Name: flow cytometric measurement of ros production in macrophages in response to fc&#947;r cross-linking
Uploaded: 2019-03-07T15:30:00
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著者らは、実験室の維持およびマウス コロニーのメンテナンスにマデリン h. ミラー、オマール ・ カルドナ、Andjie Jeudy、Roopin ・ シンを含む Tigno アランフェス研究室の他のメンバーに感謝したいと思います。この研究支援グラント R00 HL122365 と J.T.T A にスタートアップ資金によって提供されました

動物取扱のプロトコルは、機関動物ケアおよび使用委員会 (IACUC) のユニバーシティ オブ セントラル フロリダによって承認されました。
1 世代の骨髄由来マクロファージ (BMDMs)
<ol><li>
文化メディアの準備
	<ol>
<li>D10F 基本メディアの準備: 10% 熱ウシ胎児血清 (FBS)、1 mM ピルビン酸ナトリウム、10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic 酸 (HEPES)、0.05 mM β-メルカプ...

<ol>
	<li>Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+Oxygen+Species+and+Neutrophil+Function.">Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).</li><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress.">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).</li><li>Robinson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+in+phagocytic+leukocytes.">Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).</li><li>Thomas, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phagocyte+respiratory+burst:+Historical+perspectives+and+recent+advances.">The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances.</a> Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).</li><li>Fang, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+actions+of+reactive+oxygen+species.">Antimicrobial actions of reactive oxygen species.</a> MBio. 2 (5), (2011).</li><li>Iles, K. E., Forman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+signaling+and+respiratory+burst.">Macrophage signaling and respiratory burst.</a> Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).</li><li>Curnutte, J. T., Whitten, D. M., Babior, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+superoxide+production+by+granulocytes+from+patients+with+chronic+granulomatous+disease.">Defective superoxide production by granulocytes from patients with chronic granulomatous disease.</a> New England Journal of Medicine. 290 (11), 593-597 (1974).</li><li>Good, R. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species.">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).</li><li>Held, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Reactive+Oxygen+Species:+Measurement+of+ROS+in+cells.">An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in cells.</a> White Paper. , (2015).</li><li>Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+reactive+oxygen+species+measurement+in+biological+systems.">Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).</li><li>Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2',7'-Dichlorodihydrofluorescein+as+a+fluorescent+probe+for+reactive+oxygen+species+measurement:+Forty+years+of+application+and+controversy.">2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy.</a> Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).</li><li>Zielonka, J., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroethidine-+and+MitoSOX-derived+red+fluorescence+is+not+a+reliable+indicator+of+intracellular+superoxide+formation:+another+inconvenient+truth.">Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).</li><li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification+and+labeling+of+mouse+bone+marrow+neutrophils+for+functional+studies+and+adoptive+transfer+experiments.">Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).</li></ol>

DCFH2-DA ROS の dhe はベースの検出は、広く使用される手法14,15です。使いやすさと運動のマイクロ プレート フォーマットのためのこれらの ROS プローブの適応性、蛍光顕微鏡またはフロー解析は彼らの人気に貢献しています。ただし、FcγR を介したマクロファージの機能の私達の研究でそうでなかった FcγR 架橋細胞のフローサイトメトリー?...

活性酸素種 (ROS)、反応分子または (文献1) 好気性の呼吸の副産物であるフリーラジカルです。これらには、スーパーオキシドアニオン、過酸化水素、過酸化水素、ヒドロキシルラジカル、他の中の水酸イオンが含まれます。通常の生理学的な条件の下で ROS は主にミトコンドリアとニコチンアミドアデニンジヌクレオチドリン酸 (NADPH) 酸化酵素によって生成され、様々 な酵素、スーパーオキシドディスムターゼやグルタチオンなどのタンパク質によって急速に無害化します。活性酸素や活性酸素を除去する能力に欠陥の誇張された生産は、酸化ストレス、活性酸素種がタンパク質、脂質、および病理学的病気の状態や死細胞ストレスにつながる DNA の損傷を促進するというで起因できます。しかし、それは現在感謝 ROS も (レドックスシグナ リング)、シグナル分子として機能し、様々 な分子および経路の中間体の活性酸素を介した変更に影響を与える細胞の代謝、増殖、生存、炎症性シグナル伝達と2を老化します。貪食細胞では、ROS は、いわゆる「呼吸バースト」1,3,4,5,6時に抗菌活性を提供する重要な役割を果たしています。外部刺激に食細胞の応答、時に NADPH オキシダーゼ複合体 (p40phox、p47phox、p67phox) のコンポーネントは gp91phox と p22phox 含む phagosomal 膜に細胞質から、若しサブユニット、Rac1/2 のアクションと共に完全に機能 NADPH オキシダーゼ酵素複合体を形成します。組み立ての NADPH オキシダーゼ、スーパーオキシド phagosomal 液胞内に酸素を減らす NADPH を利用しています。スーパーオキシドの陰イオンは、直接破損したり、過酸化水素に dismutated。スーパーオキシドと過酸化水素は、反応性の高いヒドロキシラジカルを生成する他の分子と反応できます。被害は、タンパク質の鉄硫黄クラスターとこれらの ROS の反応、dna の制限の微生物代謝または微生物5の死に最終的につながる基本の酸化を引き起こすことによって媒介されます。NADPH オキシダーゼ酵素の複合体の重要性と呼吸バースト中に生成された ROS は慢性肉芽腫症 (CGD)7,8,9,の患者で臨床的に示されて10. CGD を持つ個人は、活性酸素産生や細菌および真菌は通常免疫の個人の関心事の再発性感染症への感受性の欠如の結果 gp91phox、変異を持っています。したがって、勉強を測定することができる酸化ストレス、レドックス シグナル、または宿主防御されてかどうかリアルタイムでの活性酸素産生は有用な試みです。
複数のアッセイは、メジャーの活性酸素産生や酸化ストレス11,12,13の結果に利用されています。これらのうち、最も広く使用されるの 1 つは蛍光プローブ 2', 7' dichlorodihydrofluorescein ジアセテート (DCFH2-DA)14です。この分子は無色と脂溶性です。DCFH2- da セル膜を渡る拡散できます、細胞内エステラーゼによって速やかに DCFH2、不浸透性セルを表示にナミズムします。DCFH2 ROS (過酸化水素、ペルオキシ ナイト ライト、ヒドロキシラジカル、一酸化窒素、ペルオキシラジカル) の複数の種類のアクションは蛍光である DCF にそれを酸化 (Ex 報告/Em: 485-500 nm/515-530 nm)、フローを使用して検出することができますcytometer フルオレセイン (FL1 チャネル) の設定標準フィルター搭載します。スーパーオキシドは、DCFH2と強く反応しないが、製品は、蛍光 2 hydroxyethidium (同様に他の蛍光活性酸素に依存しない酸化生成物)15を生成する別のプローブ dihydroethidium (DHE) と反応することができます。518 の励起波長を用いた蛍光 dhe は酸化物を検出できる nm、発光波長 605 nm (FL2 チャネル)。身の程の知識と実験に有効があるために実行されている特定の測定手順とコントロールを染色の注意定款に ROS の検出用のプローブの使用率が必要ですを使用する比較的簡単ですが、結果と結論。次のプロトコルは、フローサイトメトリーによるロスを測定するように設計これらの 2 のプローブを用いた市販のキットの使用を示します。我々 はこれらのプローブでプライミング骨髄由来マクロファージを染色、FcγR 架橋による活性酸素産生を誘導します。このプロトコルを使用して得られた代表的なデータを提示し、成功した実験を実施する必要があります適切な予防措置を強調.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:623px;" width="623">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-BSA IgG1</td>
			<td style="width:121px;">Innovative Research</td>
			<td style="width:119px;">IBSA9E2C2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-mouse CD16/32</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:121px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">565853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">123108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647&#160;</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">101218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">beta-mercaptoethanol (BME)</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M3148-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">C57BL/6J&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Jackson labs</td>
			<td>Stock No.000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CM-H2DCFDA</td>
			<td style="width:121px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">C6827</td>
			<td>Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dihydroethidium (DHE)</td>
			<td style="width:121px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">D11347</td>
			<td>Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM 1x</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM no phenol red</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31053-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMF Anhydrous&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">61094-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FITC Rat IgG2a, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L glutamine</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LADMAC cells</td>
			<td style="width:121px;">ATCC</td>
			<td>CRL-2420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MEM</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mouse IFN-g</td>
			<td style="width:121px;">GoldBio</td>
			<td style="width:119px;">1360-06-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td style="width:121px;">EMD Milipore</td>
			<td style="width:119px;">106425</td>
			<td>Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Novocyte flow cytometer with autosampler</td>
			<td style="width:121px;">Acea</td>
			<td style="width:119px;">2060R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pyocyanin (ROS inducer)</td>
			<td style="width:121px;">Cayman chemical</td>
			<td style="width:119px;">10009594</td>
			<td>Can be a substitute for inducer in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ROS-ID total ROS/superoxide detection kit</td>
			<td style="width:121px;">ENZO</td>
			<td style="width:119px;">ENZ-51010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium pyruvate (100mM)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric measurement of ros production in macrophages in response to fc&#947;r cross-linking

酸化または呼吸バーストは様々 な免疫刺激への応答の食によって酸素を急激に消費と活性酸素種 (ROS) の生成を記述する使用されます。免疫活性化中に生成された ROS は、微生物の死を引き起こす損傷 DNA とタンパク質、ROS の能力を中心に強力な抗菌活性を発揮します。再現性をもって、容易に活性酸素産生を測定することが様々 な経路やこの生体防御のメカニズムを分子の寄与を評価するために必要です。本稿では、蛍光プローブの使用方法を示すし、フローサイトメトリー活性酸素産生を検出します。広く使用されている活性酸素の蛍光測定は悪名高く問題となる、具体的でない細胞増殖刺激による活性酸素の測定に関して特に。マクロファージの生成、プライミング、染色、FcγR 架橋、およびフローサイトメトリーによる解析で終わるで始まる特定の FcγR 刺激の結果として生成された ROS を検出する詳細な方法論を提案します。

記載されているプロトコルを使用して、FcγR を介して WT c57bl/6 j BMDMs の刺激から生じる活性酸素産生の流れフローサイトメトリー検出を示す代表的なデータを提案する.予想通り、FL1 または FL2 蛍光処理細胞でのバック グラウンド レベルの上で最小限の変更を遵守 (図 3 a、「ステンド グラス、些細」対「無染色、些細」ドット プロットを比較)。FcγR 架橋剤 (<strong class="...

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Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃƒÅ½Ã‚Â³R Cross-linking

本研究は、フローサイトメトリー、FcγR の活性化から生じる活性酸素種 (ROS) 生産を検出するための使用方法を示します。このメソッドは、抗菌および酸化還元シグナル免疫複合体、微生物のオプソニン、または直接 FcγR 架橋への応答で食細胞の機能の変化を評価するために使用することができます。

FcγR 架橋への応答におけるマクロファージの活性酸素産生の流れフローサイト メーターによる測定

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...

活性酸素種またはROSの測定は、悪名高い問題です。本ビデオでは、蛍光プローブとフローサイトメトリーを用いたFC-γ受容体架橋に対するROSの再現性測定について説明します。この技術の主な利点は、測定の再現性と、特定の抗原刺激を用いたこの方法の使用であり、マイトゲンまたは既知のROS誘導体だけではない。不秩序なROSの生産は、慢性肉芽腫症やCGDなどの多くの疾患の発症の中心である。ROSを正確に測定すると、CGDの分子診断の一部を構成する可能性があります。FC媒介ROS産生の研究は、CGDなどの免疫不全を研究する上で重要であるが、ROSが多すぎると酸化ストレスや炎症を引き起こす自己免疫疾患や神経変性疾患の研究においても重要である。アッセイのタイミングは非常に重要です。私は、このプロトコルを初めて試してみて、徹底的に準備し、可能であれば模擬実験を行うことを勧める。この方法の視覚的な実証は、アッセイのタイミングなど特に注意を必要とするアッセイのステップを強調するために重要である。まず、付属のテキストプロトコルに記載されているように、条件付きメディアを使用して骨髄由来マクロファージを調製する。マクロファージを一晩プライミングした後、上清を吸引し、PBSで細胞を一度洗う。血清は、低血清DMEMの同じ体積で培地を交換することにより、細胞を飢えさせる。各マウスについて、1つのプレートは抗BSA IgG1で処理され、もう一方は残して、もう一方は飢餓状態になります。未処理のプレートにのみ低血清DMEMを加え、処理されたプレートにマウス抗BSA IgG1の1ミリリットル当たり2.5マイクログラムを含む低血清DMEMを加えます。各実験がフローサイトメトリック補償制御として機能する場合は、1 つの追加の未処理プレートを含めます。プレートを摂氏37度、5%CO2で4時間インキュベートします。4時間のインキュベーション中に、活性酸素種プローブの2倍溶液を調製する。必要な低血清DMEMの10ミリリットルごとに、酸化ストレス検出試薬4マイクロリットルとスーパーオキシド検出試薬4マイクロリットルを追加します。次いで、酸化ストレス検出試薬のみを含む、またはスーパーオキシド検出試薬のみを含有する2Xプローブ溶液を調製する。4時間のインキュベーションの後、プレートをそっと削り取って細胞を収穫し、ラベル付けされた5ミリリットルの丸底チューブに集めます。チューブを750回gで5分間遠心分離する。マウス抗BSA IgG1で処理された細胞を必ず追跡してください。次に、細胞ペレットを2ミリリットルのPBSで洗浄し、処理した細胞から残った抗BSAを取り除きます。チューブを750回gで5分間遠心分離する。次いで、PBSを吸引し、低血清DMEMの600マイクロリットルで細胞ペレットを再懸濁する。600マイクロリットルの細胞懸濁液から、アリコート200マイクロリットルは、あらかじめラベル付けされた5ミリリットルのラウンドボトムチューブに入った。未処理の細胞から、無刺激で標識されたチューブに対して200マイクロリットル、陽性誘導体と標識されたチューブに対して200マイクロリットル、プラスインデューサープラスインヒビターと標識されたチューブに対して200マイクロリットルを取る。次いで、抗BSA IgG1処理細胞から、FC-γ受容体架橋と標識されたチューブに対して200マイクロリットル、FC-γ受容体架橋プラス阻害剤と標識したチューブに対して200マイクロリットルを取る。補償制御に使用する未処理の細胞から、無刺激で染色されたチューブに対して200マイクロリットル、緑色プラスインデューサーコントロール用に200マイクロリットル、オレンジプラスインデューサーコントロールに200マイクロリットルを取ります。ピオシアニンを1~100の各2Xプローブ溶液に500マイクロモルの濃度に希釈して2X陽性誘導剤溶液を調製する。次いで、2Xプローブ溶液中のBSAストック溶液を希釈して2X BSA溶液を調製し、1ミリリットル当たり2マイクログラムの2倍濃度を得た。FC-γ受容体架橋などの特異的刺激を開始する前に、試薬と細胞の準備ができていることを確認し、刺激される順序でチューブを氷の上に置きます。オートサンプラーを使用したフローサイトメーターの場合、サイトメーターがサンプルを分析して次のサンプルに進むためにかかる時間をメモします。混合とプローブ洗浄のステップを必ず含めます。このアッセイにとってタイミングは非常に重要です。すべての状態を十分に制御するためには、各条件に対して正確に30分で刺激を行う必要があります。順番に細胞を刺激し、フローサイトメーターによるサンプル取得間のラグタイムを組み込みます。この時点で手動補償を行う場合、酸化ストレス検出試薬とインデューサを含む200マイクロリットルの200マイクロリットルを緑色プラスインデューサーとマークされたチューブに加えて補償に使用する制御チューブを刺激する。次に、スーパーオキシド検出試薬とインデューサを含む200マイクロリットルの2Xプローブ溶液をオレンジプラスインデューサーとマークされたチューブに加える。暗闇の中で30分間細胞をインキュベートします。フローサイトメトリーソフトウェアを使用して、制御用の3つのサンプルファイルを生成し、未処理、緑色プラスインデューサー、およびオレンジプラスインデューサーサンプルを生成し、分析するチャネルとパラメータを示すことを確認します。また、目的の停止条件を入力します。コントロールサンプルを設定したら、実験サンプル用の同様のファイルセットを生成し、ラベルを付けます。次に、未染色の未処理サンプルを実行します。X 軸上の前方散布と Y 軸上の側の散布のドット プロットを開き、死んだセルや破片を除く目的のセルの周囲にゲートを描画します。次に、このセルのゲートを使用して、X軸上の第1の蛍光マーカーFL1の別のドットプロットを開き、第2の蛍光マーカーFL2をY軸に開きます。最初の象限ゲートを描画し、イベントが FL1 と FL2 プロットの左下の象限に表示されるように、象限ゲートを調整します。完了したら、緑色のプラス誘導サンプルを実行します。FL1 プロットと FL2 プロットの左下および右象限にイベントが表示されるように、電圧を調整します。次に、この補正マトリックスを 3 つのサンプル ファイルすべてに適用します。オレンジ色のプラス誘導サンプルを実行します。FL1 プロットと FL2 プロットの左下の領域にイベントが表示されるように電圧を調整し、この補正マトリックスを 3 つのサンプル ファイルすべてに適用します。各補正ファイルを確認し、左下象限に未染色の未処理イベントが表示され、緑と誘導子のイベントが左下および右象限に表示され、オレンジ色の加えた誘導子イベントが FL1 と FL2 プロットの左上および下方象限に表示されることを確認します。次に、すべての実験サンプルファイルに補償行列を適用する。手動補正が実行され、実験テンプレートが取得されたら、実験サンプルに移ります。陽性誘導体で細胞を治療するか、FC-γ受容体細胞刺激を行う前に、どのチューブがROS阻害剤を得るかをマークする。陽性誘導体またはFC-γ受容体刺激の少なくとも30分前に、5ミリモルの最終濃度のために再懸濁細胞の200マイクロリットルに1マイクロリットルを加えることによって、ROS阻害剤でこれらの細胞を治療する。非刺激細胞の場合、200マイクロリットルの細胞懸濁液に刺激を加えることなく2Xプローブ溶液で細胞を処理し、染色され、刺激を受けていないとラベル付けした細胞懸濁液を添加する。陽性コントロールの場合、2X陽性誘導体溶液の200マイクロリットルを陽性誘導体または陽性誘導因子プラス阻害剤と標識した細胞懸濁液の200マイクロリットルで細胞を治療する。最後に、FC-γ受容体架橋によって刺激された細胞については、FC-γ受容体架橋またはFC-γ受容体架橋プラス阻害剤と標識した細胞懸濁液の200マイクロリットルに200マイクロリットルの200マイクロリットルを添加してそれらを処理する。暗闇の中で30分間細胞をインキュベートします。インキュベーション後、初期補償ステップ中に生成されたフローサイトメーターと分析テンプレートを使用して、刺激された順にサンプルを分析します。ここに示すデータは、FC-γ受容体を介したマクロファージの刺激に起因する活性酸素種産生のフローサイトメトリック検出を示す。細胞がFC-γ受容体架橋剤で刺激されると、FL1およびFL2蛍光が顕著に増加する。細胞がFC-γ受容体架橋前に活性酸素種阻害剤で処理された場合、この増加した蛍光は基底レベルに戻される。対照的に、これらのドットプロットは、FC-γ受容体刺激の結果として最適以下の活性酸素種産生が観察された、失敗した実験を提示する。期待されるパーセンテージの大きな違いを強調するために、またはMFIが増加する、このデータは、FL1およびFL2蛍光の最小の増加を伴うサンプルがどのようなものであるかを示す。現在のプロトコルは、24 時間のプライミング ステップを使用します。24時間対48時間のプライミング時間を比較した場合、緑色酸化ストレス試薬に対する細胞陽性の割合に顕著な差はなかった。しかし、プライミング時間を48時間に増やすことは、オレンジ色の蛍光に対する陽性細胞の割合を増加させた。この手順を実行する際に覚えておくべき最も重要なことは、事前に計画し、再現可能な結果を得るためにアッセイのタイミングについて一貫することです。

Research

JoVE Journal

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