Name: flow cytometric measurement of ros production in macrophages in response to fc&#947;r cross-linking
Uploaded: 2019-03-07T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃŽÂ³R Cross-linking at JoVE.com

Die Autoren möchten anderen Mitgliedern des Tigno-Aranjuez Labor einschließlich Madelyn H. Miller, Omar Cardona, Andjie Jeudy und Roopin Singh für ihre Hilfe im Labor Unterhalt und Maus Kolonie Wartung danken. Unterstützung für diese Forschung lieferte Grant R00 HL122365 und Startkapital J.T.T-a.

Das Protokoll für den Umgang mit Tieren wurde von der institutionellen Animal Care und Nutzung Ausschuss (IACUC) der University of Central Florida genehmigt.
1. Generation des Knochenmarks abgeleiteten Makrophagen (BMDMs)
<ol><li>
Nährmedien Vorbereitung
	<ol>
<li>Bereiten Sie D10F base Medien: zu Dulbeccos geändert Eagle Medium (DMEM), fügen Sie 10 % Hitze inaktiviert fetalen bovine Serum (FBS), 1 mM Natrium Pyruvat, 10 mM 4--(2-hydroxyethyl)-1-Piperazineethanesulfonic-...

<ol>
	<li>Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+Oxygen+Species+and+Neutrophil+Function.">Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).</li><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress.">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).</li><li>Robinson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+in+phagocytic+leukocytes.">Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).</li><li>Thomas, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phagocyte+respiratory+burst:+Historical+perspectives+and+recent+advances.">The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances.</a> Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).</li><li>Fang, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+actions+of+reactive+oxygen+species.">Antimicrobial actions of reactive oxygen species.</a> MBio. 2 (5), (2011).</li><li>Iles, K. E., Forman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+signaling+and+respiratory+burst.">Macrophage signaling and respiratory burst.</a> Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).</li><li>Curnutte, J. T., Whitten, D. M., Babior, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+superoxide+production+by+granulocytes+from+patients+with+chronic+granulomatous+disease.">Defective superoxide production by granulocytes from patients with chronic granulomatous disease.</a> New England Journal of Medicine. 290 (11), 593-597 (1974).</li><li>Good, R. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species.">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).</li><li>Held, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Reactive+Oxygen+Species:+Measurement+of+ROS+in+cells.">An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in cells.</a> White Paper. , (2015).</li><li>Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+reactive+oxygen+species+measurement+in+biological+systems.">Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).</li><li>Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2',7'-Dichlorodihydrofluorescein+as+a+fluorescent+probe+for+reactive+oxygen+species+measurement:+Forty+years+of+application+and+controversy.">2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy.</a> Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).</li><li>Zielonka, J., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroethidine-+and+MitoSOX-derived+red+fluorescence+is+not+a+reliable+indicator+of+intracellular+superoxide+formation:+another+inconvenient+truth.">Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).</li><li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification+and+labeling+of+mouse+bone+marrow+neutrophils+for+functional+studies+and+adoptive+transfer+experiments.">Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).</li></ol>

RLKV2-DA und DHE-basierte Erkennung von ROS ist eine weit verbreitete Technik14,15. Einfache Bedienung und die Anpassungsfähigkeit der diese ROS-Sonden für kinetische Mikrotestplatte Formate hat Fluoreszenz-Mikroskopie oder Flow durchflusszytometrischen Analyse zu ihrer Beliebtheit beigetragen. Jedoch in unseren Studien FcγR-vermittelten Makrophagen Funktionen schien es kein Standardprotokoll für die Durchführung dieses Assays für durchflusszytom...

Reaktive Sauerstoffspezies (ROS) sind reaktive Moleküle oder freie Radikale, die Nebenprodukte der aeroben Atmung (rezensiert in 1). Dazu gehören die Superoxid-Anion, Wasserstoffperoxid, Wasserstoffperoxid, Hydroxyl-radikal und Hydroxyl-Ionen, unter anderem. Unter normalen physiologischen Bedingungen ROS entstehen vor allem durch die Mitochondrien und Nicotinamid Adenin Dinucleotide Phosphat (NADPH) Oxidasen und werden schnell durch verschiedene Enzyme und Proteine wie Superoxid-Dismutase und Glutathion entgiftet. Eine übertriebene Produktion von ROS oder ein Defekt in der Fähigkeit, ROS entfernen führt zu oxidativem Stress, wobei reaktive Sauerstoffspezies den Schaden der Proteine, Lipide und DNA zu zellulären Stresses oder Tod und pathologischen Krankheitszuständen führen zu fördern. Allerdings ist es derzeit geschätzt, dass ROS kann auch als Signalmoleküle (Redox signaling) fungieren, und ROS-vermittelten Modifikation verschiedener Moleküle und Weg Zwischenprodukte zellulären Stoffwechsel, Vermehrung, überleben, entzündliche beeinflussen Signalisierung und Alterung2. In phagocytic Zellen spielt ROS eine wesentliche Rolle bei der Bereitstellung von antimikrobielle Aktivität während der sogenannten "respiratorischen Burst"1,3,4,5,6. Während die Reaktion der Phagozyten auf äußere Reize translozieren Komponenten von der NADPH-Oxidase Komplex (p40Phox, p47Phox, p67Phox) aus dem Zytosol der phagosomal Membran mit gp91phox und p22phox Untereinheiten, und zusammen mit den Maßnahmen der Rac1/2 bilden eine voll funktionsfähige NADPH Oxidase Enzymkomplex. Die montierten NADPH-Oxidase nutzt dann NADPH um Sauerstoff zu Superoxid innerhalb der phagosomal Vakuole zu reduzieren. Superoxid-Anionen können direkt schädigen oder in Wasserstoffperoxid dismutated werden. Superoxid und Wasserstoffperoxid reagieren mit anderen Molekülen, hochreaktive Hydroxyl-Radikale zu generieren. Schaden wird durch Reaktion von diesen ROS mit Eisen-Schwefel-Clustern auf Proteine oder durch Basis Oxidation von DNA, die letztlich zu beschränkten mikrobiellen Stoffwechsel oder Tod der Mikrobe5vermittelt. Die Bedeutung der NADPH-Oxidase Enzymkomplex und ROS produziert während der respiratorischen Burst zeigt klinisch bei Patienten mit chronisch granulomatöse Erkrankung (CGD)7,8,9, 10. Personen mit CGD besitzen Mutationen im gp91phox, was zu einem Mangel der ROS-Produktion und Anfälligkeit für rezidivierende Infektionen mit Bakterien und Pilzen, die nicht in der Regel ein Anliegen mit immunkompetenten Individuen sind. Deshalb ob oxidativer Stress, Redox signaling oder Host Verteidigung, die Möglichkeit, Messen ROS-Produktion in Echtzeit ein nützliches Unterfangen.
Mehrere Proben wurden an die Maßnahme ROS Produktion oder die Ergebnisse von oxidativem Stress11,12,13genutzt. Unter diesen ist eine der am häufigsten verwendeten fluoreszierenden Sonde 2', 7' Dichlorodihydrofluorescein Diacetat (RLKV2-DA)14. Dieses Molekül ist farblos und lipophil. Diffusion von RLKV2-DA in der Zellmembran ermöglicht es, von intrazellulären Esterasen, einwirken lassen, die es in RLKV2 deacetylates, wodurch es Zelle undurchlässig. Die Aktionen von mehreren Arten von ROS (Wasserstoffperoxid, Peroxynitrit, Hydroxyl-radikale, Stickstoffmonoxid und Peroxy radikale) auf RLKV2 oxidieren es in DCF, fluoreszierende (gemeldeten Ex / Em: 485-500 nm/515-530 nm) und kann eine Strömung erfasst werden CYTOMETER ausgestattet mit einem standard-Filter für Fluorescein (FL1 Kanal) festgelegt. Superoxid reagiert nicht stark mit RLKV2 aber mit einer anderen Sonde Dihydroethidium (DHE) liefern die fluoreszierenden Produkt 2-Hydroxyethidium (sowie andere fluoreszierende Superoxid-unabhängige Oxidationsprodukte)15reagieren kann. Die fluoreszierende Produkte der DHE Oxidation können erkannt werden, mit Hilfe einer Anregung Wellenlänge von 518 nm und einer Emissionswellenlänge von 605 nm (FL2 Kanal). Obwohl relativ einfach zu bedienen, erfordert Nutzung diese Sonden für die Erkennung von ROS wissen über ihre Grenzen und sorgfältige Einarbeitung der Färbung Verfahren und Kontrollen in den spezifischen Assay wird durchgeführt, um gültige experimentelle Ergebnisse und Schlussfolgerungen. Das folgende Protokoll veranschaulicht die Verwendung eines handelsüblichen Kits mit diesen 2 Sonden durch Durchflusszytometrie ROS messen soll. Wir färben grundierte Knochenmark stammenden Makrophagen mit diesen Sonden und ROS-Produktion durch FcγR Vernetzung zu induzieren. Wir präsentieren repräsentative Daten unter Verwendung dieses Protokolls und betonen entsprechende Vorsichtsmaßnahmen, die für erfolgreiche Experimente durchgeführt werden müssen.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:623px;" width="623">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-BSA IgG1</td>
			<td style="width:121px;">Innovative Research</td>
			<td style="width:119px;">IBSA9E2C2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-mouse CD16/32</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:121px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">565853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">123108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647&#160;</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">101218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">beta-mercaptoethanol (BME)</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M3148-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">C57BL/6J&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Jackson labs</td>
			<td>Stock No.000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CM-H2DCFDA</td>
			<td style="width:121px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">C6827</td>
			<td>Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dihydroethidium (DHE)</td>
			<td style="width:121px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">D11347</td>
			<td>Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM 1x</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM no phenol red</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31053-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMF Anhydrous&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">61094-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FITC Rat IgG2a, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L glutamine</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LADMAC cells</td>
			<td style="width:121px;">ATCC</td>
			<td>CRL-2420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MEM</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mouse IFN-g</td>
			<td style="width:121px;">GoldBio</td>
			<td style="width:119px;">1360-06-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td style="width:121px;">EMD Milipore</td>
			<td style="width:119px;">106425</td>
			<td>Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Novocyte flow cytometer with autosampler</td>
			<td style="width:121px;">Acea</td>
			<td style="width:119px;">2060R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pyocyanin (ROS inducer)</td>
			<td style="width:121px;">Cayman chemical</td>
			<td style="width:119px;">10009594</td>
			<td>Can be a substitute for inducer in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ROS-ID total ROS/superoxide detection kit</td>
			<td style="width:121px;">ENZO</td>
			<td style="width:119px;">ENZ-51010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium pyruvate (100mM)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric measurement of ros production in macrophages in response to fc&#947;r cross-linking

Die oxidative oder respiratorische Burst wird verwendet, um den schnellen Verbrauch von Sauerstoff und Generierung von reaktiven Sauerstoffspezies (ROS) beschreiben durch Phagozyten in Reaktion auf verschiedene Reize immun. ROS erzeugt während der Immunaktivierung übt starke antimikrobielle Aktivität vor allem durch die Fähigkeit von ROS, DNA und Proteine, beschädigen Tod von Mikroorganismen verursacht. ROS-Produktion mit Leichtigkeit und reproduzierbar messen ist notwendig, um den Beitrag der verschiedenen Wege und Moleküle zu diesem Mechanismus der Host Verteidigung zu bewerten. In diesem Papier wir zeigen die Verwendung von fluoreszierenden Sonden und flow Cytometry um ROS-Produktion zu erkennen. Obwohl weit verbreitet, wird Fluoreszenz Messung von ROS notorisch problematisch, vor allem im Hinblick auf die Messung von ROS durch spezifische und nicht Mitogene Reize induziert. Wir präsentieren Ihnen eine detaillierte Methode um ROS erzeugt durch spezifische FcγR Stimulation beginnend mit Makrophagen-Generierung, Grundierung, Färbung, FcγR Vernetzung und endend mit durchflusszytometrischen Analyse zu erkennen.

Unter Verwendung des Protokolls in umrissen, präsentieren wir Ihnen repräsentative Daten demonstrieren Fluss durchflusszytometrischen Erkennung der ROS-Produktion durch Stimulation der WT C57BL/6J BMDMs durch die FcγR. Wie erwartet, wir beobachten nur minimale Änderungen im FL1 oder FL2 Fluoreszenz über Hintergrund-Niveaus in unstimulierte Zellen (Abb. 3A, "gebeizt, unstimulierte" Vs "ungefärbten, unstimulierte" Dot Grundstücke zu vergleichen). Wir beobachten eine deutliche Steigerung...

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Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃƒÅ½Ã‚Â³R Cross-linking

Diese Studie zeigt den Einsatz der Durchflusszytometrie, reaktive Sauerstoff Spezies (ROS) Produktion durch Aktivierung der FcγR zu erkennen. Diese Methode kann verwendet werden, Änderungen in der antimikrobiellen und Redox signaling Funktion der Phagozyten in Reaktion auf Immunkomplexe, opsonized Mikroorganismen oder direkte FcγR Vernetzung zu beurteilen.

Durchflusszytometrischen Durchflussmessung von ROS-Produktion In Makrophagen als Reaktion auf FcγR Vernetzung

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...

Die Messung von reaktiven Sauerstoffspezies oder ROS ist notorisch problematisch. In diesem Video zeigen wir die reproduzierbare Messung von ROS als Reaktion auf die FC-Gamma-Rezeptorvernetzung mit Fluoreszenzsonden und Durchflusszytometrie. Die Hauptvorteile dieser Technik sind die Reproduzierbarkeit des Assays und die Verwendung dieser Methode mit spezifischen antigenen Reizen, nicht nur Mitogenen oder bekannten ROS-Induktoren.Dysregulierte ROS-Produktion ist zentral für die Entwicklung vieler Krankheiten wie chronische granulomatäre Krankheit oder CGD. Die genaue Messung von ROS könnte einen Teil der molekularen Diagnose von CGD darstellen. Das Studium der FC-vermittelten ROS-Produktion ist wichtig für die Untersuchung von Immundefekten wie CGD, aber auch bei der Untersuchung von Autoimmunerkrankungen oder neurodegenerativen Erkrankungen, bei denen zu viel ROS zu oxidativem Stress und Entzündungen führt.Der Zeitpunkt des Assays ist entscheidend. Ich würde jemandem raten, dieses Protokoll zum ersten Mal auszuprobieren, um gründlich vorzubereiten und, wenn möglich, ein Scheinexperiment durchzuführen. Die visuelle Demonstration dieser Methode ist entscheidend, um die Schritte des Tests zu betonen, die besondere Aufmerksamkeit erfordern, wie z. B. das Timing des Tests.Bereiten Sie zunächst knochen-marrow-abgeleitete Makrophagen mit konditionierten Medien vor, wie im begleitenden Textprotokoll beschrieben. Nach dem Grundieren der Makrophagen über Nacht, aspirieren Sie den Überstand und waschen Sie die Zellen einmal mit PBS. Serum verhungert die Zellen, indem es Medien durch das gleiche Volumen von DMEM mit niedrigem Serum ersetzt.Für jede Maus wird eine Platte mit Anti-BSA IgG1 behandelt, während Serum verhungert, während die andere unbehandelt bleibt. Fügen Sie den unbehandelten Platten nur dmEM mit niedrigem Serum hinzu und fügen Sie den behandelten Platten DMEM mit einem Niedrigen umserlegen, das 2,5 Mikrogramm pro Milliliter murinem Anti-BSA-IgG1 enthält. Stellen Sie sicher, dass Sie für jedes Experiment eine zusätzliche unbehandelte Platte enthalten, um als zytometrische Kompensationssteuerung der Durchflusszytometrie zu fungieren.Inkubieren Sie die Platten vier Stunden bei 37 Grad Celsius, 5% CO2. Bereiten Sie während der vierstündigen Inkubation eine 2-fache Lösung der reaktiven Sauerstoffsonden vor. Für je 10 Milliliter DMEM mit niedrigem Serum hinzufügen, vier Mikroliter eines oxidativen Stressdemittentones und vier Mikroliter eines Superoxid-Detektionsreagenzes.Bereiten Sie dann die 2X-Sondenlösungen vor, die nur das oxidative Stressdeagenz oder nur das Superoxid-Detektionsreagenz enthalten. Nach der vierstündigen Inkubation ernten Sie die Zellen, indem Sie die Platten vorsichtig kratzen und in beschrifteten, fünf Milliliter runden Röhren sammeln. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 750 mal g für fünf Minuten.Achten Sie darauf, zu verfolgen, welche Zellen mit murinen Anti-BSA IgG1 behandelt wurden. Als nächstes waschen Sie die Zellpellets mit zwei MilliliterPBS, um alle verbleibenden Anti-BSA aus den behandelten Zellen loszuwerden. Zentrifugieren Sie die Rohre bei 750 mal g für fünf Minuten.Dann die PBS ansaugen und das Zellpellet in 600 Mikroliter n-Low-Serum DMEM wieder aufhängen. Von der 600-Mikroliter-Zellsuspension werden 200 Mikroliter in die voretikettierten Fünf-Milliliter-Rundbodenröhren einfließen. Nehmen Sie aus den unbehandelten Zellen 200 Mikroliter für die unstimulierten Röhren, 200 Mikroliter für die als positiv bezeichneten Rohre und 200 Mikroliter für die als positiv bezeichneten Rohre plus Inhibitor.Dann, von den Anti-BSA IgG1 behandelten Zellen, nehmen Sie 200 Mikroliter für Röhren mit der Bezeichnung FC-Gamma-Rezeptor-Vernetzung, und 200 Mikroliter für Röhren mit der Bezeichnung FC-Gamma-Rezeptor-Vernetzung plus Inhibitor. Nehmen Sie aus den unbehandelten Zellen, die für Kompensationskontrollen verwendet werden sollen, 200 Mikroliter für die tube, die ungefärbt unstimuliert markiert ist, 200 Mikroliter für die grüne Plus-Induktor-Kontrolle und 200 Mikroliter für die Orange-Plus-Induktorkontrolle. Bereiten Sie eine 2X positive Induktorlösung vor, indem Sie das Pyocyanin ein bis 100 in jede der 2X-Sondenlösungen auf eine Konzentration von 500 Mikromolar verdünnen.Bereiten Sie dann eine 2X BSA-Lösung vor, indem Sie die BSA-Lagerlösung in der 2X-Sondenlösung verdünnen, um eine 2-fache Konzentration von zwei Mikrogramm pro Milliliter zu erhalten. Bevor Sie mit der spezifischen Stimulation beginnen, wie z. B. FC-Gamma-Rezeptor-Vernetzung, stellen Sie sicher, dass alle Reagenzien und Zellen bereit sind und legen Sie die Röhren in der Reihenfolge auf Eis, in der sie stimuliert werden. Beachten Sie bei Durchflusszytometern mit einem Autosampler die Zeit, die das Zytometer benötigt, um eine Probe zu analysieren, und fahren Sie mit der nächsten fort.Achten Sie darauf, alle Misch- und Sondenwaschschritte einzuschließen. Das Timing ist für diesen Test sehr wichtig. Damit jeder Zustand gut kontrolliert werden kann, muss die Stimulation in genau 30 Minuten für jede Bedingung durchgeführt werden.Stimulieren Sie die Zellen in der Reihenfolge und integrieren Sie die Verzögerungszeit zwischen den Probenerfassungen durch das Durchflusszytometer. Wenn Sie an dieser Stelle eine manuelle Kompensation durchführen, stimulieren Sie die zur Kompensation zu verwendenden Steuerrohre, indem Sie 200 Mikroliter der 2X-Sondenlösung, die das oxidative Spannungsdeagereagenz und den Induktor enthält, in die grün gekennzeichneten Rohre plus Induktor hinzufügen. Fügen Sie dann 200 Mikroliter 2X-Sondenlösung, die das Superoxid-Detektionsreagenz und den Induktor enthält, in die orange plus induktormarkierten Rohre ein.Inkubieren Sie die Zellen für 30 Minuten im Dunkeln. Generieren und beschriften Sie mit der Flow-Zytometrie-Software drei Beispieldateien für die Steuerung, ungefärbt, unbehandelt, den grünen Plus-Induktor und die orangen plus-Induktor-Proben, und stellen Sie sicher, dass die Kanäle und Parameter analysiert werden. Geben Sie auch die gewünschten Stoppbedingungen ein.Nachdem die Kontrollproben eingerichtet wurden, generieren und beschriften Sie einen ähnlichen Satz von Dateien für die experimentellen Proben. Führen Sie nun die ungefärbte, unbehandelte Probe aus. Öffnen Sie ein Punktdiagramm für vorwärts streuen auf der X-Achse versus Seitenstreuung auf der Y-Achse und zeichnen Sie ein Tor um die Interessenszellen, ohne abgestorbene Zellen und Trümmer.Verwenden Sie als Nächstes das Tor dieser Zelle, um ein weiteres Punktdiagramm des ersten Fluoreszenzmarkers FL1 auf der X-Achse im Vergleich zum zweiten Fluoreszenzmarker FL2 auf der Y-Achse zu öffnen. Zeichnen Sie ein erstes Quadrantentor, und passen Sie dann das Quadrantentor so an, dass die Ereignisse auf dem unteren linken Quadranten des FL1-gegen-FL2-Plots angezeigt werden. Führen Sie nach Abschluss der Grünen-Plus-Induktorprobe aus.Passen Sie die Spannung so an, dass die Ereignisse auf den unteren linken und rechten Quadranten des FL1-gegen-FL2-Plots angezeigt werden. Wenden Sie diese Kompensationsmatrix dann auf alle drei Beispieldateien an. Führen Sie nun die Orange Plus Induktorprobe aus.Passen Sie die Spannung so an, dass die Ereignisse auf den oberen und unteren linken Quadranten des FL1-/FL2-Plots angezeigt werden, und wenden Sie diese Kompensationsmatrix dann auf alle drei Beispieldateien an. Überprüfen Sie jede Kompensationsdatei, und stellen Sie sicher, dass ungefärbte, unbehandelte Ereignisse auf dem unteren linken Quadranten, die grünen Plus-Induktorereignisse auf den unteren linken und rechten Quadranten und die orangefarbenen Plus-Induktorereignisse auf den oberen und unteren linken Quadranten des FL1-/FL2-Plots angezeigt werden. Wenden Sie dann die Kompensationsmatrix auf alle experimentellen Beispieldateien an.Sobald eine manuelle Kompensation durchgeführt und eine experimentelle Vorlage erhalten wurde, fahren Sie mit den experimentellen Proben fort. Vor der Behandlung der Zellen mit einem positiven Induktor oder der Durchführung der FC-Gamma-Rezeptor-Zellstimulation markieren Sie, welche Röhren einen ROS-Hemmer erhalten. Behandeln Sie diese Zellen mit dem ROS-Hemmer mindestens 30 Minuten vor dem positiven Induktor oder FC-Gamma-Rezeptor Stimulation durch Zugabe eines Mikroliters des Inhibitors zu 200 Mikroliter resuspendierten Zellen für eine Endkonzentration von fünf Millimolar.Für nicht stimulierte Zellen behandeln Sie die Zellen mit 200 Mikrolitern der 2X-Sondenlösung, ohne dass den 200 Mikrolitern der zellsuspensionmarkierten, unstimulierten Zellsuspension ein Stimulus zugesetzt wird. Für positive Kontrollen, behandeln Sie die Zellen mit 200 Mikroliter der 2X positive Induktorlösung zu 200 Mikroliter n-Zellsuspension markiert positive Induktor oder positive Induktor plus Inhibitor. Schließlich, für Zellen durch FC-Gamma-Rezeptor-Vernetzung stimuliert, behandeln sie mit 200 Mikroliter der 2X BSA-Lösung zu 200 Mikroliter der Zellsuspension mit der Bezeichnung FC-Gamma-Rezeptor-Vernetzung oder FC-Gamma-Rezeptor-Vernetzung plus Inhibitor.Inkubieren Sie die Zellen für 30 Minuten im Dunkeln. Analysieren Sie nach der Inkubation die Proben in der Reihenfolge, in der sie stimuliert wurden, indem Sie das Durchflusszytometer und die Analysevorlagen verwenden, die während der ersten Kompensationsschritte generiert wurden. Die hier gezeigten Daten zeigen den zytometrischen Durchfluss der Produktion reaktiver Sauerstoffspezies, die sich aus der Stimulation von Makrophagen durch den FC-Gamma-Rezeptor ergibt.Es gibt einen deutlichen Anstieg der FL1- und FL2-Fluoreszenz, wenn Zellen mit FC-Gamma-Rezeptor-Vernetzungsmittel stimuliert werden. Wenn Zellen vor der FC-Gamma-Rezeptor-Vernetzung mit dem reaktiven Sauerstoffspezies-Inhibitor behandelt wurden, wird diese erhöhte Fluoreszenz wieder auf Basalspiegel gebracht. Im Gegensatz dazu stellen diese Punktdiagramme ein erfolgloses Experiment dar, bei dem eine suboptimale reaktive Sauerstoffspezies als Ergebnis der FC-Gamma-Rezeptorstimulation beobachtet wurde.Um die großen Unterschiede zwischen den erwarteten Prozentsätzen oder MFI-Erhöhungen hervorzuheben, zeigen diese Daten, wie Stichproben mit einem minimalen Anstieg der FL1- und FL2-Fluoreszenz aussehen. Das aktuelle Protokoll verwendet einen 24-Stunden-Grundierungsschritt. Beim Vergleich einer 24-Stunden-Grundierungszeit von 24 Stunden gab es keinen deutlichen Unterschied im Anteil der Zellen, die für das grüne oxidative Stressreagenz positiv waren.Jedoch, Erhöhung der Grundierzeit auf 48 Stunden hat den Prozentsatz der Zellen positiv für die orange Fluoreszenz erhöht. Die wichtigsten Dinge, die Sie sich bei der Durchführung dieses Verfahrens merken sollten, sind die vorausfahrende Planung und die konsistente Übereinstimmung über den Zeitpunkt des Assays, um reproduzierbare Ergebnisse zu erhalten.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

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Forschung

Immunologie und Infektion

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