثة ملفات عينة للسيطرة ، غير المطّهية ، غير المعالجة ، والمحفز زائد الخضراء ، وعينات محفز البرتقال ، مع التأكد من الإشارة إلى القنوات والمعلمات التي سيتم تحليلها. أيضا، أدخل شروط التوقف المطلوبة.وبمجرد إعداد عينات التحكم، قم بإنشاء مجموعة مماثلة من الملفات للعينات التجريبية وتسميتها. الآن، تشغيل العينة غير الملطخة وغير المعالجة. فتح مؤامرة نقطة للأمام مبعثر على محور س مقابل الجانب مبعثر على المحور ص ورسم بوابة حول الخلايا ذات الأهمية، باستثناء الخلايا الميتة والحطام.بعد ذلك، استخدم بوابة هذه الخلية لفتح نقطة أخرى من علامة الفلورس الأول، FL1، على المحور س، مقابل علامة الفلورس الثانية، FL2، على المحور ص. رسم بوابة رباعية أولية ثم قم بضبط بوابة الربع بحيث تظهر الأحداث على الربع الأيسر السفلي من مؤامرة FL1 مقابل FL2. عند الانتهاء، تشغيل العينة الخضراء زائد مستحث.ضبط الجهد بحيث تظهر الأحداث على الربعين السفليين الأيسر والأيني من FL1 مقابل FL2 مؤامرة. ثم، تطبيق هذه المصفوفة التعويض إلى كافة ملفات نموذج الثلاثة. الآن، تشغيل عينة محفز برتقال زائد.ضبط الجهد بحيث تظهر الأحداث على الربعين العلوي والأيسر السفلي من FL1 مقابل FL2 مؤامرة، ثم تطبيق هذه المصفوفة التعويض على جميع ملفات عينة ثلاثة. تحقق من كل ملف التعويض والتأكد من أن الأحداث غير المطهية، غير المعالجة تظهر على الربع الأيسر السفلي، والأحداث الخضراء زائد تحريض تظهر على الربعين السفلي الأيمن والأيسر، والأحداث زائد البرتقال تظهر على الربعين العلوي والأيسر السفلي من FL1 مقابل FL2 مؤامرة. ثم، تطبيق مصفوفة التعويض على كافة ملفات عينة التجريبية.وبمجرد أن يتم تنفيذ التعويض اليدوي وجرى الحصول على نموذج تجريبي، انتقل إلى العينات التجريبية. قبل علاج الخلايا بمحفز إيجابي أو إجراء تحفيز خلايا مستقبلات FC-Gamma ، ضع علامة على الأنابيب التي ستحصل على مثبط ROS. علاج هذه الخلايا مع مثبطات ROS على الأقل 30 دقيقة قبل المحفز الإيجابي أو FC-غاما تحفيز مستقبلات عن طريق إضافة ميكرولتر واحد من المانع إلى 200 ميكرولتر من الخلايا resuspended لتركيز النهائي من خمسة ملليمولار.للخلايا غير المُحَذَّة، عالج الخلايا بـ 200 ميكرولترات من محلول مسبار 2X دون أي حافز يضاف إلى 200 ميكرولترات من تعليق الخلايا المسمى الملون، غير المُحفز. للضوابط الإيجابية، علاج الخلايا مع 200 ميكرولترات من 2X محلول تحريض إيجابي إلى 200 ميكرولترات من تعليق الخلية المسمى محفز إيجابي أو محفز إيجابي زائد المانع. وأخيرا، بالنسبة للخلايا التي تحفزها FC-غاما مستقبلات الربط عبر، علاج لهم مع 200 ميكرولترات من حل 2X BSA إضافة إلى 200 ميكرولترات من تعليق الخلية المسمى FC-غاما مستقبلات crosslinking أو FC-غاما مستقبلات عبر الربط بالإضافة إلى مثبطات.احتضان الخلايا لمدة 30 دقيقة في الظلام. بعد الحضانة، وتحليل العينات في الترتيب الذي تم تحفيزها، وذلك باستخدام تدفق cytometer وقوالب التحليل التي تم إنشاؤها خلال خطوات التعويض الأولية. وتبين البيانات المعروضة هنا أن عملية الكشف عن تدفق الخلايا من إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلية الناتجة عن تحفيز الضامة من خلال مستقبلات FC-gamma.هناك زيادة ملحوظة في FL1 وFL2 fluorescence عندما يتم تحفيز الخلايا مع عامل FC-غاما مستقبلات crosslinking. عندما تم علاج الخلايا مع مثبطات أنواع الأكسجين التفاعلية قبل FC-gamma مستقبلات الربط المتبادل، يتم جلب هذا الفلورس زيادة مرة أخرى إلى مستويات القاعدية. وعلى النقيض من ذلك، فإن هذه المؤامرات النقطية تقدم تجربة غير ناجحة، حيث لوحظ إنتاج أنواع الأكسجين التفاعلي دون المستوى الأمثل نتيجة لتحفيز مستقبلات FC-gamma.لتسليط الضوء على الاختلافات الكبيرة بين النسب المئوية المتوقعة، أو زيادات MFI، تظهر هذه البيانات ما تبدو عليه العينات مع زيادة طفيفة في فلوريت FL1 وFL2. يستخدم البروتوكول الحالي خطوة فتيلة على مدار 24 ساعة. عند مقارنة 24 ساعة مقابل وقت فتيلة 48 ساعة، لم يكن هناك فرق ملحوظ في النسبة المئوية للخلايا إيجابية لمجهاد الأكسدة الخضراء.ومع ذلك، فإن زيادة الوقت المؤقت إلى 48 ساعة لم تزيد النسبة المئوية للخلايا إيجابية لفلوريسنس البرتقال. أهم الأشياء التي يجب تذكرها عند تنفيذ هذا الإجراء هي التخطيط للمستقبل ، والاتساق حول توقيت الفحص للحصول على نتائج قابلة للاستنساخ.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

تحليلات متعددة الألوان من التدفق الخلوي الاستجابة المناعية الخلوية في المكاك وهو قرد اسيوي

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

قياس كمية الاستجابة المناعية والنوم في<em&gt; ذبابة الفاكهة</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

تحليل إمكانية الوصول المذيبات من بقايا السيستين على<em&gt; الذرة rayado فينو فيروس</em&gt; الفيروسات مثل الجزيئات التي تنتج في<em&gt; نيكوتيانا benthamiana</em&gt; النباتات والصليب ربط-من الببتيدات لVLPs

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

باستخدام الحمض النووي الريبي التدخل للتحقيق في الاستجابة المناعية الفطرية في الفأر الضامة

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

وتدفق Cytometric بسيط طريقة لقياس امتصاص الغلوكوز والجلوكوز التعبير الناقل للالقطعان الوحيدات في الدم الكامل

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

تدفق تحليل Cytometric من متجهة الجسيمات بيت ت 1 مسببات الحساسية في PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

تدفق تحليل Cytometric من القاتل الطبيعي خلية التحللي آخر في الدم الجامع البشري

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

عزل السالمونيلا تيفيموريوم-التي تحتوي على فاجوسوميس من الضامة

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

العزلة والثقافة في المختبر من البلاعم السنخية مورين والبشرية

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

تحليل تدفق Cytometric لتسلل الخلايا اللمفاوية في الجهاز العصبي المركزي أثناء التهاب الدماغ المناعي الذاتي التجريبي

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...