Name: flow cytometric measurement of ros production in macrophages in response to fc&#947;r cross-linking
Uploaded: 2019-03-07T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃŽÂ³R Cross-linking at JoVE.com

המחברים רוצה להודות חברים אחרים של המעבדה Tigno-ארנחואס כולל ומדלין ה. מילר, עומר קרדונה, Andjie Jeudy, Roopin סינג על עזרתם בתחזוקת המושבה האחזקה ועכבר מעבדה. תמיכה עבור מחקר זה סופק על ידי גרנט R00 HL122365 וקרנות סטארט-אפ J.T.T-איי

הפרוטוקול עבור טיפול בבעלי חיים אושרה על ידי טיפול בעלי חיים מוסדיים ושימוש הוועדה (IACUC) של אוניברסיטת מרכז פלורידה.
1. דור של מח העצם נגזר מקרופאגים (BMDMs)
<ol><li>
תרבות המדיה הכנה
	<ol>
<li>להכין מדיה הבסיס D10F: כדי של Dulbecco ששינה נשר בינוני (DMEM), להוסיף 10% חום להשבית סרום שור ע?...

<ol>
	<li>Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+Oxygen+Species+and+Neutrophil+Function.">Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).</li><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress.">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).</li><li>Robinson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+in+phagocytic+leukocytes.">Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).</li><li>Thomas, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phagocyte+respiratory+burst:+Historical+perspectives+and+recent+advances.">The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances.</a> Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).</li><li>Fang, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+actions+of+reactive+oxygen+species.">Antimicrobial actions of reactive oxygen species.</a> MBio. 2 (5), (2011).</li><li>Iles, K. E., Forman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+signaling+and+respiratory+burst.">Macrophage signaling and respiratory burst.</a> Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).</li><li>Curnutte, J. T., Whitten, D. M., Babior, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+superoxide+production+by+granulocytes+from+patients+with+chronic+granulomatous+disease.">Defective superoxide production by granulocytes from patients with chronic granulomatous disease.</a> New England Journal of Medicine. 290 (11), 593-597 (1974).</li><li>Good, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatal+(chronic)+granulomatous+disease+of+childhood:+a+hereditary+defect+of+leukocyte+function.">Fatal (chronic) granulomatous disease of childhood: a hereditary defect of leukocyte function.</a> Seminars in Hematology. 5 (3), 215-254 (1968).</li><li>Holmes, B., Page, A. R., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+the+metabolic+activity+of+leukocytes+from+patients+with+a+genetic+abnormality+of+phagocytic+function.">Studies of the metabolic activity of leukocytes from patients with a genetic abnormality of phagocytic function.</a> Journal of Clinical Investigation. 46 (9), 1422-1432 (1967).</li><li>Windhorst, D. B., Page, A. R., Holmes, B., Quie, P. G., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pattern+of+genetic+transmission+of+the+leukocyte+defect+in+fatal+granulomatous+disease+of+childhood.">The pattern of genetic transmission of the leukocyte defect in fatal granulomatous disease of childhood.</a> Journal of Clinical Investigation. 47 (5), 1026-1034 (1968).</li><li>Dikalov, S. I., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species.">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).</li><li>Held, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Reactive+Oxygen+Species:+Measurement+of+ROS+in+cells.">An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in cells.</a> White Paper. , (2015).</li><li>Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+reactive+oxygen+species+measurement+in+biological+systems.">Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).</li><li>Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2',7'-Dichlorodihydrofluorescein+as+a+fluorescent+probe+for+reactive+oxygen+species+measurement:+Forty+years+of+application+and+controversy.">2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy.</a> Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).</li><li>Zielonka, J., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroethidine-+and+MitoSOX-derived+red+fluorescence+is+not+a+reliable+indicator+of+intracellular+superoxide+formation:+another+inconvenient+truth.">Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).</li><li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification+and+labeling+of+mouse+bone+marrow+neutrophils+for+functional+studies+and+adoptive+transfer+experiments.">Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).</li></ol>

DCFH2-DA ומבוסס-היא גילוי של ROS היא טכניקה נפוץ14,15. קלות שימוש והתאמה של אלה ROS זונדי תבניות microplate קינטי, קרינה פלואורסצנטית מיקרוסקופ או זרימה cytometric ניתוח תרם הפופולריות שלהם. עם זאת, במחקרים שלנו של פונקציות מקרופאג בתיווך FcγR, שם לא נראה להיות פרוטוקול תק...

מינים חמצן תגובתי (ROS) הם מולקולות תגובתי או רדיקלים חופשיים, כי הם תוצר לוואי של נשימה אירובית (נבדקה ב 1). אלה כוללים את סופראוקסיד אניון, מי חמצן, מימן על-חמצני, רדיקלי הידרוקסיל ו יוני הידרוקסיל, בין היתר. בתנאים רגילים הפיזיולוגיות, ROS מיוצרים בעיקר על ידי המיטוכונדריה nicotinamide אדנין dinucleotide פוספט (ניקוטין) oxidases, הן במהירות מאושפרת על ידי אנזימים וחלבונים שונים כמו סופראוקסיד דיסמוטאז גלוטטיון. ייצור מוגזם ROS או פגם ביכולת להסיר ROS יכול לגרום סטרס חמצוני, לפיה מינים חמצן תגובתי לקדם את הנזק של חלבונים, ליפידים ו DNA שמוביל מתח סלולארית או מוות ועם מצבי מחלה פתולוגית. עם זאת, הוא מעריך כיום כי ROS יכול גם לפעול מולקולות איתות (חמצון-חיזור איתות), בתיווך ROS שינוי של מולקולות שונות שביל ביניים יכולים להשפיע על חילוף החומרים הסלולר, התפשטות, הישרדות, דלקתיות איתות, והתיישנות2. בתאים phagocytic, רוס ממלא תפקיד חיוני במתן פעילות מיקרוביאלית במהלך כביכול "פרץ הנשימה"1,3,4,5,6. במהלך התגובה של phagocytes לגירויים חיצוניים, מרכיבי אוקסידאז nadph ל מורכבים (p40phox, p47phox, p67phox) translocate מ ציטוזול למוח phagosomal המכילות את gp91phox ואת p22phox subunits, יחד עם הפעולות של Rac1/2, יוצרים מתפקדת במלואה nadph ל אוקסידאז האנזים מורכבים. אוקסידאז nadph ל שהורכב ואז מנצל nadph ל כדי לצמצם את החמצן סופראוקסיד בתוך חלולית phagosomal. סופראוקסיד אניונים ישירות יכול לגרום לנזק או להיות dismutated לתוך מימן על-חמצני. סופראוקסיד והן מימן על-חמצני יכול להגיב עם מולקולות אחרות ליצירת רדיקלים הידרוקסיל תגובתי. נזק מתווך התגובה של אלה ROS עם ברזל-גופרית אשכולות על חלבונים או על ידי גרימת חמצון הבסיס של ה-DNA, המוביל בסופו של דבר מוגבל מטבוליזם מיקרוביאלי או מוות של חיידק5. החשיבות של האנזים אוקסידאז nadph ל מורכבים של ROS המיוצרים במהלך הנשימה פרץ זה מודגם קלינית בחולים עם מחלת גרגירומת ממושכת כרונית (CGD)7,8,9, 10. אנשים עם CGD מחזיקים מוטציות בגן gp91phox, והתוצאה היא חוסר ייצור ROS, רגישות לזיהומים חוזרים ונשנים עם חיידקים ופטריות אשר אינם בדרך כלל בעיה עם immunocompetent יחידים. לכן, אם לומד חימצוני מתח, חמצון-חיזור איתות או הגנה המארח, להיות מסוגל למדוד ROS הייצור בזמן אמת הוא מאמץ שימושי.
כבר מנוצל מספר מבחני הפקה ROS מידה או בתוצאות של סטרס חמצוני11,12,13. בין אלה, אחד בשימוש נרחב ביותר הוא בדיקה פלורסנט 2', 7' dichlorodihydrofluorescein diacetate (2- DCFH DA)14. מולקולה זו הוא חסר צבע lipophilic. פעפוע של DCFH2-DA על פני קרום התא מאפשר לו להיות שכוונת מאת תאיים esterases, אשר deacetylates את זה לתוך DCFH2, טיוח זה תא אטום. הפעולות של מספר סוגים של ROS (מימן על-חמצני, peroxynitrite, הידרוקסיל רדיקלים, תחמוצת החנקן ו רדיקלים peroxy) DCFH2 נישחק זה לתוך DCF אשר פלורסנט (דיווח Ex / Em: 485-500 ננומטר/515-530 ננומטר), ניתן להבחין באמצעות זרם cytometer מצויד עם מסנן סטנדרטי עבור fluorescein (ערוץ FL1). סופראוקסיד אינו מגיב בחריפות עם DCFH2 אבל יכול להגיב עם dihydroethidium בדיקה נוספת (היא) להניב פלורסנט מוצר ה-2-hydroxyethidium (מוצרי פלורסנט סופראוקסיד תלויית חמצון יתר)15. המוצרים פלורסנט של חמצון היא שניתן לאתר באמצעות אורך גל של עירור של 518 ננומטר, אורך גל של פליטה של 605 ננומטר (ערוץ FL2). למרות פשוטה יחסית לשימוש, ניצול של אלה זונדי גילוי של ROS דורש ידע של המגבלות שלהם, תיאגוד זהיר מכתים תהליכים ובקרות לתוך וזמינותו מסוימת המבוצעת על מנת שיהיה תקף ניסיוני תוצאות ומסקנות. הפרוטוקול הבא מדגים את השימוש ערכת זמינים מסחרית העסקת אלה 2 רגשים שעיצב למדוד ROS cytometry זרימה. אנו כתם להתקפת מקרופאגים הנגזרות מח עצם עם אלו הגששים, זירוז ייצור ROS באמצעות FcγR cross-linking. אנו להציג נציג נתונים שהושגו באמצעות פרוטוקול זה, הלחץ המתאים אמצעי זהירות זה חייב להתבצע עבור ניסויים מוצלחים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:623px;" width="623">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-BSA IgG1</td>
			<td style="width:121px;">Innovative Research</td>
			<td style="width:119px;">IBSA9E2C2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-mouse CD16/32</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:121px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">565853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">123108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647&#160;</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">101218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">beta-mercaptoethanol (BME)</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M3148-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">C57BL/6J&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Jackson labs</td>
			<td>Stock No.000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CM-H2DCFDA</td>
			<td style="width:121px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">C6827</td>
			<td>Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dihydroethidium (DHE)</td>
			<td style="width:121px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">D11347</td>
			<td>Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM 1x</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM no phenol red</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31053-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMF Anhydrous&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">61094-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FITC Rat IgG2a, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L glutamine</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LADMAC cells</td>
			<td style="width:121px;">ATCC</td>
			<td>CRL-2420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MEM</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mouse IFN-g</td>
			<td style="width:121px;">GoldBio</td>
			<td style="width:119px;">1360-06-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td style="width:121px;">EMD Milipore</td>
			<td style="width:119px;">106425</td>
			<td>Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Novocyte flow cytometer with autosampler</td>
			<td style="width:121px;">Acea</td>
			<td style="width:119px;">2060R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pyocyanin (ROS inducer)</td>
			<td style="width:121px;">Cayman chemical</td>
			<td style="width:119px;">10009594</td>
			<td>Can be a substitute for inducer in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ROS-ID total ROS/superoxide detection kit</td>
			<td style="width:121px;">ENZO</td>
			<td style="width:119px;">ENZ-51010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium pyruvate (100mM)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric measurement of ros production in macrophages in response to fc&#947;r cross-linking

פרץ חימצוני או הנשימה משמש לתאר את צריכת החמצן מהירה ויצירת של מינים חמצן תגובתי (ROS) phagocytes בתגובה לגירויים שונים של מערכת החיסון. ROS שנוצר במהלך הפעלת המערכת החיסונית מפעילה פעילות מיקרוביאלית חזק בעיקר דרך היכולת של ROS נזק DNA, חלבונים, גרימת מוות של מיקרואורגניזמים. היכולת למדוד ROS ייצור reproducibly, בקלות הכרחי על מנת להעריך את התרומה של מסלולים שונים, מולקולות מנגנון ההגנה המארח. בנייר זה, אנו מדגימים את השימוש הגששים פלורסנט, flow cytometry לזהות ROS הייצור. למרות בשימוש נרחב, פלורסנט מדידה של ROS הוא מאד בעייתי, במיוחד בכל הנוגע מדידה של ROS שנגזרות לגירויים ספציפיים, לא mitogenic. אנו מציגים מתודולוגיה מפורט כדי לזהות ROS שנוצר בעקבות גירוי FcγR מסוים החל דור מקרופאג לקרקע, מכתים, FcγR cross-linking, סיום עם ניתוח תזרים cytometric.

באמצעות פרוטוקול שמתואר בתוך, אנו מציגים את הנתונים נציג הדגמת זיהוי cytometric זרימת הייצור ROS הנובע גירוי של WT C57BL/6J BMDMs דרך FcγR. כצפוי, שאנו צופים שינויים מינימאליים ב FL1 או FL2 זריחה מעל רקע רמות בתאי unstimulated (איור 3A, להשוות לעומת "מוכתם, unstimulated" נקודה "וללא רבב, unstimulated" מתווה). אנו מב...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃŽÂ³R Cross-linking at JoVE.com

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃƒÅ½Ã‚Â³R Cross-linking

מחקר זה מדגים את השימוש cytometry זרימה כדי לזהות החמצן מגיב מינים (ROS) ייצור הנובע הפעלת FcγR. בשיטה זו ניתן להעריך שינויים מיקרוביאלית, חמצון-חיזור איתות הפונקציה של phagocytes בתגובה מכלולים חיסוניים, מיקרואורגניזמים opsonized או ישירות FcγR cross-linking.

מדידת Cytometric ROS הייצור ב מקרופאגים בתגובה FcγR cross-linking

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...

מדידה של מיני חמצן תגובתי או ROS הוא בעייתי לשמצה. בסרטון זה, נדגים את המדידה לשחזור של ROS בתגובה להצלבת קולטן FC-גמא באמצעות בדיקות פלואורסצנטיות וציטומטריית זרימה. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם הרבייה של ההתרשאות והשימוש בשיטה זו עם גירויים אנטיגניים ספציפיים, לא רק מיטוגנים או מעוררי ROS ידועים.ייצור ROS Dysregulated הוא מרכזי להתפתחות של מחלות רבות כגון מחלה גרנולומטוס כרונית או CGD. מדידה מדויקת של ROS יכולה להוות חלק אחד של האבחנה המולקולרית של CGD. לימוד ייצור ROS מתווך FC חשוב בחקר immunodeficiencies, כגון CGD, אלא גם בחקר מחלות אוטואימוניות, או מחלות ניווניות, שבו יותר מדי ROS מוביל ללחץ חמצוני ודלקת.העיתוי של ההתרגם הוא קריטי. הייתי מייעץ למישהו שמנסה את הפרוטוקול הזה בפעם הראשונה להתכונן ביסודיות ולעשות ניסוי מדומה במידת האפשר. הדגמה חזותית של שיטה זו היא קריטית על מנת להדגיש את צעדי ההתנסויות הזקוקות לתשומת לב מיוחדת כגון עיתוי ההתרגםות.כדי להתחיל, הכן מקרופאגים שמקורם במח העצם באמצעות מדיה מותנה כמתואר בפרוטוקול הטקסט הנלווה. לאחר priming מקרופאגים לילה, שאפו את העל-טבעי ושטפו את התאים פעם אחת עם PBS. הסרום מרעיב את התאים על-ידי החלפת מדיה באותו אמצעי אחסון של DMEM עם סרום נמוך.עבור כל עכבר, צלחת אחת תטופל עם אנטי BSA IgG1 בעוד סרום רעב בעוד השני יישאר מטופל. הוסיפו רק DMEM עם סרום נמוך לצלחות שלא טופלו והוסיפו DMEM עם סרום נמוך המכיל 2.5 מיקרוגרם למיליליטר של מורין נגד BSA IgG1 לצלחות המטופלות. הקפד לכלול לוח אחד נוסף לא מטופל עבור כל ניסוי לפעול כבקרת פיצוי ציטומטרי זרימה.דגירה הצלחות ארבע שעות ב 37 מעלות צלזיוס, 5% CO2. במהלך הדגירה של ארבע שעות, הכינו פתרון פי 2 לבדיקות של מיני החמצן תגובתי. עבור כל 10 מיליליטר של DMEM בסרום נמוך הדרושים, להוסיף ארבעה microliters של reagent גילוי סטרס חמצוני וארבעה microliters של reagent זיהוי סופראוקסיד.לאחר מכן, להכין את פתרונות בדיקה 2X המכיל רק את reagent זיהוי סטרס חמצוני או המכיל רק את reagent זיהוי סופראוקסיד. לאחר הדגירה של ארבע שעות, לקצור את התאים על ידי גירוד עדין של הצלחות, איסוף אותם בצינורות מסומנים, חמישה מיליליטר עם תחתית עגולה. צנטריפוגה הצינורות ב 750 פעמים g במשך חמש דקות.הקפד לעקוב אחר התאים שטופלו עם מורין נגד BSA IgG1. לאחר מכן, לשטוף את כדורי התא עם שני מיליליטר של PBS כדי להיפטר כל שאריות אנטי BSA מהתאים המטופלים. צנטריפוגה הצינורות ב 750 פעמים g במשך חמש דקות.לאחר מכן, שאף את ה- PBS ולחץ מחדש על גלולת התא ב- 600 מיקרוליטרים של DMEM עם סרום נמוך. מהשעיית תא 600 מיקרוליטר, aliquot 200 microliters לתוך צינורות תחתונים עגולים 5 מיליליטר prelabeled. מן התאים מטופלים, לקחת 200 microliters עבור צינורות שכותרתו unstimulated, 200 microliters עבור צינורות שכותרתו תמריץ חיובי, ו 200 microliters עבור הצינורות שכותרתו גורם חיובי בתוספת מעכב.לאחר מכן, מן התאים נגד BSA IgG1 מטופלים, לקחת 200 microliters עבור צינורות שכותרתו FC-גמא קולטן crosslinking, ו 200 microliters עבור צינורות שכותרתו קולטן FC-גמא crosslinking בתוספת מעכב. מהתאים הלא מטופלים שישמשו לבקרות פיצוי, יש ליטול 200 מיקרוליטרים עבור הצינור המסומנים כלא מזוהמים, 200 מיקרוליטרים לבקרת גרין פלוס תמריץ, ו-200 מיקרוליטר לבקרת תפוזים פלוס מעוררים. הכן פתרון מעורר חיובי 2X על ידי דילול pyocyanin אחד עד 100 לתוך כל אחד פתרונות בדיקה 2X לריכוז של 500 micromolar.לאחר מכן, הכינו פתרון BSA 2X על ידי דילול פתרון המלאי של BSA בתסרון הבדיקה 2X כדי להשיג ריכוז פי 2 של שני מיקרוגרם למיליליטר. לפני תחילת הגירוי הספציפי, כגון הצלבת קולטן FC-גמא, ודא כי כל reagents ותאים מוכנים למקם את הצינורות על קרח בסדר שבו הם יהיו מגורה. עבור ציטומטר זרימה עם מדגם אוטומטי, שים לב לזמן שלוקח לציטומטר לנתח דגימה אחת ולעבור לדגימה הבאה.הקפד לכלול את כל שלבי ערבוב ושטיפת בדיקה. התזמון הוא קריטי מאוד להתרגם הזה. על מנת שכל תנאי יהיה מבוקר היטב, הגירוי צריך להתבצע בדיוק 30 דקות עבור כל תנאי.לעורר את התאים לפי הסדר ולשלב את זמן ההשהיה בין רכישות מדגם על ידי ציטומטר זרימה. אם מבצעים פיצוי ידני בשלב זה, לעורר צינורות בקרה לשמש לפיצוי על ידי הוספת 200 microliters של פתרון בדיקה 2X המכיל את reagent זיהוי מתח חמצוני ואת המזרז לתוך הצינורות מסומן ירוק בתוספת inducer. לאחר מכן, להוסיף 200 microliters של פתרון בדיקה 2X המכיל את reagent זיהוי סופראוקסיד ואת המריץ לתוך צינורות מסומן כתום בתוספת inducer.דגירה התאים במשך 30 דקות בחושך. באמצעות תוכנת cytometry זרימה, ליצור ולתייג שלושה קבצים לדוגמה עבור הפקד, לא מוכתם, מטופל, ירוק בתוספת inducer, ואת כתום בתוספת דגימות inducer, הקפד לציין את הערוצים ואת הפרמטרים שיש לנתח. כמו כן, הזן תנאי עצירה רצויים.לאחר הגדרת דגימות הבקרה, צור ותייג קבוצה דומה של קבצים עבור הדגימות הניסיוניות. עכשיו, תריץ את הדגימה הלא מזוהמת והלא מטופלת. פתח חלקת נקודה עבור פיזור קדימה על ציר X לעומת פיזור צד על ציר Y ולצייר שער סביב התאים של עניין, למעט תאים מתים ופסולת.לאחר מכן, השתמש בשער של תא זה כדי לפתוח חלקת נקודה נוספת של סמן הפלואורסצנטיות הראשון, FL1, על ציר ה- X, לעומת סמן הפלואורסצנטיות השני, FL2, על ציר Y. צייר שער רבעים ראשוני ולאחר מכן התאם את שער הרבע כך שהאירועים יופיעו ברביע השמאלי התחתון של התוויית FL1 לעומת FL2. בסיום, הפעל את דגימת המזרז הירוק בתוספת.כוונן את המתח כך שהאירועים יופיעו ברבעים השמאליים והימין התחתונים של התוויית FL1 לעומת FL2. לאחר מכן, החל מטריצת פיצוי זו על כל שלושת הקבצים לדוגמה. עכשיו, תריץ את דגימת התפוז פלוס המזרז.התאם את המתח כך שהאירועים יופיעו ברבעים השמאליים העליונים והתחתונים של התוויית FL1 לעומת FL2, ולאחר מכן החל מטריצת פיצוי זו על כל שלושת הקבצים לדוגמה. בדוק כל קובץ פיצוי וודא שאירועים לא נגועים ולא מטופלים מופיעים ברביע השמאלי התחתון, אירועי ה-green plus inducer מופיעים ברבעים השמאליים והימניות התחתונים, ואירועי המזרז הכתומים פלוס מופיעים ברבעים השמאליים העליונים והתחתונים של התוויית FL1 לעומת FL2. לאחר מכן, החל את מטריצת הפיצוי על כל קבצי הדוגמה הניסיוניים.לאחר ביצוע פיצוי ידני והתקבלה תבנית ניסיונית, עבור אל הדגימות הניסיוניות. לפני הטיפול בתאים עם מעורר חיובי או ביצוע גירוי תא קולטן FC-גמא, לסמן אילו צינורות יקבלו מעכב ROS. לטפל בתאים אלה עם מעכב ROS לפחות 30 דקות לפני מעורר חיובי או גירוי קולטן FC-גמא על ידי הוספת מיקרוליטר אחד של המעכב ל 200 microliters של תאים resuspended לריכוז סופי של חמישה מילימולרים.עבור תאים לא מנומקים, לטפל בתאים עם 200 microliters של פתרון בדיקה 2X ללא כל גירוי נוסף 200 microliters של השעיית תא שכותרתו מוכתם, ללא גירוי. עבור פקדים חיוביים, לטפל בתאים עם 200 microliters של פתרון תמריץ חיובי 2X כדי 200 microliters של השעיית התא שכותרתו תמריץ חיובי או מעורר חיובי בתוספת מעכב. לבסוף, עבור תאים מגורה על ידי הצלבת קולטן FC-גמא, לטפל בהם עם 200 microliters של פתרון 2X BSA הוסיף 200 microliters של המתלה התא שכותרתו FC-גמא קולטן crosslinking או קולטן FC-גמא crosslinking בתוספת מעכב.דגירה התאים במשך 30 דקות בחושך. לאחר הדגירה, לנתח את הדגימות בסדר שבו הם היו מגורים, באמצעות ציטומטר זרימה ותבניות ניתוח שנוצר במהלך שלבי הפיצוי הראשוניים. הנתונים המוצגים כאן מדגימים את הזיהוי הציטומטרי של זרימה של ייצור מיני חמצן תגובתי הנובע מגירוי של מקרופאגים באמצעות קולטן FC-גמא.יש עלייה ניכרת פלואורסצנטיות FL1 ו FL2 כאשר תאים מגורים עם סוכן crosslinking קולטן FC-גמא. כאשר תאים טופלו עם מעכבי מיני חמצן תגובתי לפני הצלבת קולטן FC-גמא, פלואורסצנטיות מוגברת זו מוחזרת לרמות בסיס. לעומת זאת, חלקות נקודה אלה מציגות ניסוי לא מוצלח, שבו נצפתה ייצור מיני חמצן תגובתי תת-אופטימלי כתוצאה מגירוי קולטן FC-גמא.כדי להדגיש את ההבדלים הגדולים בין האחוזים הצפויים, או עליות MFI, נתונים אלה מראים מה דגימות עם עלייה מינימלית FL1 ו FL2 פלואורסצנטי נראה. הפרוטוקול הנוכחי משתמש בשלב של 24 שעות ביממה. כאשר משווים זמן של 24 שעות לעומת זמן של 48 שעות, לא היה הבדל ניכר באחוז התאים החיוביים עבור רוח הלחץ החמצוני הירוק.עם זאת, הגדלת זמן הפרימינג ל-48 שעות הגדילה את אחוז התאים החיוביים עבור הפלואורסצנטיות הכתומה. הדברים החשובים ביותר שיש לזכור בעת ביצוע הליך זה הוא תכנון מראש, ולהיות עקבי על העיתוי של הבדיקה כדי לקבל תוצאות לשחזור.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Cytometry ססגוניות אנליזות זרימה של תגובה חיסונית תאית של קופי רזוס

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

מדידת כמותית של התגובה החיסונית ובשינה<em&gt; דרוזופילה</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

ניתוח של הנגישות המרככת של שאריות ציסטאין על<em&gt; תירס rayado Fino וירוס</em&gt; חלקיקי נגיף דמויים מיוצרים ב<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; צמחים וקישור צולב של פפטידים לVLPs

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

באמצעות RNA-התערבות לחקר התגובה החיסונית המולדת בהמקרופאגים עכבר

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Cytometric זרימה פשוט שיטה למדוד ספיגת הגלוקוז ואת ביטוי נשא גלוקוז עבור מונוציטים subpopulations ב דם מלא

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

ניתוח תזרים Cytometric נ בית נכנס חלקיקים 1 האלרגנים PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

ניתוח תזרים Cytometric של תא הטבעי Killer ממס פעילות דם מלא אנוש

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

בידוד של סלמונלה typhimurium-המכיל Phagosomes של מקרופאגים

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

בידוד והתרבות במבחנה של מקרופאגים מכתשי מאתר ואנושי

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

זרימה ניתוח ציטומטרי של חדירה לימפוציטים במערכת העצבים המרכזית במהלך אנצפלומיאלטיס אוטואימונית ניסיונית

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...