Name: flow cytometric measurement of ros production in macrophages in response to fc&#947;r cross-linking
Uploaded: 2019-03-07T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃŽÂ³R Cross-linking at JoVE.com

Gli autori vorrei ringraziare altri membri del laboratorio Tigno-Aranjuez inclusi Madelyn H. Miller, Omar Cardona, Andjie Jeudy e Roopin Singh per il loro aiuto nella manutenzione di Colonia di manutenzione e topo di laboratorio. Il supporto per questa ricerca è stato fornito da grant R00 HL122365 e fondi di Start-up a J.T.T-A.

Il protocollo per la gestione degli animali è stato approvato dal Comitato istituzionale Animal Care e uso (IACUC) della Università della Florida centrale.
1. generazione del midollo osseo derivato macrofagi (BMDMs)
<ol><li>
Preparazione di terreni di coltura
	<ol>
<li>Preparare il supporto di base D10F: A di Dulbecco per volta Eagle Medium (DMEM), aggiungere inattivato con calore 10% siero bovino fetale (FBS), piruvato di sodio di 1 mM, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazi...

<ol>
	<li>Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+Oxygen+Species+and+Neutrophil+Function.">Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).</li><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress.">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).</li><li>Robinson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+in+phagocytic+leukocytes.">Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).</li><li>Thomas, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phagocyte+respiratory+burst:+Historical+perspectives+and+recent+advances.">The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances.</a> Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).</li><li>Fang, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+actions+of+reactive+oxygen+species.">Antimicrobial actions of reactive oxygen species.</a> MBio. 2 (5), (2011).</li><li>Iles, K. E., Forman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+signaling+and+respiratory+burst.">Macrophage signaling and respiratory burst.</a> Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).</li><li>Curnutte, J. T., Whitten, D. M., Babior, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+superoxide+production+by+granulocytes+from+patients+with+chronic+granulomatous+disease.">Defective superoxide production by granulocytes from patients with chronic granulomatous disease.</a> New England Journal of Medicine. 290 (11), 593-597 (1974).</li><li>Good, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatal+(chronic)+granulomatous+disease+of+childhood:+a+hereditary+defect+of+leukocyte+function.">Fatal (chronic) granulomatous disease of childhood: a hereditary defect of leukocyte function.</a> Seminars in Hematology. 5 (3), 215-254 (1968).</li><li>Holmes, B., Page, A. R., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+the+metabolic+activity+of+leukocytes+from+patients+with+a+genetic+abnormality+of+phagocytic+function.">Studies of the metabolic activity of leukocytes from patients with a genetic abnormality of phagocytic function.</a> Journal of Clinical Investigation. 46 (9), 1422-1432 (1967).</li><li>Windhorst, D. B., Page, A. R., Holmes, B., Quie, P. G., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pattern+of+genetic+transmission+of+the+leukocyte+defect+in+fatal+granulomatous+disease+of+childhood.">The pattern of genetic transmission of the leukocyte defect in fatal granulomatous disease of childhood.</a> Journal of Clinical Investigation. 47 (5), 1026-1034 (1968).</li><li>Dikalov, S. I., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species.">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).</li><li>Held, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Reactive+Oxygen+Species:+Measurement+of+ROS+in+cells.">An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in cells.</a> White Paper. , (2015).</li><li>Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+reactive+oxygen+species+measurement+in+biological+systems.">Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).</li><li>Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2',7'-Dichlorodihydrofluorescein+as+a+fluorescent+probe+for+reactive+oxygen+species+measurement:+Forty+years+of+application+and+controversy.">2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy.</a> Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).</li><li>Zielonka, J., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroethidine-+and+MitoSOX-derived+red+fluorescence+is+not+a+reliable+indicator+of+intracellular+superoxide+formation:+another+inconvenient+truth.">Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).</li><li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification+and+labeling+of+mouse+bone+marrow+neutrophils+for+functional+studies+and+adoptive+transfer+experiments.">Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).</li></ol>

2DCFH -DA e rilevazione basata su DHE di ROS è una tecnica ampiamente usato14,15. Facilità d'uso e l'adattabilità di queste sonde ROS per micropiastra cinetica formati, analisi di cytometric di flusso o microscopia di fluorescenza ha contribuito alla loro popolarità. Tuttavia, nei nostri studi di funzioni FcγR-mediata del macrofago, ci non sembrano essere un protocollo standard per l'esecuzione di questo test per analisi citofluorimetrica delle ce...

Specie reattive dell'ossigeno (ROS) sono molecole reattive o i radicali liberi che sono sottoprodotti della respirazione aerobica (rivisto in 1). Questi includono l'anione superossido, il perossido, perossido di idrogeno, radicale ossidrile e ioni dell'idrossile, tra gli altri. In condizioni fisiologiche normali, ROS sono prodotte principalmente dalla mitocondri e nicotinammide adenina dinucleotide fosfato (NADPH) ossidasi e sono rapidamente disintossicati da vari enzimi e proteine quali superossido dismutasi e glutatione. Una produzione esagerata di ROS o un difetto nella capacità di rimuovere ROS può causare stress ossidativo, per cui le specie reattive dell'ossigeno promuovono il danno di proteine, lipidi e DNA che portano a stress cellulare o morte e Stati di malattia patologica. Tuttavia, attualmente è apprezzato che ROS può anche fungere da molecole di segnalazione (segnalazione redox), e modifica ROS-mediato di varie molecole e via intermedi può influire sul metabolismo cellulare, la proliferazione, la sopravvivenza, infiammatoria segnalazione e invecchiamento2. In cellule fagocitiche, ROS svolge un ruolo essenziale nel fornire attività antimicrobica durante il cosiddetto "scoppio respiratorio"1,3,4,5,6. Durante la risposta dei fagociti agli stimoli esterni, componenti della NADPH ossidasi complessa (p40phox, p47phox, p67phox) traslocano dal citosol alla membrana phagosomal contenente la gp91phox e p22phox subunità, e insieme alle azioni di Rac1/2, formano un enzima di NADPH ossidasi completamente funzionale e complesso. L'ossidasi di NADPH assemblato allora utilizza NADPH per ridurre l'ossigeno a superossido all'interno del vacuolo phagosomal. Gli anioni superossido possono direttamente causare danni o essere dismutated in perossido di idrogeno. Perossido di idrogeno e del superossido può reagire con altre molecole per generare i radicali ossidrile altamente reattivo. Danno è mediato dalla reazione di questi ROS con cluster ferro-zolfo sulle proteine o provocando ossidazione del DNA, infine conducendo alla limitato metabolismo microbico o morte del microbo5. L'importanza dell'enzima NADPH ossidasi complessa e ROS, prodotte durante lo scoppio respiratorio è illustrata clinicamente in pazienti con malattia granulomatosa cronica (CGD)7,8,9, 10. gli individui con CGD possiedono mutazioni in gp91phox, risultante in una mancanza di produzione di ROS e suscettibilità alle infezioni ricorrenti con batteri e funghi che di solito non sono una preoccupazione con individui immunocompetent. Pertanto, se studiare ossidativo stress, segnalazione redox o difesa ospite, essere in grado di misurare la produzione di ROS in tempo reale è uno sforzo utile.
Analisi multiple sono state utilizzate per la produzione di ROS di misura o i risultati di stress ossidativo11,12,13. Tra questi, uno dei più utilizzati è la sonda fluorescente 2', 7' dichlorodihydrofluorescein diacetato (2DCFH -DA)14. Questa molecola è incolore e lipofilico. Diffusione di DCFH2-DA attraverso la membrana cellulare permette di essere agito da esterasi intracellulari, che si deacetylates in DCFH2, rendendolo cellulare impermeabile. Le azioni di più tipi di ROS (perossido di idrogeno, peroxynitrite, i radicali ossidrili, ossido nitrico e perossi radicali) su DCFH2 si ossidano in DCF che è fluorescente (segnalati Ex / Em: 485-500 nm/515-530 nm) e può essere rilevato tramite un flusso citometro dotato di un filtro standard impostato per fluoresceina (canale FL1). Superossido non reagisce fortemente con DCFH2 ma può reagire con un'altra sonda diidroetidio (DHE) per produrre il prodotto fluorescente 2-hydroxyethidium (così come altri prodotti di ossidazione di superossido-indipendente fluorescente)15. I prodotti fluorescenti di ossidazione DHE possono essere rilevati utilizzando una lunghezza d'onda di eccitazione di 518 nm e una lunghezza d'onda di emissione di 605 nm (canale FL2). Anche se relativamente semplice da usare, l'utilizzo di queste sonde per il rilevamento di ROS richiede la conoscenza dei loro limiti e attenta incorporazione di macchiatura procedure e controlli nel dosaggio specifico viene eseguito al fine di avere validi sperimentale risultati e conclusioni. Il protocollo riportato di seguito viene illustrato l'utilizzo di un kit disponibile in commercio che impiegano questi 2 sonde progettate per misurare il ROS tramite flusso cytometry. Abbiamo macchia innescati derivate da midollo osseo macrofagi con queste sonde e indurre la produzione di ROS attraverso FcγR cross-linking. Presentiamo dati rappresentativi ottenuti usando questo protocollo e sottolineare le opportune precauzioni che devono essere intraprese per la sperimentazione di successo.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:623px;" width="623">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-BSA IgG1</td>
			<td style="width:121px;">Innovative Research</td>
			<td style="width:119px;">IBSA9E2C2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-mouse CD16/32</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:121px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">565853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">123108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647&#160;</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">101218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">beta-mercaptoethanol (BME)</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M3148-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">C57BL/6J&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Jackson labs</td>
			<td>Stock No.000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CM-H2DCFDA</td>
			<td style="width:121px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">C6827</td>
			<td>Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dihydroethidium (DHE)</td>
			<td style="width:121px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">D11347</td>
			<td>Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM 1x</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM no phenol red</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31053-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMF Anhydrous&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">61094-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FITC Rat IgG2a, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L glutamine</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LADMAC cells</td>
			<td style="width:121px;">ATCC</td>
			<td>CRL-2420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MEM</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mouse IFN-g</td>
			<td style="width:121px;">GoldBio</td>
			<td style="width:119px;">1360-06-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td style="width:121px;">EMD Milipore</td>
			<td style="width:119px;">106425</td>
			<td>Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Novocyte flow cytometer with autosampler</td>
			<td style="width:121px;">Acea</td>
			<td style="width:119px;">2060R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pyocyanin (ROS inducer)</td>
			<td style="width:121px;">Cayman chemical</td>
			<td style="width:119px;">10009594</td>
			<td>Can be a substitute for inducer in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ROS-ID total ROS/superoxide detection kit</td>
			<td style="width:121px;">ENZO</td>
			<td style="width:119px;">ENZ-51010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium pyruvate (100mM)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric measurement of ros production in macrophages in response to fc&#947;r cross-linking

Il burst ossidativo o respiratorio è usato per descrivere il rapido consumo di ossigeno e la generazione di specie reattive dell'ossigeno (ROS) da parte dei fagociti in risposta a vari stimoli immuni. ROS generati durante l'attivazione del sistema immunitario esercita la potente attività antimicrobica principalmente attraverso la capacità di ROS di danneggiare il DNA e proteine, causando la morte dei microrganismi. Essere in grado di misurare la produzione di ROS riproducibile e con facilità è necessario al fine di valutare il contributo dei vari meccanismi e nuove molecole per questo meccanismo di difesa ospite. In questa carta, dimostriamo l'utilizzo di sonde fluorescenti e flusso cytometry per rilevare la produzione di ROS. Anche se ampiamente utilizzato, misure in fluorescenza di ROS sono notoriamente problematica, soprattutto per quanto riguarda la misura del ROS indotta da stimoli specifici e non mitogenici. Vi presentiamo una dettagliata metodologia per rilevare ROS generati a seguito di stimolazione specifica di FcγR cominciando con generazione del macrofago, adescamento, colorazione, FcγR cross-linking e termina con l'analisi cytometric di flusso.

Utilizzando il protocollo delineato all'interno, vi presentiamo dati rappresentativi dimostrando rilevamento di cytometric di flusso della produzione di ROS derivando dallo stimolo di WT C57BL/6J BMDMs attraverso il FcγR. Come previsto, osserviamo i cambiamenti minimi nella fluorescenza FL1 o FL2 sopra i livelli di sfondo in cellule non stimolate (Figura 3A, Confronta vs "macchiati, non stimolate" dot "senza macchia, non stimolate" trame). Si osserva un marcato aumento nella fluorescenza FL...

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Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃƒÅ½Ã‚Â³R Cross-linking

Questo studio dimostra l'uso di citometria a flusso per rilevare produzione reattiva dell'ossigeno specie (ROS) derivanti dall'attivazione della FcγR. Questo metodo può essere utilizzato per valutare i cambiamenti nella funzione dei fagociti in risposta a complessi immuni, opsonized microrganismi o diretto FcγR cross-linking di segnalazione redox e antimicrobico.

Misurazione del flusso Cytometric di produzione di ROS nei macrofagi In risposta a FcγR cross-linking

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...

La misurazione delle specie reattive dell'ossigeno o ROS è notoriamente problematica. In questo video, dimostreremo la misurazione riproducibile del ROS in risposta al crosslinking del recettore FC-gamma utilizzando sonde fluorescenti e citometria di flusso. I principali vantaggi di questa tecnica sono la riproducibilità del saggio e l'uso di questo metodo con stimoli antigenici specifici, non solo mitogeni o induttori ROS noti.La produzione di ROS disregolamentata è fondamentale per lo sviluppo di molte malattie come la malattia granulomatosa cronica o la CGD. Misurare con precisione il ROS potrebbe costituire una parte della diagnosi molecolare del CGD. Studiare la produzione di ROS mediata da FC è importante nello studio delle immunodeficienze, come la CGD, ma anche nello studio delle malattie autoimmuni, o malattie neurodegenerative, dove troppo ROS porta allo stress ossidativo e all'infiammazione.La tempistica del saggio è critica. Consiglierei a qualcuno che prova questo protocollo per la prima volta di prepararsi a fondo e fare un finto esperimento, se possibile. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale per sottolineare le fasi del saggio che necessitano di particolare attenzione come la tempistica del saggio.Per iniziare, preparare macrofagi derivati dal midollo osseo utilizzando supporti condizionati come descritto nel protocollo di testo di accompagnamento. Dopo aver adescato i macrofagi durante la notte, aspirare il supernatante e lavare le cellule una volta con PBS. Il siero muore di fame le cellule sostituendo i supporti con lo stesso volume di DMEM a basso siero.Per ogni topo, una piastra verrà trattata con anti-BSA IgG1 mentre il siero muore di fame mentre l'altra non verrà trattata. Aggiungere solo DMEM a basso siero alle piastre non trattate e aggiungere DMEM a basso siero contenente 2,5 microgrammi per millilitro di murina anti-BSA IgG1 alle piastre trattate. Assicurarsi di includere un'ulteriore piastra non trattata per ogni esperimento per fungere da controllo della compensazione citometrica del flusso.Incubare le piastre quattro ore a 37 gradi Celsius, 5%CO2. Durante l'incubazione di quattro ore, preparare una soluzione 2X delle sonde reattive delle specie di ossigeno. Per ogni 10 millilitri di DMEM a basso siero necessari, aggiungere quattro microlitri di un reagente di rilevamento delle sollecitazioni ossidativo e quattro microlitri di un reagente di rilevamento del superossido.Quindi, preparare le soluzioni di sonda 2X contenenti solo il reagente di rilevamento dello stress ossidativo o contenenti solo il reagente di rilevamento del superossido. Dopo l'incubazione di quattro ore, raccogliere le cellule raschiando delicatamente le piastre, raccogliendole in tubi a fondo rotondo etichettati da cinque millilitri. Centrifugare i tubi a 750 volte g per cinque minuti.Assicurarsi di tenere traccia di quali cellule sono state trattate con murina anti-BSA IgG1. Successivamente, lavare i pellet cellulari con due millilitri di PBS per sbarazzarsi di eventuali anti-BSA residui dalle cellule trattate. Centrifugare i tubi a 750 volte g per cinque minuti.Quindi, aspirare il PBS e rimorsi il pellet cellulare in 600 microlitri di DMEM a basso siero. Dalla sospensione a celle da 600 microlitri, aliquota 200 microlitri nei tubi a fondo tondo preetichettati da cinque millilitri. Dalle celle non trattate, prendere 200 microlitri per i tubi etichettati non stimolati, 200 microlitri per i tubi etichettati induttore positivo e 200 microlitri per i tubi etichettati incentivo positivo più inibitore.Quindi, dalle cellule trattate anti-BSA IgG1, prendere 200 microlitri per tubi etichettati FC-gamma receptor crosslinking, e 200 microlitri per tubi etichettati FC-gamma recettore crosslinking più inibitore. Dalle celle non trattate da utilizzare per i controlli di compensazione, prendere 200 microlitri per il tubo etichettato non stimolato, 200 microlitri per il controllo verde più induttore e 200 microlitri per il controllo arancione più induttore. Preparare una soluzione di induttore positivo 2X diluire la piocianina da uno a 100 in ciascuna delle soluzioni di sonda 2X a una concentrazione di 500 micromolari.Quindi, preparare una soluzione BSA 2X diluendo la soluzione di serie BSA nella soluzione di sonda 2X per ottenere una concentrazione 2X di due microgrammi per millilitro. Prima di iniziare la stimolazione specifica, come il crosslinking del recettore FC-gamma, assicurarsi che tutti i reagenti e le cellule siano pronti e posizionare i tubi sul ghiaccio nell'ordine in cui saranno stimolati. Per i citometri di flusso con un autocampionatore, prendere nota del tempo necessario al citometro per analizzare un campione e passare a quello successivo.Assicurarsi di includere eventuali passaggi di miscelazione e lavaggio della sonda. La tempistica è molto critica per questo saggio. Affinché ogni condizione sia ben controllata, la stimolazione deve essere eseguita esattamente in 30 minuti per ogni condizione.Stimolare le cellule in ordine e incorporare il tempo di ritardo tra le acquisizioni di campioni da parte del citometro di flusso. Se si esegue la compensazione manuale a questo punto, stimolare i tubi di controllo da utilizzare per la compensazione aggiungendo 200 microlitri della soluzione di sonda 2X contenenti il reagente di rilevamento delle sollecitazioni ossidativo e l'induttore nei tubi contrassegnati verde più induttore. Quindi, aggiungere 200 microlitri di soluzione di sonda 2X contenenti il reagente di rilevamento del superossido e l'induttore nei tubi contrassegnati come arancione più induttore.Incubare le cellule per 30 minuti al buio. Utilizzando il software di citometria a flusso, generare ed etichettare tre file di esempio per il controllo, non macchiati, non trattati, il verde più l'induttore e i campioni arancioni più induttori, assicurandosi di indicare i canali e i parametri da analizzare. Inoltre, inserisci le condizioni di arresto desiderate.Una volta impostati gli esempi di controllo, generare ed etichettare un insieme simile di file per i campioni sperimentali. Ora, esegui il campione non macchiato e non trattato. Aprite un grafico a punti per la dispersione in avanti sull'asse X rispetto alla dispersione laterale sull'asse Y e disegnate un cancello attorno alle celle di interesse, escluse le cellule morte e i detriti.Quindi, usate il gate di questa cella per aprire un altro grafico a punti del primo marcatore di fluorescenza, FL1, sull'asse X, rispetto al secondo marcatore di fluorescenza, FL2, sull'asse Y. Disegnare un cancello del quadrante iniziale e quindi regolare il cancello del quadrante in modo che gli eventi appaiano nel quadrante in basso a sinistra del plottaggio FL1 contro FL2. Al termine, eseguire il campione verde più induttore.Regolate la tensione in modo che gli eventi appaiano nei quadranti inferiore sinistro e destro del plottaggio FL1 contro FL2. Quindi, applicare questa matrice di compensazione a tutti e tre i file di esempio. Ora, esegui il campione arancione più induttore.Regolate la tensione in modo che gli eventi appaiano sui quadranti superiore e inferiore sinistro del plottaggio FL1 contro FL2, quindi applicate questa matrice di compensazione a tutti e tre i file campione. Controllare ogni file di compensazione e assicurarsi che gli eventi non contaminati e non trattati vengano visualizzati nel quadrante in basso a sinistra, gli eventi verde più induttore vengano visualizzati nei quadranti inferiore sinistro e destro e gli eventi arancioni più induttori vengano visualizzati sui quadranti superiore e inferiore sinistro del plottaggio FL1 contro FL2. Quindi, applicare la matrice di compensazione a tutti i file di esempio sperimentali.Una volta eseguita la compensazione manuale ed ottenuto un modello sperimentale, passare ai campioni sperimentali. Prima di trattare le cellule con un induttore positivo o condurre la stimolazione cellulare del recettore FC-gamma, contrassegnare quali tubi avranno un inibitore del ROS. Trattare queste cellule con l'inibitore del ROS almeno 30 minuti prima della stimolazione positiva dell'induttore o del recettore FC-gamma aggiungendo un microlitro dell'inibitore a 200 microlitri di cellule rimescolate per una concentrazione finale di cinque millimolare.Per le cellule non stimolate, trattare le cellule con 200 microlitri della soluzione di sonda 2X senza alcuno stimolo aggiunto ai 200 microlitri di sospensione cellulare etichettati macchiati, non stimolati. Per i controlli positivi, trattare le cellule con 200 microlitri della soluzione di induttore positivo 2X a 200 microlitri di sospensione cellulare etichettati induttore positivo o induttore positivo più inibitore. Infine, per le cellule stimolate dal crosslinking del recettore FC-gamma, trattarle con 200 microlitri della soluzione 2X BSA aggiunti a 200 microlitri della sospensione cellulare etichettati FC-gamma receptor crosslinking o FC-gamma receptor crosslinking plus inhibitor.Incubare le cellule per 30 minuti al buio. Dopo l'incubazione, analizzare i campioni nell'ordine in cui sono stati stimolati, utilizzando il citometro di flusso e i modelli di analisi generati durante le fasi iniziali di compensazione. I dati qui riportati dimostrano il rilevamento citometrico del flusso della produzione reattiva di specie di ossigeno risultante dalla stimolazione dei macrofagi attraverso il recettore FC-gamma.C'è un marcato aumento della fluorescenza FL1 e FL2 quando le cellule vengono stimolate con l'agente reticolo del recettore FC-gamma. Quando le cellule sono state trattate con l'inibitore reattivo della specie di ossigeno prima del collegamento incrociato del recettore FC-gamma, questa maggiore fluorescenza viene riportato a livelli basali. Al contrario, questi grafici a punti presentano un esperimento fallito, in cui è stata osservata la produzione di specie reattive non ottimale delle specie di ossigeno a seguito della stimolazione del recettore FC-gamma.Per evidenziare le grandi differenze tra le percentuali previste o aumenti delle IFM, questi dati mostrano l'aspetto dei campioni con un aumento minimo della fluorescenza FL1 e FL2. Il protocollo corrente utilizza un passaggio di adescamento 24 ore su 24. Quando si confronta un tempo di adescamento di 24 ore rispetto a un tempo di adescamento di 48 ore, non c'era alcuna differenza marcata nella percentuale di cellule positive per il reagente di sollecitazione ossidativo verde.Tuttavia, l'aumento del tempo di adescamento a 48 ore ha aumentato la percentuale di cellule positive per la fluorescenza arancione. Le cose più importanti da ricordare quando si esegue questa procedura è pianificare in anticipo ed essere coerenti sulla tempistica del saggio per ottenere risultati riproducibili.

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