Name: flow cytometric measurement of ros production in macrophages in response to fc&#947;r cross-linking
Uploaded: 2019-03-07T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃŽÂ³R Cross-linking at JoVE.com

作者要感谢 tigno-aranjuez 实验室的其他成员, 包括 madelyn h. miller、omar cardona、andjie jeudy 和 roopin singh, 感谢他们在实验室维护和老鼠群体维护方面提供的帮助。这项研究的支助是由 r00 hl122365 赠款和 j. t. t. a. 启动资金提供的。

动物处理协议得到了中佛罗里达大学动物护理和使用机构委员会 (iacuc) 的批准。
1. 骨髓巨噬细胞的产生
<ol><li>
文化媒体的准备
	<ol>
<li>准备 d10f 基础媒体: 到 dulbecco 的修改鹰媒体 (dmem), 加入10% 热灭活的胎儿牛血清 (fbs)、1 mm 丙酮酸钠、10 mm 4-(2-羟基乙基)-1-吡嗪-乙酸 (hepes) 和 0.05 mm β-硫醇。 注: 虽然最好使用新鲜的 d10f 介质, 但 d10f 基介质最多可以提前两周准?...

<ol>
	<li>Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+Oxygen+Species+and+Neutrophil+Function.">Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).</li><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress.">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).</li><li>Robinson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+in+phagocytic+leukocytes.">Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).</li><li>Thomas, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phagocyte+respiratory+burst:+Historical+perspectives+and+recent+advances.">The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances.</a> Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).</li><li>Fang, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+actions+of+reactive+oxygen+species.">Antimicrobial actions of reactive oxygen species.</a> MBio. 2 (5), (2011).</li><li>Iles, K. E., Forman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+signaling+and+respiratory+burst.">Macrophage signaling and respiratory burst.</a> Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).</li><li>Curnutte, J. T., Whitten, D. M., Babior, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+superoxide+production+by+granulocytes+from+patients+with+chronic+granulomatous+disease.">Defective superoxide production by granulocytes from patients with chronic granulomatous disease.</a> New England Journal of Medicine. 290 (11), 593-597 (1974).</li><li>Good, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatal+(chronic)+granulomatous+disease+of+childhood:+a+hereditary+defect+of+leukocyte+function.">Fatal (chronic) granulomatous disease of childhood: a hereditary defect of leukocyte function.</a> Seminars in Hematology. 5 (3), 215-254 (1968).</li><li>Holmes, B., Page, A. R., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+the+metabolic+activity+of+leukocytes+from+patients+with+a+genetic+abnormality+of+phagocytic+function.">Studies of the metabolic activity of leukocytes from patients with a genetic abnormality of phagocytic function.</a> Journal of Clinical Investigation. 46 (9), 1422-1432 (1967).</li><li>Windhorst, D. B., Page, A. R., Holmes, B., Quie, P. G., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pattern+of+genetic+transmission+of+the+leukocyte+defect+in+fatal+granulomatous+disease+of+childhood.">The pattern of genetic transmission of the leukocyte defect in fatal granulomatous disease of childhood.</a> Journal of Clinical Investigation. 47 (5), 1026-1034 (1968).</li><li>Dikalov, S. I., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species.">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).</li><li>Held, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Reactive+Oxygen+Species:+Measurement+of+ROS+in+cells.">An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in cells.</a> White Paper. , (2015).</li><li>Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+reactive+oxygen+species+measurement+in+biological+systems.">Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).</li><li>Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2',7'-Dichlorodihydrofluorescein+as+a+fluorescent+probe+for+reactive+oxygen+species+measurement:+Forty+years+of+application+and+controversy.">2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy.</a> Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).</li><li>Zielonka, J., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroethidine-+and+MitoSOX-derived+red+fluorescence+is+not+a+reliable+indicator+of+intracellular+superoxide+formation:+another+inconvenient+truth.">Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).</li><li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification+and+labeling+of+mouse+bone+marrow+neutrophils+for+functional+studies+and+adoptive+transfer+experiments.">Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).</li></ol>

dcfh 2-da 和基于 dhes 的 ros 检测是一种广泛使用的技术14,15.这些 ros 探针在动力学微板格式、荧光显微镜或流式细胞仪分析中的易用性和适应性有助于其普及。然而, 在我们对 fcγr 介导的巨噬细胞功能的研究中, 似乎没有一个标准的方法来进行 fcγr 交联细胞的流式细胞仪分析。鉴于所评估的分析物的反应性, 我们发现时间安排对于确保实现重现性?...

活性氧 (ros) 是活性分子或自由基, 是有氧呼吸的副产品 (综述在 1)。其中包括超氧化物阴离子、过氧化物、过氧化氢、羟基自由基和羟基离子等。在正常的生理条件下, ros 主要由线粒体和烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸 (nadph) 氧化酶产生, 并由超氧化物歧化酶和谷胱甘肽等多种酶和蛋白质快速解毒。ros 的夸大产生或去除 ros 能力的缺陷会导致氧化应激, 其中活性氧物种会促进蛋白质、脂质和 dna 的损害, 导致细胞应激或死亡和病理疾病状态。然而, 目前人们认识到 ros 也可以作为信号分子 (氧化还原信号), 而 ros 介导的各种分子和途径中间体的修饰可以影响细胞代谢、增殖、生存、炎症信号, 和老化2。在吞噬细胞中, ros 在提供所谓的 "呼吸爆裂"1、3、4、5、6期间发挥着至关重要的作用。在吞噬细胞对外部刺激的反应中, nadph 氧化酶复合物 (p40 phox、p40phox、p40phox) 的成分从细胞溶胶转移到含有 gp91 phox 和 p22phox 的吞噬膜上亚基, 并与 rac半的行动, 形成一个全功能的 nadph 氧化酶复合物。然后, 组装的 nadph 氧化酶利用 nadph 将氧气还原为脂肪体液泡内的超氧化物。超氧化物阴离子可直接造成损害或分解成过氧化氢。超氧化物和过氧化氢都可以与其他分子发生反应, 产生高活性的羟基自由基。损伤是由这些 ros 与蛋白质上的铁硫簇反应或导致 dna 的碱基氧化来介导的, 最终导致微生物代谢受限或微生物5死亡。在慢性肉芽肿病 (cgd)7, 8, 9,10. 患有 cgd 的个体在 gp91phox 中具有突变, 导致缺乏 ros 的产生, 并容易受到细菌和真菌的反复感染, 而细菌和真菌通常与免疫能力的个人无关。因此, 无论是研究氧化应激、氧化还原信号, 还是宿主防御, 能够实时测量 ros 的产生都是一个有益的尝试。
多项检测已被用来测量 ros 的产生或氧化应激的结果 11,12,13。其中, 其中最广泛使用的是荧光探针 2 ', 7 ' 二氯氢荧光素二乙酸 (dcfh 2-da)14.这种分子是无色和亲脂性的。dcfh-da 在细胞膜上的扩散使其能够通过细胞内酯酶作用, 从而将其转化为 dcfh2 , 使其具有不渗透性。多种类型的 ros (过氧化氢、过氧亚硝酸盐、羟基自由基、一氧化氮和过氧自由基) 在 dcfh2上的作用将其氧化为荧光的 dcf (报告为 exsem:485-500 nm\ 15-530 nm), 并可通过流量检测细胞仪配备了荧光素 (fl1 通道) 的标准过滤器集。超氧化物与 dcfh2 不强烈反应, 但可与另一种探针二氢乙二酸 (dfe) 反应, 产生荧光产物 2-羟基乙酸 (以及其他与荧光超氧化物无关的氧化产物)15.使用518纳米的激发波长和 605 nm (fl2 通道) 的发射波长可以检测到 dfe 氧化的荧光产物。虽然使用起来相对简单, 但要利用这些探针检测 ros, 需要了解它们的局限性, 并仔细地将染色程序和控制纳入正在进行的具体检测中, 以便有有效的实验结果和结论。下面的协议演示了使用商用套件的方法, 该套件采用了这两个探头, 用于流式细胞仪测量 ros。用这些探针染色引种骨骨髓衍生的巨噬细胞, 通过 fcγr 交联诱导 ros 的产生。我们提供了使用该协议获得的具有代表性的数据, 并强调了成功试验必须采取的适当预防措施。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:623px;" width="623">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-BSA IgG1</td>
			<td style="width:121px;">Innovative Research</td>
			<td style="width:119px;">IBSA9E2C2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-mouse CD16/32</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:121px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">565853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">123108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647&#160;</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">101218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">beta-mercaptoethanol (BME)</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M3148-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">C57BL/6J&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Jackson labs</td>
			<td>Stock No.000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CM-H2DCFDA</td>
			<td style="width:121px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">C6827</td>
			<td>Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dihydroethidium (DHE)</td>
			<td style="width:121px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">D11347</td>
			<td>Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM 1x</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM no phenol red</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31053-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMF Anhydrous&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">61094-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FITC Rat IgG2a, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L glutamine</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LADMAC cells</td>
			<td style="width:121px;">ATCC</td>
			<td>CRL-2420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MEM</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mouse IFN-g</td>
			<td style="width:121px;">GoldBio</td>
			<td style="width:119px;">1360-06-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td style="width:121px;">EMD Milipore</td>
			<td style="width:119px;">106425</td>
			<td>Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Novocyte flow cytometer with autosampler</td>
			<td style="width:121px;">Acea</td>
			<td style="width:119px;">2060R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pyocyanin (ROS inducer)</td>
			<td style="width:121px;">Cayman chemical</td>
			<td style="width:119px;">10009594</td>
			<td>Can be a substitute for inducer in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ROS-ID total ROS/superoxide detection kit</td>
			<td style="width:121px;">ENZO</td>
			<td style="width:119px;">ENZ-51010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium pyruvate (100mM)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric measurement of ros production in macrophages in response to fc&#947;r cross-linking

氧化或呼吸爆裂是用来描述快速消耗氧气和产生活性氧物种 (ros) 的吞噬细胞响应各种免疫刺激。免疫激活过程中产生的 ros 主要通过 ros 破坏 dna 和蛋白质的能力来发挥有效的抗菌活性, 从而导致微生物死亡。能够可重复地、轻松地测量 ros 的生产是必要的, 以评估各种途径和分子对这种宿主防御机制的贡献。本文演示了荧光探针和流式细胞仪在检测 ros 生产中的应用。虽然广泛使用, 荧光测量 ros 是出了名的问题, 特别是在测量 ros 引起的特定和非有丝分裂的刺激。我们提出了一个详细的方法来检测 rs 产生的特定 fcγr 刺激的结果, 从巨噬细胞的产生, 启动, 染色, fcγr 交联, 并结束与流式细胞仪分析结束。

利用内概述的协议, 我们提出了具有代表性的数据, 证明流式细胞仪检测的 ros 生产产生刺激 wt c57bl/6j bmdm 通过 fcγr。如预期的那样, 我们观察到在未受刺激的细胞中 fl1 或 fl2 荧光在背景水平之上的微小变化 (图 3 a, 将 "染色、未受激" 与 "未染色、未受刺激" 的点图进行比较)。我们观察到 fl1 和 fl2 荧光在 fcγr 交联剂刺激时显著增加 (图 3a, 比较 "染色和刺...

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Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃƒÅ½Ã‚Â³R Cross-linking

这项研究表明, 使用流式细胞仪检测活性氧 (ros) 的产生, 由于激活的 fcγr。该方法可用于评估吞噬细胞对免疫复合物、光化微生物或直接 fcγr 交联的抗菌和氧化还原信号功能的变化。

巨噬细胞 ros 产生的流式细胞仪测量对 fcγr 交联的响应

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...

活性氧物种或ROS的测量是出了名的问题。在这段视频中，我们将演示ROS的可重复测量，以响应使用荧光探针和流式细胞学的FC-伽马受体交联。该技术的主要优点是测定的可重复性，以及使用这种方法与特定的抗原刺激，不仅米罗根或已知的ROS诱导剂。失调的ROS生产是许多疾病，如慢性肉芽肿疾病或CGD的发展的核心。准确测量ROS可以构成CGD分子诊断的一部分。研究 FC 调媒体对研究免疫缺陷（如 CGD）非常重要，但也在研究自身免疫性疾病或神经退行性疾病（其中 ROS 太多导致氧化应激和炎症）方面也很重要。测定的时机至关重要。我建议第一次尝试这个协议的人要做充分的准备， 如果可能的话， 做一个模拟实验。这种方法的视觉演示对于强调需要特别注意的测定步骤（如测定的时间）至关重要。首先，使用附带的文本协议中描述的条件介质准备骨髓衍生的巨噬细胞。在一夜之间对巨噬细胞进行吸气后，吸上经，用PBS清洗细胞一次。血清用相同体积的低血清DMEM取代介质，使细胞挨饿。对于每只小鼠，一个板将治疗抗BSAIgG1，而血清挨饿，而另一个将离开未经治疗。在未经处理的板材中只添加低血清DMEM，并将每毫升莫林抗BSA IgG1含有2.5微克的低血清DMEM添加到经过处理的板材中。确保每个实验都包括一个额外的未经处理的板，以作为流动细胞测量补偿控制。在37摄氏度、5%CO2下孵育板4小时。在四个小时的孵育过程中，准备活性氧物种探针的2X溶液。对于每需要 10 毫升的低血清 DMEM，添加 4 微升氧化应激检测试剂和 4 微升超氧化物检测试剂。然后，准备仅包含氧化应力检测试剂或仅含有超氧化物检测试剂的2X探针溶液。经过四个小时的孵育，通过轻轻刮过盘子，用五毫升的圆底管收集细胞。将管子以750倍g离心5分钟。请务必跟踪哪些细胞被用穆林抗 BSA IgG1 治疗。接下来，用两毫升PBS清洗细胞颗粒，以去除治疗细胞中残留的抗BSA。将管子以750倍g离心5分钟。然后，吸气PBS，在600微升低血清DMEM中重新暂停细胞颗粒。从600微升电池悬浮液，等方200微升进入预标记的5毫升圆底管。从未经处理的细胞中，为标有未发法的管子服用200微升，为标有正诱导剂的管子服用200微升，为标有正诱导剂加抑制剂的管子服用200微升。然后，从抗BSAIgG1处理细胞，采取200微升的管标记FC-伽马受体交联，200微升管标记FC-伽马受体交联加抑制剂。从用于补偿控制的未经处理的细胞中，为标有未污染的管子服用200微升，为绿色加诱导剂控制服用200微升，为橙色加诱导剂控制服用200微升。通过将皮奥氰辛稀释到每个 2X 探针溶液中，以 500 微摩尔的浓度，准备 2 倍正诱导剂溶液。然后，通过稀释 2X 探针溶液中的 BSA 库存溶液来准备 2X BSA 溶液，以获得每毫升 2 微克的 2X 浓度。在开始特定的刺激（如 FC-伽马受体交联）之前，确保所有试剂和细胞都准备就绪，并将管子放在冰上，按其刺激的顺序排列。对于带自动采样器的流动圆度计，请注意圆度计分析一个样本并转到下一个样本的时间。请务必包括任何混合和探头清洗步骤。时间对于这个测定非常关键。为了很好地控制每个情况，每个条件需要在30分钟内进行刺激。按顺序刺激细胞，并纳入流动细胞仪采集样本之间的滞后时间。如果此时执行手动补偿，则通过将含有氧化应力检测试剂和诱导剂的 2X 探针溶液中的 200 微升加入标有绿色外加诱导剂的管中来刺激控制管以进行补偿。然后，将含有超氧化物检测试剂和诱导剂的200微升2X探针溶液加入标有橙色加诱导剂的管中。在黑暗中孵育细胞30分钟。使用流式细胞学软件，生成并标记三个样本文件，用于控制、未污染、未经处理、绿色加诱导剂和橙色加诱导剂样本，确保指示要分析的通道和参数。此外，输入所需的停止条件。设置控制样本后，为实验样本生成并标记一组类似的文件。现在，运行未经污染的未经处理的样品。打开 X 轴上向前散射的点图，而在 Y 轴上打开侧散射点，并在感兴趣的细胞周围绘制一个栅极，不包括死细胞和碎片。接下来，使用此单元的栅极打开 X 轴上第一个荧光标记 FL1 的另一个点图，而 Y 轴上的第二个荧光标记 FL2。绘制初始象限门，然后调整象限门，以便事件出现在 FL1 与 FL2 绘图的左下象限上。完成后，运行绿色加诱导剂样本。调整电压，使事件出现在 FL1 与 FL2 图的左下、右象限上。然后，将此补偿矩阵应用于所有三个示例文件。现在，运行橙色加诱导剂样本。调整电压，使事件出现在 FL1 与 FL2 图的左上和下四边形上，然后将此补偿矩阵应用于所有三个样本文件。检查每个补偿文件，并确保未污染的、未经处理的事件出现在左下象限上，绿色加诱导器事件出现在左下两个象限上，橙色加诱导器事件出现在 FL1 与 FL2 图的左下两个象限上。然后，将补偿矩阵应用于所有实验样本文件。执行手动补偿并获取实验模板后，转到实验样本。在用正诱导剂或进行FC-伽马受体细胞刺激治疗细胞之前，标记哪些管子会得到ROS抑制剂。在正诱导剂或FC-伽马受体刺激前至少30分钟用ROS抑制剂治疗这些细胞，将抑制剂的一微升加入200微升的再增细胞，最终浓度为5毫摩尔。对于未刺激的细胞，使用 2X 探针溶液的 200 微升处理细胞，而无需在标记有染色、未染色的 200 微升细胞悬浮液中添加任何刺激。对于正对照，用2X正诱导剂溶液的200微升治疗细胞，以200微升的细胞悬浮液标记为正诱导剂或正诱导剂加抑制剂。最后，对于受FC-伽马受体交联刺激的细胞，用2X BSA溶液的200微升进行治疗，加入200微升的细胞悬浮液，标有FC-伽马受体交联或FC-伽马受体交联加抑制剂。在黑暗中孵育细胞30分钟。孵育后，使用流式细胞仪和初始补偿步骤中生成的分析模板，按照受刺激的顺序分析样品。此处显示的数据表明，通过FC-伽马受体刺激巨噬细胞，对活性氧物种的流式细胞测量检测。当细胞受到FC-伽马受体交联剂的刺激时，FL1和FL2荧光显著增加。当细胞在FC-伽马受体交联之前用活性氧物种抑制剂进行治疗时，这种增加的荧光被带回基底水平。相比之下，这些点图提出了一个不成功的实验，其中观察到FC-伽马受体刺激导致的不理想的活性氧物种产生。为了突出预期百分比或 MFI 增加之间的较大差异，此数据显示 FL1 和 FL2 荧光最小增加的样本如下所示。当前协议使用 24 小时启动步骤。在比较24小时与48小时启动时间时，绿色氧化应激试剂的细胞阳性百分比没有明显差异。然而，将启动时间增加至48小时确实增加了橙色荧光的细胞阳性百分比。执行此过程时，要记住的最重要的事情是提前计划，并始终如一地确定检测的时间，以获得可重现的结果。

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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科研

免疫与感染

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