Name: flow cytometric measurement of ros production in macrophages in response to fc&#947;r cross-linking
Uploaded: 2019-03-07T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃŽÂ³R Cross-linking at JoVE.com

Forfatterne vil gjerne takke andre medlemmer av det Tigno-Aranjuez inkludert Madelyn H. Miller, Omar Cardona, Andjie Jeudy og Roopin Singh for deres hjelp i laboratoriet vedlikehold og mus kolonien vedlikehold. Støtte for denne forskningen ble levert av grant R00 HL122365 og oppstart midler til J.T.T-A.

Protokollen for dyr håndtering ble godkjent av institusjonelle Animal Care og bruk committee (IACUC) av University of Central Florida.
1. generasjon av benmarg avledet makrofager (BMDMs)
<ol><li>
Kultur medier forberedelse
	<ol>
<li>Forberede D10F base media: Å Dulbeccos endret Eagle Medium (DMEM), legge til 10% varme inaktivert fosterets bovin serum (FBS), 1 mM natrium pyruvate, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syre (HEPES) og 0.05 mM β-mercaptoethanol...

<ol>
	<li>Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+Oxygen+Species+and+Neutrophil+Function.">Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).</li><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress.">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).</li><li>Robinson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+in+phagocytic+leukocytes.">Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).</li><li>Thomas, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phagocyte+respiratory+burst:+Historical+perspectives+and+recent+advances.">The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances.</a> Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).</li><li>Fang, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+actions+of+reactive+oxygen+species.">Antimicrobial actions of reactive oxygen species.</a> MBio. 2 (5), (2011).</li><li>Iles, K. E., Forman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+signaling+and+respiratory+burst.">Macrophage signaling and respiratory burst.</a> Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).</li><li>Curnutte, J. T., Whitten, D. M., Babior, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+superoxide+production+by+granulocytes+from+patients+with+chronic+granulomatous+disease.">Defective superoxide production by granulocytes from patients with chronic granulomatous disease.</a> New England Journal of Medicine. 290 (11), 593-597 (1974).</li><li>Good, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatal+(chronic)+granulomatous+disease+of+childhood:+a+hereditary+defect+of+leukocyte+function.">Fatal (chronic) granulomatous disease of childhood: a hereditary defect of leukocyte function.</a> Seminars in Hematology. 5 (3), 215-254 (1968).</li><li>Holmes, B., Page, A. R., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+the+metabolic+activity+of+leukocytes+from+patients+with+a+genetic+abnormality+of+phagocytic+function.">Studies of the metabolic activity of leukocytes from patients with a genetic abnormality of phagocytic function.</a> Journal of Clinical Investigation. 46 (9), 1422-1432 (1967).</li><li>Windhorst, D. B., Page, A. R., Holmes, B., Quie, P. G., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pattern+of+genetic+transmission+of+the+leukocyte+defect+in+fatal+granulomatous+disease+of+childhood.">The pattern of genetic transmission of the leukocyte defect in fatal granulomatous disease of childhood.</a> Journal of Clinical Investigation. 47 (5), 1026-1034 (1968).</li><li>Dikalov, S. I., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species.">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).</li><li>Held, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Reactive+Oxygen+Species:+Measurement+of+ROS+in+cells.">An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in cells.</a> White Paper. , (2015).</li><li>Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+reactive+oxygen+species+measurement+in+biological+systems.">Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).</li><li>Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2',7'-Dichlorodihydrofluorescein+as+a+fluorescent+probe+for+reactive+oxygen+species+measurement:+Forty+years+of+application+and+controversy.">2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy.</a> Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).</li><li>Zielonka, J., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroethidine-+and+MitoSOX-derived+red+fluorescence+is+not+a+reliable+indicator+of+intracellular+superoxide+formation:+another+inconvenient+truth.">Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).</li><li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification+and+labeling+of+mouse+bone+marrow+neutrophils+for+functional+studies+and+adoptive+transfer+experiments.">Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).</li></ol>

DCFH2-DA og DHE-basert oppdagelsen av ROS er en brukte teknikken14,15. Brukervennlighet og tilpasningsevne disse ROS sonder for kinetisk microplate formater, fluorescens mikroskopi eller flow cytometric analyse har bidratt til deres popularitet. Men i våre studier av FcγR-mediert macrophage funksjoner synes det ikke å være en standardprotokoll for å utføre denne analysen for flyt cytometric analyse av FcγR krysskoblet celler. Gitt den reaktive n...

Reaktive oksygen arter (ROS) er reaktive molekyler eller frie radikaler som er biprodukter i aerobic åndedrett (omtalt i 1). Disse inkluderer den superoxide anion peroxide, hydrogen peroxide, hydroksyl radikale og hydroksyl ioner, blant andre. Under normale fysiologiske, ROS produseres hovedsakelig av mitokondrier og nikotinamid adenine dinucleotide fosfat (NADPH) oxidases og er raskt detoxified av ulike enzymer og proteiner som superoxide dismutase og glutation. En overdreven produksjon av ROS eller feil kan fjerne ROS kan føre oksidativt stress, der frie radikaler fremme skade av proteiner og lipider DNA som fører til mobilnettet stress eller død og patologisk sykdomstilstander. Men er det for tiden verdsatt at ROS kan også fungere som signalnettverk molekyler (redoks signalisering), og ROS-mediert endring av ulike molekyler og veien mellomprodukter kan påvirke cellenes stoffskifte, spredning, overlevelse, inflammatorisk signalisering og aldring2. Phagocytic cellene: ROS spiller en viktig rolle i å gi antimikrobielle aktivitet under såkalte "åndedretts brast"1,3,4,5,6. Under responsen av phagocytes på eksterne stimuli translocate komponenter i den NADPH oksidase komplekse (p40phox, p47phox, p67phox) fra stoffer til phagosomal membranen som inneholder gp91phox og p22phox tenkes, og sammen med handlinger Rac1/2, en fullt funksjonell NADPH oksidase enzym komplekse. Den sammensatte NADPH oksidase benytter deretter NADPH for å redusere oksygen til superoxide innen den phagosomal vacuole. Superoxide anioner kan direkte forårsake skade eller bli dismutated i hydrogenperoksid. Både superoxide og hydrogen peroxide kan reagere med andre molekyler å generere svært reaktive hydroksylradikaler. Skade er formidlet av reaksjonen av disse ROS med jern-svovel klynger på proteiner eller forårsaker base oksidasjon av DNA, slutt fører til begrenset mikrobiell metabolisme eller død av mikrobe5. Betydningen av NADPH oksidase enzym komplekse og ROS produsert under respiratory utbrudd illustreres klinisk hos pasienter med kronisk granulomatøs sykdom (CGD)7,8,9, 10. personer med CGD har mutasjoner i gp91phox, noe som resulterer i mangel på ROS produksjon og mottakelighet for tilbakevendende infeksjoner med bakterier og sopp som ikke vanligvis er et problem med immunkompetente personer. Derfor om studere oksidativt stress, redox signalering eller vert forsvar, å kunne måle er ROS produksjon i sanntid en nyttig oppgave.
Flere analyser har vært benyttet til mål ROS produksjon eller resultatet av oksidativt stress11,12,13. Blant disse er en av de mest brukte lysstoffrør sonde 2, 7' dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH2-DA)14. Dette molekylet er fargeløs og lipofile. Spredningen av DCFH2-DA over cellemembranen kan det følges av intracellulær esterases, som deacetylates det i DCFH2, gjengi det celle ugjennomtrengelig. Handlingene til flere typer ROS (hydrogenperoksid, peroxynitrite, hydroksylradikaler, nitrogenoksid og peroxy radikaler) på DCFH2 oksidere det i DCF som er fluorescerende (rapporterte Ex / Em: 485-500 nm/515-530 nm) og kan oppdages ved hjelp av en flyt cytometer utstyrt med en standard filtersettet for fluorescein (FL1-kanal). Superoxide reagerer ikke sterkt med DCFH2 , men kan reagere med en annen sonde dihydroethidium (DHE) å gi fluorescerende produkt 2-hydroxyethidium (samt andre fluorescerende superoxide uavhengig oksidasjonsprodukter)15. Fluorescerende produkter av DHE oksidasjon kan oppdages ved hjelp av en eksitasjon bølgelengden til 518 nm og et utslipp bølgelengden til 605 nm (FL2 kanal). Selv om det er relativt enkel å bruke, krever utnyttelse av disse sonder deteksjon av ROS kunnskap om sine begrensninger og forsiktig innlemmelse av flekker prosedyrer og kontroller i bestemte analysen utføres for å ha gyldig eksperimentell resultater og konklusjoner. Følgende protokollen demonstrerer bruken av en kommersielt tilgjengelig kit ansette disse 2 sonder laget for å måle ROS av flowcytometri. Vi flekken primet Ben margtransplantasjon-avledet makrofager med disse sonder og indusere ROS produksjon gjennom FcγR cross-linking. Vi presenterer representant data innhentet bruker denne protokollen og stress forsiktighetsregler som må foretas for vellykket eksperimentering.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:623px;" width="623">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-BSA IgG1</td>
			<td style="width:121px;">Innovative Research</td>
			<td style="width:119px;">IBSA9E2C2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-mouse CD16/32</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:121px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">565853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">123108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647&#160;</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">101218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">beta-mercaptoethanol (BME)</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M3148-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">C57BL/6J&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Jackson labs</td>
			<td>Stock No.000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CM-H2DCFDA</td>
			<td style="width:121px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">C6827</td>
			<td>Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dihydroethidium (DHE)</td>
			<td style="width:121px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">D11347</td>
			<td>Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM 1x</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM no phenol red</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31053-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMF Anhydrous&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">61094-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FITC Rat IgG2a, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L glutamine</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LADMAC cells</td>
			<td style="width:121px;">ATCC</td>
			<td>CRL-2420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MEM</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mouse IFN-g</td>
			<td style="width:121px;">GoldBio</td>
			<td style="width:119px;">1360-06-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td style="width:121px;">EMD Milipore</td>
			<td style="width:119px;">106425</td>
			<td>Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Novocyte flow cytometer with autosampler</td>
			<td style="width:121px;">Acea</td>
			<td style="width:119px;">2060R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pyocyanin (ROS inducer)</td>
			<td style="width:121px;">Cayman chemical</td>
			<td style="width:119px;">10009594</td>
			<td>Can be a substitute for inducer in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ROS-ID total ROS/superoxide detection kit</td>
			<td style="width:121px;">ENZO</td>
			<td style="width:119px;">ENZ-51010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium pyruvate (100mM)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric measurement of ros production in macrophages in response to fc&#947;r cross-linking

Oksidativt eller respirasjonssykdommer utbrudd brukes til å beskrive raske forbruket av oksygen og generasjon av reaktive oksygen arter (ROS) av phagocytes svar på ulike immun stimuli. ROS genereres under immun aktivisering utøver potente antimikrobielle aktivitet primært gjennom evne til ROS å skade DNA og proteiner, forårsaker død av mikroorganismer. Å kunne måle ROS produksjon reproduserbar og Peterkirken er nødvendig for å vurdere bidrag av ulike veier og molekyler til denne mekanismen av vert forsvar. I dette papiret, vi demonstrerer bruken av fluorescerende sonder og flow cytometri for å oppdage ROS produksjon. Selv om mye brukt, er fluorescerende måling av ROS svært problematisk, særlig med hensyn til måling av ROS av bestemt og ikke mitogenic stimuli. Vi presenterer en detaljert metodikk for å oppdage ROS generert spesiell FcγR stimulering med macrophage generasjon grunning, flekker, FcγR cross-linking og slutter med flyt cytometric analyse.

Bruker protokollen skissert innen, presentere vi representant data viser flyt cytometric påvisning av ROS produksjon skyldes stimulering av WT C57BL/6J BMDMs gjennom FcγR. Som forventet, vi observerer minimale endringer i FL1 eller FL2 fluorescens over bakgrunnen nivå i unstimulated celler (figur 3A, sammenligne "farget, unstimulated" vs "unstained kvinne, unstimulated" dot tomter). Vi observerer en markant økning i FL1 og FL2 fluorescens når celler blir stimulert med FcγR cross-linkin...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃŽÂ³R Cross-linking at JoVE.com

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃƒÅ½Ã‚Â³R Cross-linking

Denne studien demonstrerer bruken av flowcytometri å oppdage reaktive oksygen arter (ROS) produksjon skyldes aktivering av FcγR. Denne metoden kan brukes til å vurdere endringer i antimikrobielle og redoks signalnettverk funksjon av phagocytes immun komplekser, opsonized mikroorganismer eller direkte FcγR cross-linking.

Cytometric måling av ROS produksjon i makrofager som svar på FcγR Cross-linking

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...

Måling av reaktive oksygenarter eller ROS er notorisk problematisk. I denne videoen vil vi demonstrere reproduserbar måling av ROS som svar på FC-gamma reseptor krysskobling ved hjelp av fluorescerende sonder og strømningscytometri. De viktigste fordelene med denne teknikken er reproduserbarheten av analysen og bruken av denne metoden med spesifikke antigene stimuli, ikke bare mitogener eller kjente ROS-induktorer.Dysregulert ROS-produksjon er sentralt i utviklingen av mange sykdommer som kronisk granulomatøs sykdom eller CGD. Nøyaktig måling av ROS kan utgjøre en del av den molekylære diagnosen CGD. Studier av FC-mediert ROS-produksjon er viktig for å studere immundeklare sykdommer, som CGD, men også i å studere auto-immunsykdommer, eller nevrodegenerative sykdommer, hvor for mye ROS fører til oksidativt stress og betennelse.Tidspunktet for analysen er kritisk. Jeg vil råde noen prøver denne protokollen for første gang å forberede grundig og gjøre en mock eksperiment hvis mulig. Visuell demonstrasjon av denne metoden er avgjørende for å understreke trinnene i analysen som trenger spesiell oppmerksomhet, for eksempel tidspunktet for analysen.Til å begynne med kan du forberede benmargsavledede makrofager ved hjelp av berettede medier som beskrevet i den medfølgende tekstprotokollen. Etter priming makrofagene over natten, aspirerer overnatanten og vask cellene en gang med PBS. Serum sulter cellene ved å erstatte medier med samme volum av dmem i lavt serum.For hver mus vil en plate bli behandlet med anti-BSA IgG1 mens serum sulter mens den andre vil bli ubehandlet. Tilsett bare DMEM med lavt serum til de ubehandlede platene og tilsett DMEM med lavt serum som inneholder 2,5 mikrogram per milliliter murine anti-BSA IgG1 til de behandlede platene. Pass på å inkludere en ekstra ubehandlet plate for hvert eksperiment for å fungere som strømningscytokometriske kompensasjonskontroll.Inkuber platene fire timer ved 37 grader Celsius, 5%CO2. I løpet av den fire timer lange inkubasjonen forbereder du en 2X-løsning av de reaktive oksygenartsondene. For hver 10 milliliter dmem nødvendig med lavt serum, tilsett fire mikroliter av en oksidativt stressdeteksjonsreagens og fire mikroliter av en superoksiddeteksjonsreagens.Deretter klargjør du 2X-probeløsningene som bare inneholder oksidativt stressdeteksjonsreagens eller bare inneholder superoksiddeteksjonsreagensen. Etter den fire timer lange inkubasjonen høster du cellene ved å forsiktig skrape platene, samle dem i merkede, fem milliliter rundbunnede rør. Sentrifuger rørene på 750 ganger g i fem minutter.Sørg for å holde styr på hvilke celler som ble behandlet med murine anti-BSA IgG1. Deretter vasker du cellepellets med to milliliter PBS for å kvitte seg med eventuelle gjenværende anti-BSA fra de behandlede cellene. Sentrifuger rørene på 750 ganger g i fem minutter.Deretter aspirerer PBS og resuspend cellepellet i 600 mikroliter av lavserum DMEM. Fra 600-mikroliter celle suspensjon, aliquot 200 mikroliter inn i forhåndsmerkede fem milliliter runde bunn rør. Fra de ubehandlede cellene, ta 200 mikroliter for rørene merket ustimulert, 200 mikroliter for rørene merket positiv induktor, og 200 mikroliter for rørene merket positiv induktor pluss inhibitor.Deretter, fra anti-BSA IgG1 behandlede celler, ta 200 mikroliter for rør merket FC-gamma reseptor krysskobling, og 200 mikroliter for rør merket FC-gamma reseptor krysskobling pluss inhibitor. Fra de ubehandlede cellene som skal brukes til kompensasjonskontroller, ta 200 mikroliter for røret merket ustained ustimulert, 200 mikroliter for grønn pluss induktorkontroll og 200 mikroliter for oransje pluss induktorkontroll. Forbered en 2X positiv induktorløsning ved å fortynne pyocyaninen til 100 i hver av 2X-probeløsningene til en konsentrasjon på 500 mikromos.Deretter klargjør du en 2X BSA-løsning ved å fortynne BSA-lagerløsningen i 2X-probeløsningen for å oppnå en 2X-konsentrasjon på to mikrogram per milliliter. Før du starter den spesifikke stimuleringen, for eksempel FC-gamma reseptor krysskobling, må du kontrollere at alle reagenser og celler er klare og plassere rørene på is i den rekkefølgen de vil bli stimulert. For strømningscytometere med en autosampler, legg merke til tiden cytometeret tar for å analysere en prøve og gå videre til den neste.Sørg for å inkludere eventuelle blande- og sondevasktrinn. Timing er svært kritisk for denne analysen. For at hver betingelse skal være godt kontrollert, må stimuleringen utføres på nøyaktig 30 minutter for hver tilstand.Stimulere cellene i rekkefølge og innlemme forsinkelsestiden mellom prøveoppkjøp av strømningscytometeret. Hvis du utfører manuell kompensasjon på dette tidspunktet, stimulerer kontrollrørene som skal brukes til kompensasjon ved å legge til 200 mikroliter av 2X probeløsningen som inneholder oksidativt stressdeteksjonsreagens og induktoren i rørene merket grønt pluss induktor. Deretter legger du til 200 mikroliter 2X probeoppløsning som inneholder superoksiddeteksjonsreagensen og induktoren i rørene merket oransje pluss induktor.Inkuber cellene i 30 minutter i mørket. Ved hjelp av flytcytometriprogramvaren, generere og merke tre eksempelfiler for kontrollen, uoppfylt, ubehandlet, den grønne pluss induktoren og de oransje pluss induktorprøvene, og sørg for å indikere kanalene og parametrene som skal analyseres. Angi også ønskede stoppforhold.Når kontrolleksemplene er satt opp, genererer og merker du et lignende sett med filer for eksperimentelle prøver. Kjør den uoppbehandlede, ubehandlede prøven. Åpne et punktplott for fremoversp scatter på X-aksen versus sidesptrøen på Y-aksen og tegn en port rundt cellene av interesse, unntatt døde celler og rusk.Deretter bruker du denne cellens port til å åpne en annen prikkplott av den første fluorescensmarkøren, FL1, på X-aksen, versus den andre fluorescensmarkøren, FL2, på Y-aksen. Tegn en første kvadrantport og juster deretter kvadrantporten slik at hendelsene vises nederst til venstre på FL1 versus FL2-plottet. Når du er ferdig, kjør den grønne pluss induktorprøven.Juster spenningen slik at hendelsene vises nederst til venstre og høyre kvadranter av FL1 versus FL2-plottet. Deretter bruker du denne kompensasjonsmatrisen på alle tre eksempelfilene. Kjør nå den oransje plussduktorprøven.Juster spenningen slik at hendelsene vises på øvre og nedre venstre kvadranter av FL1 versus FL2-plottet, og bruk deretter denne kompensasjonsmatrisen på alle tre eksempelfilene. Kontroller hver kompensasjonsfil og sørg for at uoppbehandlede, ubehandlede hendelser vises på nedre venstre kvadrant, de grønne pluss induktorhendelsene vises nederst til venstre og høyre kvadranter, og de oransje pluss induktorhendelsene vises på øvre og nedre venstre kvadranter av FL1 versus FL2-plottet. Deretter bruker du kompensasjonsmatrisen på alle eksperimentelle eksempelfiler.Når manuell kompensasjon er utført og en eksperimentell mal er oppnådd, gå videre til eksperimentelle prøver. Før du behandler cellene med en positiv induktor eller gjennomfører FC-gamma reseptor cellestimulering, merk hvilke rør som vil få en ROS-hemmer. Behandle disse cellene med ROS-hemmeren minst 30 minutter før den positive induktor- eller FC-gammareseptorstimuleringen ved å tilsette en mikroliter av hemmeren til 200 mikroliter resuspended celler for en endelig konsentrasjon på fem millimolar.For ustimulerte celler, behandle cellene med 200 mikroliter av 2X sondeløsning uten stimulans lagt til 200 mikroliter av celle suspensjon merket farget, ustimulert. For positive kontroller, behandle cellene med 200 mikroliter av 2X positiv induktor løsning til 200 mikroliter av celle suspensjon merket positiv induktor eller positiv induktor pluss inhibitor. Til slutt, for celler stimulert av FC-gamma reseptor krysskobling, behandle dem med 200 mikroliter av 2X BSA løsning lagt til 200 mikroliter av cellen suspensjon merket FC-gamma reseptor krysskobling eller FC-gamma reseptor krysskobling pluss inhibitor.Inkuber cellene i 30 minutter i mørket. Etter inkubasjon analyserer du prøvene i den rekkefølgen de ble stimulert i, ved hjelp av strømningssytometeret og analysemalene som genereres under de første kompensasjonstrinnene. Dataene som vises her viser flyten cytometrisk påvisning av reaktiv oksygenarter produksjon som følge av stimulering av makrofager gjennom FC-gamma reseptoren.Det er en markert økning i FL1 og FL2 fluorescens når celler stimuleres med FC-gamma reseptor krysskoblingsmiddel. Når celler ble behandlet med den reaktive oksygenarthemmeren før FC-gamma reseptorkrysskobling, denne økte fluorescens bringes tilbake til basalnivåer. I motsetning, disse dot tomter presentere et mislykket eksperiment, hvor suboptimal reaktiv oksygen arter produksjon som følge av FC-gamma reseptor stimulering ble observert.For å fremheve de store forskjellene mellom de forventede prosentene, eller MFI øker, viser disse dataene hvordan prøver med en minimal økning i FL1 og FL2 fluorescens ser ut. Den nåværende protokollen benytter et 24-timers priming trinn. Når man sammenligner en 24-timers versus en 48-timers grunningstid, var det ingen markert forskjell i prosentandelen av celler som var positive for den grønne oksidative stressreagensen.Men å øke grunningstiden til 48 timer økte prosentandelen av celler som er positive for den oransje fluorescensen. Det viktigste å huske når du utfører denne prosedyren er planlegging fremover, og å være konsekvent om tidspunktet for analysen for å få reproduserbare resultater.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Analyse av oppløsningsmidlet Tilgjengelighet av cysteinrester på<em&gt; Mais rayado fino virus</em&gt; Viruslignende partikler produsert i<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; Planter og Cross-linking av peptider til VLP

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Ved hjelp av RNA-interferens for å undersøke det medfødte immunrespons i Musemakrofager

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

En enkel Flowcytometriske metode for å måle glukoseopptak og Glukose Transporter Expression for Monocyttnivåene subpopulasjoner i fullblod

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flowcytometrisk analyse av partikkelbundet Bet v 1 Allergen i PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flowcytometrisk analyse av Natural Killer Cell Lytisk aktivitet i humant fullblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolasjon av Salmonella typhimurium-som inneholder Phagosomes fra makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolasjon og In Vitro kultur Murine og menneskelig Alveolar makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Flow Cytometric Analyse av lymfocytt infiltrasjon i sentralnervesystemet under eksperimentell autoimmun encefalomyelitt

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...