Name: flow cytometric measurement of ros production in macrophages in response to fc&#947;r cross-linking
Uploaded: 2019-03-07T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃŽÂ³R Cross-linking at JoVE.com

Os autores gostaria de agradecer a outros membros do laboratório Tigno-Aranjuez incluindo Madelyn H. Miller, Omar Cardona, Andjie Jeudy e Roopin Singh por sua ajuda na manutenção de colônia de manutenção e rato de laboratório. Suporte para esta pesquisa foi fornecido por grant R00 HL122365 e fundos de start-up para J.T.T-A.

O protocolo para manuseio de animal foi aprovado pelo Comitê institucional Cuidado Animal e uso de (IACUC) da Universidade da Flórida Central.
1. geração de medula óssea derivada de macrófagos (BMDMs)
<ol><li>
Preparação de meios de cultura
	<ol>
<li>Preparar a mídia de base D10F: A de Dulbecco modificado águia médio (DMEM), adicionar inactivados por calor 10% de soro fetal bovino (FBS), piruvato de sódio 1 mM, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic ...

<ol>
	<li>Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+Oxygen+Species+and+Neutrophil+Function.">Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).</li><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress.">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).</li><li>Robinson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+in+phagocytic+leukocytes.">Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).</li><li>Thomas, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phagocyte+respiratory+burst:+Historical+perspectives+and+recent+advances.">The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances.</a> Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).</li><li>Fang, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+actions+of+reactive+oxygen+species.">Antimicrobial actions of reactive oxygen species.</a> MBio. 2 (5), (2011).</li><li>Iles, K. E., Forman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+signaling+and+respiratory+burst.">Macrophage signaling and respiratory burst.</a> Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).</li><li>Curnutte, J. T., Whitten, D. M., Babior, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+superoxide+production+by+granulocytes+from+patients+with+chronic+granulomatous+disease.">Defective superoxide production by granulocytes from patients with chronic granulomatous disease.</a> New England Journal of Medicine. 290 (11), 593-597 (1974).</li><li>Good, R. 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G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species.">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).</li><li>Held, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Reactive+Oxygen+Species:+Measurement+of+ROS+in+cells.">An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in cells.</a> White Paper. , (2015).</li><li>Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+reactive+oxygen+species+measurement+in+biological+systems.">Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).</li><li>Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2',7'-Dichlorodihydrofluorescein+as+a+fluorescent+probe+for+reactive+oxygen+species+measurement:+Forty+years+of+application+and+controversy.">2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy.</a> Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).</li><li>Zielonka, J., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroethidine-+and+MitoSOX-derived+red+fluorescence+is+not+a+reliable+indicator+of+intracellular+superoxide+formation:+another+inconvenient+truth.">Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).</li><li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification+and+labeling+of+mouse+bone+marrow+neutrophils+for+functional+studies+and+adoptive+transfer+experiments.">Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).</li></ol>

2-[NULL] de Diniz Melo e detecção baseada em DHE de ROS é uma técnica amplamente utilizada14,15. Facilidade de uso e a adaptabilidade destas sondas ROS para formatos de microplacas cinética, análise de fluorescência microscopia ou fluxo cytometric contribuiu para sua popularidade. No entanto, em nossos estudos de funções de macrófagos mediada por FcγR, lá não parecem ser um protocolo padrão para a realização deste ensaio para análise d...

Espécies reativas de oxigênio (ROS) são moléculas reativas ou radicais livres que são subprodutos da respiração aeróbia (revisto em 1). Estes incluem o anião superóxido, peróxido, peróxido de hidrogênio, radical hidroxila e íons de hidroxila, entre outros. Em condições fisiológicas normais, ROS são produzidos principalmente pelas mitocôndrias e oxidases de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) e são rapidamente desintoxicados por diversas enzimas e proteínas como a superóxido dismutase e glutationa. Uma produção exagerada de ROS ou um defeito na capacidade de remover ROS pode resultar em estresse oxidativo, no qual espécies reactivas de oxigénio promovem os danos de proteínas, lipídios e DNA, levando ao estresse celular ou morte e Estados de doença patológica. No entanto, atualmente é apreciado que ROS também pode atuar como moléculas sinalizadoras (sinalização redox), e mediada por ROS modificação de várias moléculas e via intermediários pode influenciar o metabolismo celular, proliferação, sobrevivência, inflamatória sinalização e envelhecimento2. Em células fagocíticas, ROS desempenha um papel essencial no fornecimento de atividade antimicrobiana durante a chamada "explosão respiratória"1,3,4,5,6. Durante a resposta dos fagócitos a estímulos externos, componentes da oxidase NADPH complexo (p40phox, p47phox, p67phox) translocar do citosol para a membrana phagosomal, que contém a gp91phox e p22phox subunidades, e juntamente com as ações do Rac1/2, formam um totalmente funcional NADPH oxidase complexo enzimático. A oxidase de NADPH montado então utiliza NADPH para reduzir o oxigênio ao superóxido dentro do vacúolo phagosomal. Ânions superóxido diretamente podem causar danos ou ser dismutated em peróxido de hidrogênio. Tanto o superóxido e o peróxido de hidrogênio podem reagir com outras moléculas para gerar radicais hidroxila altamente reativos. Dano é mediado por reação destas ROS com proteínas ferro-enxofre ou causando oxidação base de DNA, conduzindo finalmente ao metabolismo microbiano restrito ou morte do micróbio5. A importância da enzima oxidase NADPH complexa e ROS produzidos durante a explosão respiratória é ilustrado clinicamente em pacientes com doença granulomatosa crônica (CGD)7,8,9, 10. indivíduos com CGD possuem mutações em gp91phox, resultando em uma falta de produção de ROS e susceptibilidade a infecções com bactérias e fungos que normalmente não são uma preocupação com os indivíduos imunocompetentes. Portanto, se estudar oxidativo estresse, sinalização redox ou defesa do hospedeiro, sendo capaz de medir a produção de ROS em tempo real é um esforço útil.
Vários ensaios têm sido utilizados para a produção de ROS de medida ou os resultados do stress oxidativo11,12,13. Entre estes, um do mais amplamente utilizado é a sonda fluorescente 2', 7' dichlorodihydrofluorescein diacetato (Diniz Melo2-DA)14. Esta molécula é lipofílico e incolor. Difusão de Diniz Melo2-DA através da membrana celular permite a ser postas em prática por esterases intracelulares, que deacetylates-lo em Diniz Melo2, tornando-se células impermeáveis. As ações de vários tipos de ROS (peróxido de hidrogênio, peroxinitrito, radicais hidroxila, óxido nítrico e radicais de peróxido) na Diniz Melo2 -oxidam em DCF, que é fluorescente (relatado Ex / Em: 485-500 nm/515-530 nm) e pode ser detectada usando um fluxo citômetro equipado com um filtro padrão definido para fluoresceína (FL1 canal). Superóxido pode reagir com outra sonda dihydroethidium (DHE) para produzir o produto fluorescente 2-hydroxyethidium (bem como outros produtos de oxidação de superóxido independente fluorescente)15, mas não reage fortemente com Diniz Melo2 . Produtos de oxidação DHE fluorescentes podem ser detectados usando um comprimento de onda de excitação de 518 nm e um comprimento de onda de emissão de 605 nm (canal FL2). Embora relativamente simples de usar, a utilização de tais sondas para a deteção de ROS requer conhecimento de suas limitações e cuidadosa incorporação de coloração procedimentos e controles para o ensaio específico, sendo realizado a fim de ter válido experimental resultados e conclusões. O protocolo a seguir demonstra o uso de um kit disponível comercialmente, empregando estes 2 sondas projetadas para medir ROS por citometria de fluxo. Podemos manchar aprontados macrófagos derivados da medula óssea com estas sondas e induzir a produção de ROS através do cross-linking FcγR. Apresentamos dados representativos obtidos usando este protocolo e sublinhar as devidas precauções que devem ser empreendidas para experimentação bem sucedida.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:623px;" width="623">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-BSA IgG1</td>
			<td style="width:121px;">Innovative Research</td>
			<td style="width:119px;">IBSA9E2C2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-mouse CD16/32</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:121px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">565853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">123108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647&#160;</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">101218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">beta-mercaptoethanol (BME)</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M3148-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">C57BL/6J&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Jackson labs</td>
			<td>Stock No.000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CM-H2DCFDA</td>
			<td style="width:121px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">C6827</td>
			<td>Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dihydroethidium (DHE)</td>
			<td style="width:121px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">D11347</td>
			<td>Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM 1x</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM no phenol red</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31053-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMF Anhydrous&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">61094-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FITC Rat IgG2a, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L glutamine</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LADMAC cells</td>
			<td style="width:121px;">ATCC</td>
			<td>CRL-2420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MEM</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mouse IFN-g</td>
			<td style="width:121px;">GoldBio</td>
			<td style="width:119px;">1360-06-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td style="width:121px;">EMD Milipore</td>
			<td style="width:119px;">106425</td>
			<td>Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Novocyte flow cytometer with autosampler</td>
			<td style="width:121px;">Acea</td>
			<td style="width:119px;">2060R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pyocyanin (ROS inducer)</td>
			<td style="width:121px;">Cayman chemical</td>
			<td style="width:119px;">10009594</td>
			<td>Can be a substitute for inducer in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ROS-ID total ROS/superoxide detection kit</td>
			<td style="width:121px;">ENZO</td>
			<td style="width:119px;">ENZ-51010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium pyruvate (100mM)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric measurement of ros production in macrophages in response to fc&#947;r cross-linking

O burst oxidativo ou respiratório é usado para descrever o rápido consumo de oxigênio e a geração de espécies reativas de oxigênio (ROS) pelos fagócitos em resposta a vários estímulos imunes. ROS, gerados durante a ativação imune exerce potente atividade antimicrobiana, principalmente através da capacidade de ROS de danificar o DNA e proteínas, causando a morte de microorganismos. Ser capaz de medir a produção de ROS reproducibly e com facilidade é necessário a fim de avaliar a contribuição de vários caminhos e moléculas deste mecanismo de defesa do hospedeiro. Neste artigo, demonstramos a utilização de sondas fluorescentes e fluxo cytometry para detectar a produção de ROS. Apesar de amplamente utilizado, medição fluorescente de ROS é notoriamente problemática, especialmente com relação à medição de ROS induzida por estímulos específicos e não mitogênico. Apresentamos uma metodologia detalhada para detectar ROS gerada como resultado específico FcγR estimulação, começando com a geração de macrófagos, escorva, coloração, FcγR cross-linking e terminando com a análise de fluxo cytometric.

Usando o protocolo descrito dentro, apresentamos dados representativos, demonstrando a deteção de cytometric do fluxo de produção de ROS, resultante da estimulação da WT C57BL/6J BMDMs através da FcγR. Como esperado, observamos alterações mínimas na fluorescência FL1 ou FL2 acima dos níveis de fundo nas células unstimulated (Figura 3A, comparar "manchadas, unstimulated" vs "imaculado, unstimulated" ponto parcelas). Observamos um aumento na fluorescência FL1 e FL2, quando as c?...

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Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃƒÅ½Ã‚Â³R Cross-linking

Este estudo demonstra o uso da citometria de fluxo para detectar a produção de (ROS) de espécies reativas de oxigênio resultantes da ativação do FcγR. Esse método pode ser usado para avaliar as mudanças no antimicrobial e redox função dos fagócitos em resposta aos complexos imunes, opsonized microorganismos ou direto FcγR cross-linking de sinalização.

Fluxo Cytometric medição da produção de ROS em macrófagos em resposta a FcγR cross-linking

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...

A medição de espécies reativas de oxigênio ou ROS é notoriamente problemática. Neste vídeo, demonstraremos a medição reprodutível do ROS em resposta ao crosslinking do receptor FC-gama usando sondas fluorescentes e citometria de fluxo. As principais vantagens desta técnica são a reprodutibilidade do ensaio e o uso deste método com estímulos antigênicos específicos, não apenas mitogênios ou indutores ros conhecidos.A produção de ROS desregulada é central para o desenvolvimento de muitas doenças, como doenças granulomatosas crônicas ou CGD. Medir com precisão a ROS pode constituir uma parte do diagnóstico molecular de CGD. Estudar a produção de ROS mediada por FC é importante no estudo de imunodeficiências, como a CGD, mas também no estudo de doenças autoimunes, ou doenças neurodegenerativas, onde muito ROS leva ao estresse oxidativo e inflamação.O tempo do ensaio é crítico. Eu aconselharia alguém a tentar este protocolo pela primeira vez para se preparar completamente e fazer um experimento simulado, se possível. A demonstração visual deste método é fundamental para enfatizar as etapas do ensaio que precisam de atenção especial, como o tempo do ensaio.Para começar, prepare os macrófagos derivados da medula óssea usando meios de comunicação condicionados, conforme descrito no protocolo de texto que acompanha. Depois de preparar os macrófagos durante a noite, aspire o supernasce e lave as células uma vez com PBS. O soro esflou as células substituindo a mídia pelo mesmo volume de DMEM de baixo soro.Para cada rato, uma placa será tratada com anti-BSA IgG1 enquanto o soro passa fome enquanto o outro não será tratado. Adicione apenas DMEM de baixo soro às placas não tratadas e adicione DMEM de baixo soro contendo 2,5 microgramas por mililitro de murine anti-BSA IgG1 às placas tratadas. Certifique-se de incluir uma placa não tratada adicional para cada experimento para agir como o controle de compensação citométrica de fluxo.Incubar as placas quatro horas a 37 graus Celsius, 5% de CO2. Durante a incubação de quatro horas, prepare uma solução 2X das sondas reativas da espécie de oxigênio. Para cada 10 mililitros de DMEM de baixo soro necessários, adicione quatro microliters de um reagente oxidativo de detecção de estresse e quatro microliters de um reagente de detecção de superóxido.Em seguida, prepare as soluções da sonda 2X contendo apenas o reagente oxidativo de detecção de estresse ou contendo apenas o reagente de detecção de superóxido. Após a incubação de quatro horas, colde as células raspando suavemente as placas, coletando-as em tubos de fundo redondo de cinco mililitros. Centrifugar os tubos a 750 vezes g durante cinco minutos.Certifique-se de acompanhar quais células foram tratadas com murine anti-BSA IgG1. Em seguida, lave as pelotas celulares com dois mililitros de PBS para se livrar de qualquer anti-BSA residual das células tratadas. Centrifugar os tubos a 750 vezes g durante cinco minutos.Em seguida, aspire o PBS e resuspenja a pelota celular em 600 microliters de DMEM de baixo soro. A partir da suspensão celular de 600 microliteres, alíquota de 200 microliters nos tubos de fundo redondo pré-rotulados de cinco mililitros. Das células não tratadas, pegue 200 microliters para os tubos rotulados sem estimulação, 200 microliters para os tubos rotulados como indutores positivos, e 200 microliters para os tubos rotulados como indutor positivo mais inibidor.Em seguida, das células tratadas anti-BSA IgG1, pegue 200 microliters para tubos rotulados de crosslinking do receptor FC-gama, e 200 microliters para tubos rotulados fc-gama receptor crosslinking mais inibidor. Das células não tratadas a serem usadas para controles de compensação, pegue 200 microliters para o tubo rotulado sem manutenção não identificado, 200 microliters para o controle verde mais indutor, e 200 microlitres para o controle laranja mais indutor. Prepare uma solução de indutor positivo 2X diluindo a pyocyanina de 1 a 100 em cada uma das soluções de sonda 2X para uma concentração de 500 micromolar.Em seguida, prepare uma solução 2X BSA diluindo a solução de estoque BSA na solução de sonda 2X para obter uma concentração 2X de dois microgramas por mililitro. Antes de iniciar a estimulação específica, como o crosslinking do receptor FC-gama, certifique-se de que todos os reagentes e células estejam prontos e coloque os tubos no gelo na ordem em que serão estimulados. Para citómetros de fluxo com um autosampler, anote o tempo que o cítmetro leva para analisar uma amostra e passar para a próxima.Certifique-se de incluir quaisquer etapas de mistura e lavagem de sondas. O tempo é muito crítico para este ensaio. Para que cada condição seja bem controlada, a estimulação precisa ser realizada em exatamente 30 minutos para cada condição.Estimule as células em ordem e incorpore o tempo de defasagem entre as aquisições amostrais pelo citômetro de fluxo. Se realizar compensação manual neste momento, estimule os tubos de controle a serem usados para compensação adicionando 200 microliters da solução da sonda 2X contendo o reagente oxidativo de detecção de estresse e o indutor nos tubos marcados verde mais indutor. Em seguida, adicione 200 microliters de solução de sonda 2X contendo o reagente de detecção de superóxido e o indutor nos tubos marcados laranja mais indutor.Incubar as células por 30 minutos no escuro. Utilizando o software de citometria de fluxo, gerar e rotular três arquivos de amostra para o controle, não identificado, não tratado, o indutor verde mais, e as amostras de indutor laranja plus, certificando-se de indicar os canais e parâmetros a serem analisados. Além disso, entre nas condições de parada desejadas.Uma vez configurados as amostras de controle, gere e rotule um conjunto semelhante de arquivos para as amostras experimentais. Agora, execute a amostra não tratada e não tratada. Abra um gráfico de pontos para dispersão para a frente no eixo X versus dispersão lateral no eixo Y e desenhe um portão ao redor das células de interesse, excluindo células mortas e detritos.Em seguida, use o portão desta célula para abrir outro gráfico de pontos do primeiro marcador de fluorescência, FL1, no eixo X, contra o segundo marcador de fluorescência, FL2, no eixo Y. Desenhe um portão do quadrante inicial e ajuste o portão do quadrante para que os eventos apareçam no quadrante inferior esquerdo da trama FL1 versus FL2. Quando terminar, execute a amostra verde mais indutor.Ajuste a tensão para que os eventos apareçam nos quadrantes inferior esquerdo e direito da trama FL1 versus FL2. Em seguida, aplique esta matriz de compensação em todos os três arquivos de amostra. Agora, execute a amostra laranja mais indutor.Ajuste a tensão para que os eventos apareçam nos quadrantes superior e inferior esquerdo da trama FL1 versus FL2 e, em seguida, aplique esta matriz de compensação em todos os três arquivos de amostra. Verifique cada arquivo de compensação e certifique-se de que eventos não tratados e não tratados apareçam no quadrante inferior esquerdo, os eventos de indutor verde mais aparecem nos quadrantes inferior esquerdo e direito, e os eventos de laranja mais indutor aparecem nos quadrantes superior e inferior esquerdo da trama FL1 versus FL2. Em seguida, aplique a matriz de compensação a todos os arquivos de amostra experimental.Uma vez realizada a compensação manual e um modelo experimental, passe para as amostras experimentais. Antes de tratar as células com um indutor positivo ou realizar estimulação celular receptor FC-gama, marque quais tubos receberão um inibidor ros. Trate essas células com o inibidor ROS pelo menos 30 minutos antes do indutor positivo ou estimulação do receptor FC-gama adicionando um microlitr do inibidor a 200 microliters de células resuspended para uma concentração final de cinco milimiliar.Para células não estimuladas, trate as células com 200 microliters da solução de sonda 2X sem qualquer estímulo adicionado aos 200 microliters de suspensão celular rotulados manchados, não estimulados. Para controles positivos, trate as células com 200 microlitres da solução indutora positiva 2X para 200 microlitres de suspensão celular rotulados como indutor positivo ou inibidor positivo mais inibidor. Finalmente, para células estimuladas pelo crosslinking do receptor FC-gama, trate-as com 200 microliters da solução 2X BSA adicionadas a 200 microliters da suspensão celular rotulada fc-gama receptor crosslinking ou receptor FC-gama crosslinking plus inibidor.Incubar as células por 30 minutos no escuro. Após a incubação, analise as amostras na ordem em que foram estimuladas, utilizando o citômetro de fluxo e os modelos de análise gerados durante as etapas iniciais de compensação. Os dados aqui mostrados demonstram a detecção citométrica de fluxo da produção de espécies reativas de oxigênio resultante da estimulação de macrófagos através do receptor FC-gama.Há um aumento acentuado na fluorescência FL1 e FL2 quando as células são estimuladas com o agente de crosslinking do receptor FC-gama. Quando as células foram tratadas com o inibidor reativo da espécie oxigênio antes do crosslinking do receptor FC-gama, esse aumento da fluorescência é trazido de volta aos níveis basais. Em contraste, essas parcelas de pontos apresentam um experimento mal sucedido, onde foi observada a produção de espécies de oxigênio reativa subótimo como resultado da estimulação do receptor FC-gama.Para destacar as grandes diferenças entre os percentuais esperados, ou aumentos de IMFI, esses dados mostram como são as amostras com um aumento mínimo da fluorescência FL1 e FL2. O protocolo atual utiliza uma etapa de escoramento de 24 horas. Ao comparar um tempo de 24 horas versus 48 horas de escoramento, não houve diferença acentuada na porcentagem de células positivas para o reagente de estresse oxidativo verde.No entanto, o aumento do tempo de escoramento para 48 horas aumentou a porcentagem de células positivas para a fluorescência laranja. As coisas mais importantes a serem lembradas ao realizar este procedimento é planejar com antecedência, e ser consistente sobre o tempo do ensaio para obter resultados reprodutíveis.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Fluxo multicolor de Citometria de Análises de resposta imune celular em macacos rhesus

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Imunologia e Infecção

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

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Medição quantitativa da resposta imune e do sono em<em&gt; Drosophila</em

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