Name: flow cytometric measurement of ros production in macrophages in response to fc&#947;r cross-linking
Uploaded: 2019-03-07T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃŽÂ³R Cross-linking at JoVE.com

De auteurs bedank andere leden van de Tigno-Aranjuez Lab waaronder Madelyn H. Miller, Omar Cardona, Andjie Jeudy en Roopin Singh voor hun hulp bij het laboratorium onderhoud en muis onderhoud van de kolonie. Steun voor dit onderzoek werd voorzien door grant R00 HL122365 en Start-up middelen naar J.T.T-A.

Het protocol voor het verwerken van dieren werd goedgekeurd door de institutionele Animal Care en gebruik Comité (IACUC) van het University of Central Florida.
1. generatie van beenmerg afgeleid macrofagen (BMDMs)
<ol><li>
Bereiding van de voedingsbodems
	<ol>
<li>D10F base media bereiden: aan de Dulbecco bewerkt Eagle Medium (DMEM), voeg toe 10% warmte geïnactiveerd foetale runderserum (FBS), 1 mM natrium pyruvaat, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic zuur ...

<ol>
	<li>Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+Oxygen+Species+and+Neutrophil+Function.">Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).</li><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress.">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).</li><li>Robinson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+in+phagocytic+leukocytes.">Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).</li><li>Thomas, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phagocyte+respiratory+burst:+Historical+perspectives+and+recent+advances.">The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances.</a> Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).</li><li>Fang, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+actions+of+reactive+oxygen+species.">Antimicrobial actions of reactive oxygen species.</a> MBio. 2 (5), (2011).</li><li>Iles, K. E., Forman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+signaling+and+respiratory+burst.">Macrophage signaling and respiratory burst.</a> Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).</li><li>Curnutte, J. T., Whitten, D. M., Babior, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+superoxide+production+by+granulocytes+from+patients+with+chronic+granulomatous+disease.">Defective superoxide production by granulocytes from patients with chronic granulomatous disease.</a> New England Journal of Medicine. 290 (11), 593-597 (1974).</li><li>Good, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatal+(chronic)+granulomatous+disease+of+childhood:+a+hereditary+defect+of+leukocyte+function.">Fatal (chronic) granulomatous disease of childhood: a hereditary defect of leukocyte function.</a> Seminars in Hematology. 5 (3), 215-254 (1968).</li><li>Holmes, B., Page, A. R., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+the+metabolic+activity+of+leukocytes+from+patients+with+a+genetic+abnormality+of+phagocytic+function.">Studies of the metabolic activity of leukocytes from patients with a genetic abnormality of phagocytic function.</a> Journal of Clinical Investigation. 46 (9), 1422-1432 (1967).</li><li>Windhorst, D. B., Page, A. R., Holmes, B., Quie, P. G., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pattern+of+genetic+transmission+of+the+leukocyte+defect+in+fatal+granulomatous+disease+of+childhood.">The pattern of genetic transmission of the leukocyte defect in fatal granulomatous disease of childhood.</a> Journal of Clinical Investigation. 47 (5), 1026-1034 (1968).</li><li>Dikalov, S. I., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species.">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).</li><li>Held, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Reactive+Oxygen+Species:+Measurement+of+ROS+in+cells.">An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in cells.</a> White Paper. , (2015).</li><li>Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+reactive+oxygen+species+measurement+in+biological+systems.">Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).</li><li>Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2',7'-Dichlorodihydrofluorescein+as+a+fluorescent+probe+for+reactive+oxygen+species+measurement:+Forty+years+of+application+and+controversy.">2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy.</a> Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).</li><li>Zielonka, J., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroethidine-+and+MitoSOX-derived+red+fluorescence+is+not+a+reliable+indicator+of+intracellular+superoxide+formation:+another+inconvenient+truth.">Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).</li><li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification+and+labeling+of+mouse+bone+marrow+neutrophils+for+functional+studies+and+adoptive+transfer+experiments.">Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).</li></ol>

DCFH2-DA- en DHE gebaseerde detectie van ROS is een veel gebruikte techniek14,15. Gebruiksgemak en het aanpassingsvermogen van deze ROS sondes voor kinetische microplate formaten, fluorescentie microscopie of stroom cytometrische analyse heeft bijgedragen tot hun populariteit. Echter in onze studies FcγR-gemedieerde macrofaag functies lijkt er niet te worden een standaardprotocol voor het uitvoeren van deze test voor flow cytometrische analyse FcγR k...

Reactieve zuurstof soorten (ROS) zijn reactieve moleculen of vrije radicalen die een van aërobe ademhaling bijproduct (herzien in 1). Het gaat hierbij om de superoxide anion, peroxide, waterstofperoxide, hydroxyl radicaal en hydroxyl ionen, onder anderen. In normale fysiologische omstandigheden ROS worden vooral door de mitochondriën en nicotinamide adenine dinucleotide-fosfaat (NADPH) oxidasen geproduceerd en zijn snel door verschillende enzymen en eiwitten zoals superoxide dismutase en glutathion voorkomt. Een overdreven productie van ROS of een defect in de mogelijkheid om te verwijderen van ROS kan resulteren in oxidatieve stress, waarbij reactieve zuurstof soorten bevorderen de schade van eiwitten, lipiden en DNA leidt tot cellulaire stress of dood en pathologische ziekte staten. Echter is het op dit moment gewaardeerd dat ROS ook als signalering moleculen (redox signalering fungeren kan) en ROS-gemedieerde wijziging van verschillende moleculen en traject tussenproducten cellulaire metabolisme, proliferatie, overleving, inflammatoire beïnvloeden kan signalering en veroudering van2. In fagocytische cellen speelt ROS een essentiële rol bij het verstrekken van antimicrobiële activiteit tijdens de zogenaamde "respiratoire burst"1,3,4,5,6. Tijdens de reactie van fagocyten op externe prikkels translocate onderdelen van de NADPH oxidase complexe (p40phox, p47phox, p67phox) van het cytosol aan de phagosomal membraan met de gp91phox en p22phox subeenheden, en samen met de acties van Rac1/2, vormen een volledig functionele NADPH oxidase enzym complex. De geassembleerde NADPH oxidase maakt vervolgens gebruik van NADPH ter vermindering van zuurstof tot een superoxide binnen de phagosomal vacuole. Superoxide anionen kunnen direct schade veroorzaken of worden dismutated in waterstofperoxide. Zowel superoxide en waterstofperoxide kunnen reageren met andere moleculen voor het genereren van zeer reactieve hydroxyl radicalen. Schade is bemiddeld door reactie van deze ROS met ijzer-zwavel clusters op eiwitten of door het veroorzaken van base oxidatie van DNA, uiteindelijk leidde tot beperkte microbiële metabolisme of dood van de microbe5. Het belang van het NADPH oxidase enzym complex en ROS geproduceerd tijdens de respiratoire burst wordt klinisch geïllustreerd in patiënten met chronische granulomateuze ziekte (CGD)7,8,9, 10. personen met CGD bezitten mutaties in gp91phox, wat resulteert in een gebrek aan ROS productie en gevoeligheid voor terugkerende infecties met bacteriën en schimmels die meestal niet een punt van zorg met immunocompetent individuen zijn. Daarom, of studeren oxidatieve stress, redox signalering of host defense, in staat zijn om te meten ROS productie in real time is een nuttig inspanning.
Meerdere testen hebben gebruikt maatregel ROS productie of de resultaten van oxidatieve stress11,12,13. Daaronder is een van de meest gebruikte de fluorescerende sonde 2', 7' dichlorodihydrofluorescein DIACETAAT (DCFH2-DA)14. Dit molecuul is kleurloos en lipofiele. Verspreiding van DCFH2-DA tussen de celmembranen kan hij worden opgevolgd door intracellulaire esterasen, die het deacetylates in DCFH2, waardoor zij cel ondoordringbare. De acties van meerdere soorten ROS (waterstofperoxide, peroxynitriet hydroxyl radicalen, stikstofmonoxide en peroxy radicalen) op DCFH2 het oxideren in DCF dat tl is (gerapporteerde Ex / Em: 485-500 nm/515-530 nm) en kan worden opgespoord met behulp van een stroom cytometer uitgerust met een standaard filter instellen voor fluoresceïne (FL1 kanaal). Superoxide niet sterk reageert met DCFH2 maar met een andere sonde dihydroethidium (DHE) opbrengst van de fluorescerende product 2-hydroxyethidium (evenals andere producten van fluorescerende superoxide-onafhankelijke oxidatie)15kan reageren. De fluorescerende producten van DHE oxidatie kunnen worden opgespoord met behulp van een golflengte van de excitatie van 518 nm en een golflengte van de emissie van 605 nm (FL2 kanaal). Hoewel het relatief eenvoudig te gebruiken, vereist gebruik van deze sondes voor detectie van ROS kennis van hun beperkingen en zorgvuldige opneming van kleuring procedures en controles in de specifieke bepaling wordt uitgevoerd om geldige experimentele resultaten en conclusies. Het volgende protocol demonstreert het gebruik van een commercieel beschikbare kit deze 2 sondes voor het meten van ROS ontworpen door stroom cytometry in dienst. We primer beenmerg-afgeleide macrofagen vlek met deze sondes en veroorzaken ROS productie via het FcγR dwarsbinding. Wij presenteren representatieve gegevens verkregen met behulp van dit protocol en wijzen passende voorzorgsmaatregelen die moeten worden ondernomen voor succesvolle experimenten.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:623px;" width="623">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-BSA IgG1</td>
			<td style="width:121px;">Innovative Research</td>
			<td style="width:119px;">IBSA9E2C2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-mouse CD16/32</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:121px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">565853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">123108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647&#160;</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">101218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">beta-mercaptoethanol (BME)</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M3148-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">C57BL/6J&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Jackson labs</td>
			<td>Stock No.000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CM-H2DCFDA</td>
			<td style="width:121px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">C6827</td>
			<td>Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dihydroethidium (DHE)</td>
			<td style="width:121px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">D11347</td>
			<td>Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM 1x</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM no phenol red</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31053-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMF Anhydrous&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">61094-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FITC Rat IgG2a, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L glutamine</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LADMAC cells</td>
			<td style="width:121px;">ATCC</td>
			<td>CRL-2420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MEM</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mouse IFN-g</td>
			<td style="width:121px;">GoldBio</td>
			<td style="width:119px;">1360-06-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td style="width:121px;">EMD Milipore</td>
			<td style="width:119px;">106425</td>
			<td>Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Novocyte flow cytometer with autosampler</td>
			<td style="width:121px;">Acea</td>
			<td style="width:119px;">2060R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pyocyanin (ROS inducer)</td>
			<td style="width:121px;">Cayman chemical</td>
			<td style="width:119px;">10009594</td>
			<td>Can be a substitute for inducer in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ROS-ID total ROS/superoxide detection kit</td>
			<td style="width:121px;">ENZO</td>
			<td style="width:119px;">ENZ-51010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium pyruvate (100mM)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric measurement of ros production in macrophages in response to fc&#947;r cross-linking

De oxidatieve of luchtwegen burst wordt gebruikt om te beschrijven de snelle consumptie van zuurstof en generatie van reactieve zuurstof soorten (ROS) door fagocyten in reactie op verschillende stimuli van immuun. ROS gegenereerd tijdens immuunactivatie oefent krachtige antibacteriële activiteit voornamelijk via het vermogen van ROS schade van DNA en eiwitten, die dood van micro-organismen veroorzaakt. Zijnde kundig voor meten van ROS productie reproducibly en met gemak is noodzakelijk teneinde de bijdrage van de verschillende trajecten en moleculen om dit mechanisme van verdediging van de gastheer. In deze paper, wij tonen het gebruik van fluorescerend sondes en stroom cytometry om te detecteren ROS productie. Hoewel het op grote schaal gebruikt, is fluorescerende meting van ROS notoir problematisch, vooral met betrekking tot de meting van ROS geïnduceerd door specifieke en niet mitogene stimuli. Presenteren we een gedetailleerde methodologie voor het detecteren van ROS gegenereerd naar aanleiding van specifieke FcγR stimulatie beginnen met macrofaag generatie, priming, kleuring, FcγR dwarsbinding en eindigend met flow cytometrische analyse.

Met behulp van het protocol beschreven binnen, presenteren we representatieve gegevens aan stroom cytometrische detectie van ROS productie als gevolg van stimulering van WT C57BL/6J BMDMs door de FcγR te tonen. Zoals verwacht, we waarnemen minimale wijzigingen in FL1 of FL2 fluorescentie boven het niveau van de achtergrond in ongestimuleerde cellen (figuur 3A, vergelijk "gebeitst, ongestimuleerde" vs "onbevlekt, ongestimuleerde" dot percelen). We constateren een aanzienlijke toename in FL1 ...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃŽÂ³R Cross-linking at JoVE.com

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃƒÅ½Ã‚Â³R Cross-linking

Deze studie toont aan dat het gebruik van stroom cytometry te detecteren van reactieve zuurstof soorten (ROS) productie als gevolg van de activering van de FcγR. Deze methode kan worden gebruikt om te beoordelen van veranderingen in de antimicrobiële en redox signaalfunctie van fagocyten in reactie op immuuncomplexen, opsonized micro-organismen of directe FcγR dwarsbinding.

Cytometrische Stroommeting van ROS productie In macrofagen In reactie op FcγR dwarsbinding

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...

Meting van reactieve zuurstofsoorten of ROS is berucht problematisch. In deze video zullen we de reproduceerbare meting van ROS demonstreren in reactie op FC-gamma receptor crosslinking met behulp van fluorescerende sondes en flow cytometrie. De belangrijkste voordelen van deze techniek zijn de reproduceerbaarheid van de test en het gebruik van deze methode met specifieke antigene stimuli, niet alleen mitogenen of bekende ROS-inducers.Gedysregeerde ROS-productie staat centraal in de ontwikkeling van vele ziekten zoals chronische granulomateuze ziekte of CGD. Het nauwkeurig meten van ROS kan een deel van de moleculaire diagnose van CGD vormen. Het bestuderen van FC-gemedieerde ROS-productie is belangrijk bij het bestuderen van immunodeficiëntie, zoals CGD, maar ook bij het bestuderen van auto-immuunziekten, of neurodegeneratieve ziekten, waarbij te veel ROS leidt tot oxidatieve stress en ontsteking.De timing van de test is van cruciaal belang. Ik zou iemand adviseren proberen dit protocol voor de eerste keer grondig voor te bereiden en doen een mock experiment indien mogelijk. Visuele demonstratie van deze methode is van cruciaal belang om de stappen van de test die bijzondere aandacht nodig hebben, zoals de timing van de test te benadrukken.Om te beginnen, bereid beenmerg-afgeleide macrofagen met behulp van geconditioneerde media zoals beschreven in de begeleidende tekst protocol. Na het priming van de macrofagen 's nachts, aspirate de supernatant en was de cellen een keer met PBS. Serum verhongeren de cellen door het vervangen van media met hetzelfde volume van low-serum DMEM.Voor elke muis wordt de ene plaat behandeld met anti-BSA IgG1 terwijl serum honger, terwijl de andere onbehandeld blijft. Voeg alleen low-serum DMEM toe aan de onbehandelde platen en voeg low-serum DMEM met 2,5 microgram per milliliter murine anti-BSA IgG1 toe aan de behandelde platen. Zorg ervoor dat u een extra onbehandelde plaat voor elk experiment op te nemen om te fungeren als de stroom cytometrische compensatie controle.Incubeer de platen vier uur bij 37 graden Celsius, 5%CO2. Bereid tijdens de incubatie van vier uur een 2X-oplossing voor van de reactieve zuurstofsoortensondes. Voor elke 10 milliliter van low-serum DMEM nodig, voeg vier microliters van een oxidatieve stress detectie reagens en vier microliters van een superoxide detectie reagens.Bereid vervolgens de 2X-sondeoplossingen voor die alleen het oxidatieve stressdetectiereagens bevatten of dat alleen het superoxidedetectiereagens bevatten. Na de incubatie van vier uur, oogst de cellen door de platen voorzichtig te schrapen, ze te verzamelen in gelabelde, vijf milliliter buizen met ronde bodem. Centrifugeren de buizen op 750 keer g gedurende vijf minuten.Zorg ervoor dat u bijhouden welke cellen werden behandeld met murine anti-BSA IgG1. Was vervolgens de celpellets met twee milliliter PBS om zich te ontdoen van eventuele resterende anti-BSA uit de behandelde cellen. Centrifugeren de buizen op 750 keer g gedurende vijf minuten.Vervolgens, aspirate de PBS en resuspend de cel pellet in 600 microliters van low-serum DMEM. Van de 600-microliter cel suspensie, aliquot 200 microliters in de vooraf gelabelde vijf-milliliter ronde bodem buizen. Neem van de onbehandelde cellen 200 microliter voor de buizen met het label ongeprikkeld, 200 microliters voor de buizen met het label positieve inducer en 200 microliter voor de buizen met het label positieve inducer plus remmer.Neem vervolgens 200 microliter van de anti-BSA IgG1 behandelde cellen voor buizen met het label FC-gamma receptor crosslinking en 200 microliters voor buizen met het label FC-gamma receptor crosslinking plus inhibitor. Neem van de onbehandelde cellen voor compensatiecontroles 200 microliters voor de buis met het label onbevlekt onbevlekt, 200 microliter voor de groene plus inducercontrole en 200 microliter voor oranje plus inducerende controle. Bereid een 2x positieve inducer oplossing door het verdunnen van de pyocyanine een tot 100 in elk van de 2X sonde oplossingen om een concentratie van 500 micromolar.Bereid vervolgens een 2X BSA-oplossing voor door de BSA-voorraadoplossing in de 2X-sondeoplossing te verdunnen om een 2X-concentratie van twee microgram per milliliter te verkrijgen. Voordat u begint met de specifieke stimulatie, zoals FC-gamma receptor crosslinking, zorg ervoor dat alle reagentia en cellen klaar zijn en plaats de buizen op ijs in de volgorde waarin ze zullen worden gestimuleerd. Voor stroomcytometers met een autosampler, rekening te houden met de tijd die de cytometer duurt om een monster te analyseren en verder te gaan naar de volgende.Zorg ervoor dat u alle meng- en sondewasstappen opneemt. Timing is zeer cruciaal voor deze test. Om elke conditie goed te kunnen controleren, moet de stimulatie in precies 30 minuten voor elke aandoening worden uitgevoerd.Stimuleer de cellen in orde en neem de vertragingstijd tussen monsteracquisities door de stroomcytometer. Als het uitvoeren van handmatige compensatie op dit punt, stimuleren controlebuizen worden gebruikt voor compensatie door het toevoegen van 200 microliters van de 2X sonde oplossing met de oxidatieve stress detectie reagens en de inducer in de buizen gemarkeerd groene plus inducer. Voeg vervolgens 200 microliters 2x sondeoplossing toe met het superoxidedetectiereagens en de inductor in de buizen gemarkeerd oranje plus inductor.Broed de cellen 30 minuten in het donker uit. Met behulp van de stroom cytometrie software, genereren en labelen van drie monsterbestanden voor de controle, onbevlekt, onbehandeld, de groene plus inducer, en de oranje plus inducer monsters, ervoor te zorgen om de kanalen en parameters te analyseren aan te geven. Voer ook de gewenste stopomstandigheden in.Zodra de controlemonsters zijn ingesteld, genereren en labelen een soortgelijke set bestanden voor de experimentele monsters. Voer nu het onbevlekte, onbehandelde monster uit. Open een stipplot voor voorwaartse spreiding op de X-as versus zijverstrooiing op de Y-as en teken een poort rond de cellen van belang, met uitzondering van dode cellen en puin.Gebruik vervolgens de poort van deze cel om een andere puntplot van de eerste fluorescentiemarkering, FL1, op de X-as te openen, versus de tweede fluorescentiemarkering, FL2, op de Y-as. Teken een eerste kwadrantpoort en pas vervolgens de kwadrantpoort aan, zodat de gebeurtenissen in het kwadrant linksonder van het FL1 versus FL2-plot worden weergegeven. Voer het groene plus inducermonster uit als u klaar bent.Pas de spanning zo aan dat de gebeurtenissen worden weergegeven in de kwadranten linksonder en rechts van het FL1 versus FL2-plot. Pas vervolgens deze compensatiematrix toe op alle drie de voorbeeldbestanden. Nu, voer de oranje plus inducer monster.Pas de spanning zo aan dat de gebeurtenissen worden weergegeven in de kwadranten boven en linksonder van de FL1 versus FL2-plot en pas deze compensatiematrix toe op alle drie de voorbeeldbestanden. Controleer elk compensatiebestand en zorg ervoor dat onbevlekte, onbehandelde gebeurtenissen verschijnen op het kwadrant linksonder, de groene plus inducergebeurtenissen verschijnen op de kwadranten linksonder en rechtsonder en de oranje plus inducergebeurtenissen op de kwadranten linksboven en linksonder van het FL1 versus FL2-plot. Pas vervolgens de compensatiematrix toe op alle experimentele voorbeeldbestanden.Zodra handmatige compensatie is uitgevoerd en een experimentele sjabloon is verkregen, gaat u verder met de experimentele monsters. Voor de behandeling van de cellen met een positieve inducer of het uitvoeren van FC-gamma receptor cel stimulatie, merk welke buizen een ROS-remmer krijgen. Behandel deze cellen met de ROS-remmer ten minste 30 minuten voorafgaand aan de positieve inducer of FC-gamma receptor stimulatie door het toevoegen van een microliter van de remmer tot 200 microliter van opnieuw opgesuspend cellen voor een definitieve concentratie van vijf millimolar.Voor niet-gestimuleerde cellen, behandel de cellen met 200 microliters van de 2X sonde oplossing zonder enige stimulans toegevoegd aan de 200 microliters van cel suspensie gelabeld gekleurd, ongestimuleerd. Voor positieve controles, behandel de cellen met 200 microliters van de 2X positieve inducer oplossing tot 200 microliter van celsuspensie gelabeld positieve inducer of positieve inducer plus remmer. Ten slotte, voor cellen gestimuleerd door FC-gamma receptor crosslinking, behandel ze met 200 microliters van de 2X BSA oplossing toegevoegd aan 200 microliters van de cel ophanging gelabeld FC-gamma receptor crosslinking of FC-gamma receptor crosslinking plus remmer.Broed de cellen 30 minuten in het donker uit. Na incubatie analyseren de monsters in de volgorde waarin ze werden gestimuleerd, met behulp van de stroomcytometer en de analyse sjablonen gegenereerd tijdens de eerste compensatie stappen. De hier getoonde gegevens tonen de stroom cytometrische detectie van reactieve zuurstof soorten productie als gevolg van stimulatie van macrofagen door de FC-gamma receptor.Er is een duidelijke toename van FL1 en FL2 fluorescentie wanneer cellen worden gestimuleerd met FC-gamma receptor crosslinking agent. Wanneer cellen werden behandeld met de reactieve zuurstofsoorten remmer voorafgaand aan FC-gamma receptor crosslinking, deze verhoogde fluorescentie wordt teruggebracht naar basale niveaus. Deze stippercelen daarentegen vormen een mislukt experiment, waarbij suboptimale reactieve zuurstofsoortenproductie als gevolg van FC-gammareceptorstimulatie werd waargenomen.Om de grote verschillen tussen de verwachte percentages of MFI-verhogingen te benadrukken, laat deze gegevens zien hoe monsters met een minimale toename van FL1 en FL2-fluorescentie eruit zien. Het huidige protocol maakt gebruik van een 24-uurs priming stap. Bij het vergelijken van een 24-uurs versus een 48-uurs primingstijd, was er geen duidelijk verschil in het percentage cellen positief voor de groene oxidatieve stress reagens.Echter, het verhogen van de priming tijd tot 48 uur deed verhogen het percentage van de cellen positief voor de oranje fluorescentie. De belangrijkste dingen om te onthouden bij het uitvoeren van deze procedure is vooruit plannen, en consequent over de timing van de test om reproduceerbare resultaten te krijgen.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Multicolor Flow Cytometry Analyses van de cellulaire immuunreactie in resusmakaken

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Kwantitatieve meting van de immuunrespons en Sleep in<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Analyse van de Solvent Toegankelijkheid van cysteïneresten op<em&gt; Maïs rayado fino virus</em&gt; Virus-achtige deeltjes, geproduceerd in<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; Plants and Cross-linking van peptiden aan VLP

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Met behulp van RNA-interferentie te onderzoeken de aangeboren immuunrespons in muizenmacrofagen

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Een eenvoudige Flowcytometrische methode om te meten glucose opname en Glucose Transporter Expression voor monocyten subpopulaties in volbloed

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flow cytometrische analyse van deeltjes gebonden Bet v 1 allergeen in PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flow cytometrische analyse van de NK-cel lytische activiteit in humaan volbloed

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolatie van Salmonella typhimurium-met Phagosomes van Macrophages

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolatie en In Vitro cultuur van lymfkliertest en menselijke alveolaire macrofagen

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Flow Cytometrische Analyse van lymfocyten infiltratie in het centrale zenuwstelsel tijdens experimentele auto-immuunenceomyelitis

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...