Name: flow cytometric measurement of ros production in macrophages in response to fc&#947;r cross-linking
Uploaded: 2019-03-07T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃŽÂ³R Cross-linking at JoVE.com

Forfatterne vil gerne takke andre medlemmer af Tigno-Aranjuez Lab herunder Madelyn H. Miller, Omar Cardona, Andjie Jeudy og Roopin Singh for deres hjælp i laboratoriet vedligeholdelse og mus koloni vedligeholdelse. Support af denne forskning blev leveret af grant R00 HL122365 og Start-up midler til J.T.T-A.

Protokol for dyr håndtering blev godkendt af det institutionelle Animal Care og brug udvalg (IACUC) af University of Central Florida.
1. generation af knoglemarv afledt makrofager (BMDMs)
<ol><li>
Kultur medier forberedelse
	<ol>
<li>Forberede D10F base medier: til Dulbeccos modificerede Eagle Medium (DMEM), tilføje 10% varme inaktiveret føtal bovint serum (FBS), 1 mM natrium pyruvat, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syre (HEPES) og 0,05 mM β-mercaptoe...

<ol>
	<li>Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+Oxygen+Species+and+Neutrophil+Function.">Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).</li><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress.">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).</li><li>Robinson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+in+phagocytic+leukocytes.">Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).</li><li>Thomas, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phagocyte+respiratory+burst:+Historical+perspectives+and+recent+advances.">The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances.</a> Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).</li><li>Fang, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+actions+of+reactive+oxygen+species.">Antimicrobial actions of reactive oxygen species.</a> MBio. 2 (5), (2011).</li><li>Iles, K. E., Forman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+signaling+and+respiratory+burst.">Macrophage signaling and respiratory burst.</a> Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).</li><li>Curnutte, J. T., Whitten, D. M., Babior, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+superoxide+production+by+granulocytes+from+patients+with+chronic+granulomatous+disease.">Defective superoxide production by granulocytes from patients with chronic granulomatous disease.</a> New England Journal of Medicine. 290 (11), 593-597 (1974).</li><li>Good, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatal+(chronic)+granulomatous+disease+of+childhood:+a+hereditary+defect+of+leukocyte+function.">Fatal (chronic) granulomatous disease of childhood: a hereditary defect of leukocyte function.</a> Seminars in Hematology. 5 (3), 215-254 (1968).</li><li>Holmes, B., Page, A. R., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+the+metabolic+activity+of+leukocytes+from+patients+with+a+genetic+abnormality+of+phagocytic+function.">Studies of the metabolic activity of leukocytes from patients with a genetic abnormality of phagocytic function.</a> Journal of Clinical Investigation. 46 (9), 1422-1432 (1967).</li><li>Windhorst, D. B., Page, A. R., Holmes, B., Quie, P. G., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pattern+of+genetic+transmission+of+the+leukocyte+defect+in+fatal+granulomatous+disease+of+childhood.">The pattern of genetic transmission of the leukocyte defect in fatal granulomatous disease of childhood.</a> Journal of Clinical Investigation. 47 (5), 1026-1034 (1968).</li><li>Dikalov, S. I., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species.">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).</li><li>Held, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Reactive+Oxygen+Species:+Measurement+of+ROS+in+cells.">An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in cells.</a> White Paper. , (2015).</li><li>Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+reactive+oxygen+species+measurement+in+biological+systems.">Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).</li><li>Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2',7'-Dichlorodihydrofluorescein+as+a+fluorescent+probe+for+reactive+oxygen+species+measurement:+Forty+years+of+application+and+controversy.">2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy.</a> Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).</li><li>Zielonka, J., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroethidine-+and+MitoSOX-derived+red+fluorescence+is+not+a+reliable+indicator+of+intracellular+superoxide+formation:+another+inconvenient+truth.">Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).</li><li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification+and+labeling+of+mouse+bone+marrow+neutrophils+for+functional+studies+and+adoptive+transfer+experiments.">Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).</li></ol>

DCFH2-DA og DHE-baseret detektion af ROS er en meget udbredt teknik14,15. Brugervenlighed og tilpasningsevne af disse ROS sonder til kinetic mikrotiterplade formater, Fluorescens mikroskopi eller flow cytometric analyse har bidraget til deres popularitet. Men i vores studier af FcγR-medieret makrofag funktioner, der ikke syntes at være en standardprotokol til at udføre denne analyse for flow cytometric analyse af FcγR krydsbundet celler. Givet den ...

Reaktive ilt arter (ROS) er reaktiv molekyler eller frie radikaler, der er biprodukter af aerob respiration (gennemgik i 1). Disse omfatter superoxid-anion, peroxid, hydrogenperoxid, hydroxyl radikale og hydroxyl-ioner, blandt andre. Under normale fysiologiske, ROS fremstilles hovedsagelig af mitokondrier og nicotinamid-adenin-dinucleotid-phosphat (NADPH) oxidases og er hurtigt detoksi-forskellige enzymer og proteiner såsom superoxiddismutase og glutathion. En overdreven produktion af ROS eller en defekt i evnen til at fjerne ROS kan føre til oxidativ stress, hvorved reaktive ilt arter fremme beskadigelse af proteiner, lipider og DNA fører til cellulært stress eller død og patologiske sygdomstilstande. Men det er i øjeblikket værdsat at ROS kan også fungere som signaling molekyler (redox signalering), og ROS-medieret ændring af forskellige molekyler og pathway mellemprodukter kan påvirke cellulære metabolisme, spredning, overlevelse, inflammatoriske signalering, og aging2. I fagocyterende celler spiller ROS en afgørende rolle i forbindelse med antimikrobiel aktivitet under den såkaldte "respiratoriske burst"1,3,4,5,6. Under fagocytter reaktion på eksterne stimuli translocate komponenter af NADPH oxidase komplekse (p40phox, p47phox, p67phox) fra cytosol til den phagosomal membran, der indeholder gp91phox og p22phox underenheder, og sammen med Rac1/2 handlinger udgør en fuldt funktionel NADPH oxidase enzym kompleks. De forsamlede NADPH oxidase derefter benytter NADPH til at reducere ilt til superoxid inden for den phagosomal vakuole. Superoxid anioner kan direkte skade eller være dismutated i brintoverilte. Både superoxid og brintoverilte kan reagere med andre molekyler til at generere meget reaktive hydroxylradikaler. Skader er medieret af reaktion af disse ROS med jern-svovl klynger på proteiner eller forårsager base oxidation af DNA, i sidste ende fører til begrænset mikrobiel metabolisme eller død af mikrobe5. Betydningen af NADPH oxidase enzym kompleks og ROS produceret under den respiratoriske burst illustreres klinisk hos patienter med kronisk granulomatøs sygdom (CGD)7,8,9, 10. personer med CGD besidder mutationer i gp91phox, hvilket resulterer i en mangel på ROS produktion og modtagelighed for tilbagevendende infektioner med bakterier og svampe, der ikke er normalt en bekymring med immunkompetente enkeltpersoner. Derfor om at studere oxidativ stress, redox signalering eller vært forsvar, at være i stand til at måle er ROS produktion i realtid en nyttig bestræbelse.
Flere assays har været udnyttet til foranstaltning ROS produktion eller resultaterne af oxidativt stress11,12,13. Blandt disse er en af de mest anvendte fluorescerende sonde 2', 7' dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFH2-DA)14. Dette molekyle er farveløs og lipofile. Udbredelse af DCFH2-DA over cellemembranen tillader det at blive fulgt op af intracellulære esteraser, som deacetylates det i DCFH2, rendering det celle uigennemtrængelige. Handlinger af flere typer af ROS (brintoverilte, peroxynitrite, hydroxylradikaler, nitrogenoxid og peroxyradikaler) på DCFH2 oxidere det i DCF, der er fluorescerende (rapporteret Ex / Em: 485-500 nm/515-530 nm) og kan registreres ved hjælp af en flow Flowcytometret udstyret med en standard filter sat til fluorescein (FL1 kanal). Superoxid reagerer ikke stærkt med DCFH2 men kan reagere med en anden sonde dihydroethidium (DHE) at give fluorescerende produkt 2-hydroxyethidium (samt andre fluorescerende superoxid-uafhængig oxidation produkter)15. De fluorescerende produkter af DHE oxidation kan påvises ved hjælp af en excitation boelgelaengden 518 nm og en emission boelgelaengden 605 nm (FL2 kanal). Selvom relativt enkel at bruge, kræver udnyttelse af disse sonder for opdagelse af ROS viden om deres begrænsninger og passe iblanding farvning procedurer og kontrol i specifikke analysen udføres for at have gyldig eksperimentelle resultater og konklusioner. Følgende protokol viser brugen af et kommercielt tilgængeligt kit beskæftiger disse 2 sonder designet til at måle ROS ved flowcytometri. Vi pletten PRIMES knoglemarv-afledte makrofager med disse sonder og fremkalde ROS produktion gennem FcγR cross-linking. Vi præsentere repræsentative data opnået ved hjælp af denne protokol og understrege passende forholdsregler, der skal gennemføres for vellykkede eksperimenter.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:623px;" width="623">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-BSA IgG1</td>
			<td style="width:121px;">Innovative Research</td>
			<td style="width:119px;">IBSA9E2C2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-mouse CD16/32</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:121px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">565853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">123108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647&#160;</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">101218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">beta-mercaptoethanol (BME)</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M3148-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">C57BL/6J&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Jackson labs</td>
			<td>Stock No.000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CM-H2DCFDA</td>
			<td style="width:121px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">C6827</td>
			<td>Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dihydroethidium (DHE)</td>
			<td style="width:121px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">D11347</td>
			<td>Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM 1x</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM no phenol red</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31053-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMF Anhydrous&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">61094-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FITC Rat IgG2a, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L glutamine</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LADMAC cells</td>
			<td style="width:121px;">ATCC</td>
			<td>CRL-2420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MEM</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mouse IFN-g</td>
			<td style="width:121px;">GoldBio</td>
			<td style="width:119px;">1360-06-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td style="width:121px;">EMD Milipore</td>
			<td style="width:119px;">106425</td>
			<td>Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Novocyte flow cytometer with autosampler</td>
			<td style="width:121px;">Acea</td>
			<td style="width:119px;">2060R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pyocyanin (ROS inducer)</td>
			<td style="width:121px;">Cayman chemical</td>
			<td style="width:119px;">10009594</td>
			<td>Can be a substitute for inducer in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ROS-ID total ROS/superoxide detection kit</td>
			<td style="width:121px;">ENZO</td>
			<td style="width:119px;">ENZ-51010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium pyruvate (100mM)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric measurement of ros production in macrophages in response to fc&#947;r cross-linking

Den oxidative eller respiratoriske burst bruges til at beskrive den hurtige forbrug af ilt og generation af reaktive ilt arter (ROS) af fagocytter svar på forskellige immun stimuli. ROS genereret i løbet af immun aktivering udøver potent antimikrobiel aktivitet primært gennem ROS evne til at skade DNA og proteiner, forårsager død af mikroorganismer. At være i stand til at måle ROS produktion reproducerbar og med lethed er nødvendige for at vurdere de forskellige veje og molekyler til denne mekanisme af vært forsvar bidrag. I dette papir, vi demonstrere brugen af fluorescerende sonder og flow flowcytometri ægprodukters ROS produktion. Selv om udbredt, er fluorescerende måling af ROS notorisk problematisk, især med hensyn til måling af ROS induceret af specifikke og ikke mitogenic stimuli. Vi præsenterer en detaljeret metode til at registrere ROS genereret som følge af specifikke FcγR stimulation begynder med makrofag generation, priming, farvning, FcγR cross-linking og slutter med flow cytometric analyse.

Ved hjælp af protokollen, der er skitseret i, præsenterer vi repræsentative data viser flow cytometric påvisning af ROS produktion som følge af stimulation af WT C57BL/6J BMDMs gennem FcγR. Som forventet, vi observerer minimale ændringer i FL1 eller FL2 fluorescens ovenfor baggrundsniveauer i unstimulated celler (figur 3A, sammenligne "farvede, unstimulated" vs "unstained, unstimulated" dot grunde). Vi observerer en markant stigning i FL1 og FL2 fluorescens, når cellerne er stimulere...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃŽÂ³R Cross-linking at JoVE.com

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃƒÅ½Ã‚Â³R Cross-linking

Denne undersøgelse viser brugen af flowcytometri at opdage reaktive ilt arter (ROS) produktion som følge af aktivering af FcγR. Denne metode kan bruges til at vurdere ændringer i antimikrobielle og redox signalering funktion af fagocytter reaktion på immunkomplekser, opsonized mikroorganismer eller direkte FcγR cross-linking.

Cytometric flowmåling af ROS produktion i makrofager i svar til FcγR tværbinding

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...

Måling af reaktive iltarter eller ROS er notorisk problematisk. I denne video vil vi demonstrere den reproducerbare måling af ROS som reaktion på FC-gamma receptor crosslinking ved hjælp af fluorescerende sonder og flow cytometri. De vigtigste fordele ved denne teknik er analysens reproducerbarhed og anvendelsen af denne metode med specifikke antigene stimuli, ikke kun mitogener eller kendte ROS-inducerer.Dysregulated ROS produktion er centralt for udviklingen af mange sygdomme som kronisk granulomatøs sygdom eller CGD. Nøjagtig måling af ROS kan udgøre en del af den molekylære diagnose af CGD. Studere FC-medieret ROS produktion er vigtigt at studere immundefekter, såsom CGD, men også i at studere auto-immune sygdomme, eller neurodegenerative sygdomme, hvor for meget ROS fører til oxidativ stress og inflammation.Timingen af analysen er kritisk. Jeg vil råde nogen forsøger denne protokol for første gang at forberede grundigt og gøre en mock eksperiment, hvis det er muligt. Visuel demonstration af denne metode er kritisk for at understrege de trin i analysen, som kræver særlig opmærksomhed, såsom tidspunktet for analysen.Til at begynde med skal du forberede knoglemarvsafledte makrofager ved hjælp af betingede medier som beskrevet i den medfølgende tekstprotokol. Efter priming makrofagerne natten over, aspirere supernatant og vask cellerne én gang med PBS. Serum sulter cellerne ved at erstatte medier med samme volumen af DMEM med lavt serum.For hver mus, vil en plade blive behandlet med anti-BSA IgG1 mens serum sulter, mens den anden vil blive efterladt ubehandlet. Dmem med lavt serum til de ubehandlede plader tilsættes kun med lavt serum OG DMEM med lavt serum, der indeholder 2,5 mikrogram pr. milliliter murinanti-BSA IgG1, til de behandlede plader. Sørg for at inkludere en ekstra ubehandlet plade for hvert eksperiment for at fungere som flow cytometrisk kompensationskontrol.Inkuber pladerne fire timer ved 37 grader Celsius, 5% CO2. Under den fire timer lange inkubation klargøres en 2X-opløsning af de reaktive iltarterssonder. For hver 10 milliliter DMEM med lavt serum tilsættes fire mikroliter af et oxidativt stressdetektionsreage og fire mikroliter af et superoxiddetektionsreage.Derefter forberedes de 2X-sondeopløsninger, der kun indeholder det oxidative stressdetektionsreage, eller som kun indeholder superoxiddetektionsreage. Efter fire timers inkubation høstes cellerne ved forsigtigt at skrabe pladerne og samle dem i mærkede, fem milliliter rundbundede rør. Centrifuge rørene ved 750 gange g i fem minutter.Sørg for at holde styr på, hvilke celler der blev behandlet med murine anti-BSA IgG1. Dernæst vaskes cellepillerne med to milliliter PBS for at slippe af med eventuelle resterende anti-BSA fra de behandlede celler. Centrifuge rørene ved 750 gange g i fem minutter.Derefter aspirere PBS og resuspend cell pellet i 600 mikroliter af lav-serum DMEM. Fra 600-mikroliter celle suspension, aliquot 200 mikroliter i præmærket fem-milliliter rundbundet rør. Fra de ubehandlede celler, tage 200 mikroliter til rørene mærket usstimuleret, 200 mikroliter til rørene mærket positiv inducer, og 200 mikroliter til rørene mærket positiv inducer plus inhibitor.Derefter, fra anti-BSA IgG1 behandlede celler, tage 200 mikroliter til rør mærket FC-gamma receptor crosslinking, og 200 mikroliter for rør mærket FC-gamma receptor crosslinking plus inhibitor. Fra de ubehandlede celler, der skal anvendes til kompensationskontrol, skal du tage 200 mikroliter til røret mærket uhæmmet, 200 mikroliter til den grønne plus inducer kontrol, og 200 mikroliter for orange plus inducer kontrol. Der forbered en 2X positiv induceropløsning ved at fortynde pyocyaninen 1 til 100 i hver af 2X sondeopløsningerne til en koncentration på 500 mikromolar.Derefter forberedes en 2X BSA-opløsning ved at fortynde BSA-stamopløsningen i 2X-sondeopløsningen for at opnå en 2X koncentration på to mikrogram pr. milliliter. Før du starter den specifikke stimulation, såsom FC-gamma receptor crosslinking, skal du sørge for, at alle reagenser og celler er klar og placere rørene på is i den rækkefølge, de vil blive stimuleret. For flow cytometre med en autosampler, skal du være opmærksom på den tid, cytometer tager at analysere en prøve og gå videre til den næste.Sørg for at inkludere eventuelle blandings- og sondevasketrin. Timing er meget kritisk for denne analyse. For at hver tilstand skal være godt kontrolleret, stimulering skal udføres i præcis 30 minutter for hver tilstand.Stimulere cellerne i orden og indarbejde forsinkelsestiden mellem prøveopkøb ved flowcytometeret. Hvis der udføres manuel kompensation på dette tidspunkt, skal der anvendes kontrolrør til kompensation ved at tilsætte 200 mikroliter af 2X-sondeopløsningen, der indeholder oxidativt stressdetektionsreagese og induceren, i rørene mærket grøn plus inducer. Derefter tilsættes 200 mikroliter 2X sondeopløsning, der indeholder superoxiddetektionsreagesen og induceren, i rørene mærket orange plus inducer.Inkuber cellerne i 30 minutter i mørke. Brug flow cytometri software, generere og mærke tre prøve filer til kontrol, unstained, ubehandlet, den grønne plus inducer, og den orange plus inducer prøver, og sørg for at angive de kanaler og parametre, der skal analyseres. Indtast også de ønskede stopbetingelser.Når kontrolprøverne er oprettet, genereres og mærkes et lignende sæt filer til forsøgsprøverne. Kør den uhæmmede, ubehandlede prøve. Åbn et punktdiagram for fremadspred på X-aksen versus side scatter på Y-aksen, og tegn en port rundt om de celler af interesse, eksklusive døde celler og snavs.Brug derefter cellens port til at åbne et andet punktplot af den første fluorescensmarkør, FL1, på X-aksen, versus den anden fluorescensmarkør, FL2, på Y-aksen. Tegn en indledende kvadrantport, og juster derefter kvadrantporten, så hændelserne vises på nederste venstre kvadrant af FL1 versus FL2-plottet. Når du er færdig, skal du køre den grønne plus inducer prøve.Juster spændingen, så hændelserne vises nederst til venstre og højre kvadranter af FL1 versus FL2 plottet. Anvend derefter denne kompensationsmatrix på alle tre eksempelfiler. Kør nu den orange plus inducer prøve.Juster spændingen, så hændelserne vises på den øvre og nedre venstre kvadranter af FL1 versus FL2 plottet, derefter anvende denne kompensation matrix til alle tre prøvefiler. Kontroller hver kompensation fil og sikre, at uhæmmet, ubehandlede begivenheder vises på nederste venstre kvadrant, den grønne plus inducer begivenheder vises på nederste venstre og højre kvadranter, og den orange plus inducer begivenheder vises på den øverste og nederste venstre kvadranter af FL1 versus FL2 plot. Anvend derefter kompensationsmatrixen på alle forsøgseksepelfilerne.Når der er foretaget manuel kompensation, og der er opnået en forsøgsskabelon, skal du gå videre til forsøgsprøverne. Før behandling af cellerne med en positiv inducer eller gennemføre FC-gamma receptor celle stimulation, mærke, hvilke rør vil få en ROS-hæmmer. Disse celler behandles med ROS-hæmmeren mindst 30 minutter før den positive inducer- eller FC-gammareceptorstimulation ved at tilsætte en mikroliter af inhibitoren til 200 mikroliter af resuspenderede celler for en endelig koncentration på fem millimolar.For ustimulerede celler behandles cellerne med 200 mikroliter af 2X-sondeopløsningen uden stimulustilsat til de 200 mikroliter af celleaffjedring mærket farves, ustimuleret. Ved positive kontroller behandles cellerne med 200 mikroliter af 2X positiv induceropløsning til 200 mikroliter cellesuspension, der er mærket positiv inducer eller positiv inducer plus inhibitor. Endelig, for celler stimuleret af FC-gamma receptor crosslinking, behandle dem med 200 mikroliter af 2X BSA opløsning tilsat 200 mikroliter af cellen suspension mærket FC-gamma receptor crosslinking eller FC-gamma receptor crosslinking plus inhibitor.Inkuber cellerne i 30 minutter i mørke. Efter inkubationen analyseres prøverne i den rækkefølge, de blev stimuleret i, ved hjælp af flowcytometeret og de analyseskabeloner, der blev genereret under de indledende kompensationstrin. De data, der vises her, viser flowcytometrisk detektion af reaktiv iltarters produktion som følge af stimulering af makrofager gennem FC-gammareceptoren.Der er en markant stigning i FL1 og FL2 fluorescens, når celler stimuleres med FC-gamma receptor crosslinking agent. Når celler blev behandlet med den reaktive ilt arter hæmmer før FC-gamma receptor crosslinking, denne øgede fluorescens er bragt tilbage til basalniveauer. I modsætning hertil udgør disse punktceller et mislykket eksperiment, hvor der blev observeret en produktion af suboptimale reaktive iltarter som følge af FC-gammareceptorstimulation.For at fremhæve de store forskelle mellem de forventede procenter, eller MFI stiger, viser disse data, hvilke prøver med en minimal stigning i FL1 og FL2 fluorescens ser ud. Den nuværende protokol udnytter en 24-timers priming trin. Når man sammenligner en 24-timers versus en 48-timers priming tid, var der ingen markant forskel i procentdelen af celler positive for den grønne oxidative stress reagens.Men, øge priming tid til 48 timer gjorde øge procentdelen af celler positive for den orange fluorescens. De vigtigste ting at huske, når de udfører denne procedure er planlægning forude, og være konsekvent om timingen af analysen for at få reproducerbare resultater.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Analyse af opløsningsmidlet Tilgængelighed af cysteinrester på<em&gt; Majs rayado fino virus</em&gt; Virus-lignende partikler produceret i<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; Planter og tværbinding af peptider til VLP&#39;er

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Brug af RNA-interferens Undersøge Innate immunresponset i musemakrofager

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

A Simple flowcytometriske metode til at måle glukoseoptagelse og Glucose Transporter Udtryk for Monocyt undergrupper i fuldblod

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometri af partikelbundet Bet v 1 Allergen i PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flowcytometrisk analyse of Natural Killer Cell lytisk aktivitet i humant fuldblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolering af Salmonella typhimurium-indeholdende Phagosomes fra makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation og In Vitro kultur af Murine og menneskelige alveolær makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Flow cytometrisk analyse af lymfocyt infiltration i centralnervesystemet under eksperimentel autoimmun encephalomyelitis

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...