Name: flow cytometric measurement of ros production in macrophages in response to fc&#947;r cross-linking
Uploaded: 2019-03-07T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃŽÂ³R Cross-linking at JoVE.com

Авторы хотели бы поблагодарить других членов Tigno-Аранхуэс лаборатории, включая Madelyn Миллер, Омар Кардона, Andjie Jeudy и Roopin Сингха за их помощь в лабораторной мыши и ведением колонии обслуживания. Была оказана поддержка для этого исследования Грант R00 HL122365 и начальных средств для J.T.T-A.

Протокол для обработки животных был одобрен институциональный уход животных и использования Комитет (IACUC) из университета Центральной Флориды.
1. поколение костного производные макрофагов (BMDMs)
<ol><li>
Подготовка Культура СМИ
	<ol>
<li>Подготовить D10F базы СМИ: чтобы Д?...

<ol>
	<li>Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+Oxygen+Species+and+Neutrophil+Function.">Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).</li><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress.">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).</li><li>Robinson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+in+phagocytic+leukocytes.">Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).</li><li>Thomas, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phagocyte+respiratory+burst:+Historical+perspectives+and+recent+advances.">The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances.</a> Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).</li><li>Fang, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+actions+of+reactive+oxygen+species.">Antimicrobial actions of reactive oxygen species.</a> MBio. 2 (5), (2011).</li><li>Iles, K. E., Forman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+signaling+and+respiratory+burst.">Macrophage signaling and respiratory burst.</a> Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).</li><li>Curnutte, J. T., Whitten, D. M., Babior, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+superoxide+production+by+granulocytes+from+patients+with+chronic+granulomatous+disease.">Defective superoxide production by granulocytes from patients with chronic granulomatous disease.</a> New England Journal of Medicine. 290 (11), 593-597 (1974).</li><li>Good, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatal+(chronic)+granulomatous+disease+of+childhood:+a+hereditary+defect+of+leukocyte+function.">Fatal (chronic) granulomatous disease of childhood: a hereditary defect of leukocyte function.</a> Seminars in Hematology. 5 (3), 215-254 (1968).</li><li>Holmes, B., Page, A. R., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+the+metabolic+activity+of+leukocytes+from+patients+with+a+genetic+abnormality+of+phagocytic+function.">Studies of the metabolic activity of leukocytes from patients with a genetic abnormality of phagocytic function.</a> Journal of Clinical Investigation. 46 (9), 1422-1432 (1967).</li><li>Windhorst, D. B., Page, A. R., Holmes, B., Quie, P. G., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pattern+of+genetic+transmission+of+the+leukocyte+defect+in+fatal+granulomatous+disease+of+childhood.">The pattern of genetic transmission of the leukocyte defect in fatal granulomatous disease of childhood.</a> Journal of Clinical Investigation. 47 (5), 1026-1034 (1968).</li><li>Dikalov, S. I., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species.">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).</li><li>Held, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Reactive+Oxygen+Species:+Measurement+of+ROS+in+cells.">An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in cells.</a> White Paper. , (2015).</li><li>Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+reactive+oxygen+species+measurement+in+biological+systems.">Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).</li><li>Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2',7'-Dichlorodihydrofluorescein+as+a+fluorescent+probe+for+reactive+oxygen+species+measurement:+Forty+years+of+application+and+controversy.">2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy.</a> Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).</li><li>Zielonka, J., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroethidine-+and+MitoSOX-derived+red+fluorescence+is+not+a+reliable+indicator+of+intracellular+superoxide+formation:+another+inconvenient+truth.">Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).</li><li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification+and+labeling+of+mouse+bone+marrow+neutrophils+for+functional+studies+and+adoptive+transfer+experiments.">Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).</li></ol>

DCFH2-да и на основе DHE обнаружения рос является широко используется техника14,15. Простота использования и адаптации этих ROS зонды для кинетического Гонав форматов, флуоресцентной микроскопии или потока гранулярных анализа способствовала их популярн?...

Реактивнооксигенных видов (ров), реактивных молекул или свободные радикалы, которые являются побочными продуктами аэробного дыхания (обзор в 1). К ним относятся супероксид анион, пероксид, перекись водорода, Гидроксильная группа и гидроксильных ионов, среди других. В нормальных физиологических условиях Рось производятся главным образом в митохондриях и никотинамид аденин динуклеотид фосфат (NADPH) оксидазы и быстро обезвреженных различными ферментов и белков, таких как супероксиддисмутазы и глутатиона. Преувеличенные производства ROS или дефект в возможность удалять ROS может привести к окислительный стресс, whereby реактивнооксигенных видов содействия ущерб белки, липиды и ДНК, ведущих к клеточного стресса или государств патологических заболеваний и смерти. Однако она в настоящее время ценится, что рос может также выступать в качестве сигнальных молекул (редокс сигнализации), и рос опосредованной модификации различных молекул и промежуточных путь может влиять клеточный метаболизм, распространения, выживание, воспалительные сигнализации и старения2. Фагоцитирующих клеток Рось играет важную роль в предоставлении антимикробной активности во время так называемого «дыхательных взрыв»1,3,4,5,6. Во время реакции на внешние раздражители, фагоциты перемещают компоненты NADPH оксидаза комплекс (p40phox,phoxp47 p67phox) от цитозоль phagosomal мембраны, содержащий gp91phox и p22phox подразделения, и вместе с действиями Rac1/2, формируют полностью функциональный NADPH оксидаза ферментного комплекса. Затем собранный NADPH оксидаза использует NADPH сократить кислорода до супероксида в пределах phagosomal вакуоль. Супероксид анионов непосредственно может привести к повреждению или dismutated в перекиси водорода. Супероксиддисмутаза и перекись водорода может реагировать с другими молекулами для создания высокой реакционной способностью гидроксильных радикалов. Повреждение опосредовано реакции этих рос с железо серные кластеры на белки или вызывая базовый окисления ДНК, в конечном счете приводит к ограниченным микробного метаболизма или смерти Микроб5. Важность NADPH оксидаза ферментного комплекса и ROS, вырабатываемые в ходе дыхания всплеск иллюстрируется клинически у больных с хроническим гранулематозная болезнь (КГД)7,8,9, 10. лица с CGD имеют мутации в gp91phox, что приводит к отсутствию производства рос и восприимчивость к инфекции с бактериями и грибками, которые обычно не являются проблемой с иммунокомпетентных лиц. Таким образом изучения оксидативного стресса, редокс сигнализации или принимающей обороны, возможность измерить ROS производства в режиме реального времени является ли полезные усилия.
Несколько анализов были использованы для производства рос меру или результаты оксидативного стресса11,12,13. Среди них одной из наиболее широко используемым является флуоресцентный зонд 2', 7' dichlorodihydrofluorescein диацетата (DCFH2-DA)14. Эта молекула является бесцветным и липофильных. Распространение DCFH2-да через клеточную мембрану позволяет быть приняты внутриклеточных эстераз, который deacetylates в DCFH2, визуализации ячейки непроницаемыми. Действия нескольких типов Рось (перекись водорода, пероксинитрита, гидроксильных радикалов, оксид азота и перокси радикалы) на DCFH2 окислить его в DCF, который флуоресцентные (сообщил Ex / Em: 485-500 Нм/515-530 Нм) и может быть обнаружен с помощью потока цитометр оснащены стандартным фильтром Набор для флюоресцеином (значения параметров FL1 канал). Супероксид не сильно реагируют с DCFH2 , но может реагировать с другой зонд dihydroethidium (DHE) приносить флуоресцентные продукт 2-hydroxyethidium (а также других продуктов флуоресцентные супероксид независимые окисления)15. Флуоресцентный продуктов окисления DHE могут быть обнаружены с помощью волны возбуждения 518 Нм и длина волны излучения 605 Нм (FL2 канал). Хотя сравнительно прост в использовании, использование этих датчиков для обнаружения ROS требует знания их ограничений и тщательного включения окрашивания процедур и механизмов контроля в конкретных assay, выполняемой для того чтобы иметь действительный экспериментальной результаты и выводы. Следующий протокол демонстрирует использование коммерчески доступных комплект, используя эти 2 зонды, разработанный для измерения ROS проточной цитометрии. Мы пятно загрунтовать макрофагов, костного мозга, полученных этими датчиками и заставить ROS производства через FcγR сшивки. Мы представляем репрезентативных данных, полученных с помощью этого протокола и подчеркнуть соответствующие меры предосторожности, которые должны быть предприняты для успешного проведения экспериментов.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:623px;" width="623">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-BSA IgG1</td>
			<td style="width:121px;">Innovative Research</td>
			<td style="width:119px;">IBSA9E2C2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-mouse CD16/32</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:121px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">565853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">123108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647&#160;</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">101218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">beta-mercaptoethanol (BME)</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M3148-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">C57BL/6J&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Jackson labs</td>
			<td>Stock No.000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CM-H2DCFDA</td>
			<td style="width:121px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">C6827</td>
			<td>Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dihydroethidium (DHE)</td>
			<td style="width:121px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">D11347</td>
			<td>Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM 1x</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM no phenol red</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31053-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMF Anhydrous&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">61094-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FITC Rat IgG2a, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L glutamine</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LADMAC cells</td>
			<td style="width:121px;">ATCC</td>
			<td>CRL-2420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MEM</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mouse IFN-g</td>
			<td style="width:121px;">GoldBio</td>
			<td style="width:119px;">1360-06-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td style="width:121px;">EMD Milipore</td>
			<td style="width:119px;">106425</td>
			<td>Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Novocyte flow cytometer with autosampler</td>
			<td style="width:121px;">Acea</td>
			<td style="width:119px;">2060R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pyocyanin (ROS inducer)</td>
			<td style="width:121px;">Cayman chemical</td>
			<td style="width:119px;">10009594</td>
			<td>Can be a substitute for inducer in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ROS-ID total ROS/superoxide detection kit</td>
			<td style="width:121px;">ENZO</td>
			<td style="width:119px;">ENZ-51010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium pyruvate (100mM)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric measurement of ros production in macrophages in response to fc&#947;r cross-linking

Окислительная или дыхательных всплеск используется для описания быстрого потребления кислорода и поколение реактивнооксигенных видов (ров), фагоциты в ответ на различные стимулы иммунной. ROS, созданные во время иммунной активации оказывает мощный антимикробной активности, главным образом через Рось возможность повреждения ДНК и белков, вызывает гибель микроорганизмов. Будучи в состоянии измерить ROS производства можно воспроизвести и с легкостью необходимо для того, чтобы оценить вклад различных путей и молекул, чтобы этот механизм узла обороны. В этой статье мы продемонстрировать использование флуоресцентных зондов и проточная цитометрия обнаружить производства рос. Хотя широко используется, флуоресцентный измерение ROS крайне проблематичным, особенно в том, что касается измерения ROS, вызванных конкретными и не митогенный раздражителей. Мы представляем подробная методология для обнаружения рос в результате конкретных FcγR стимуляции, начиная с поколения макрофагов, грунтование, окрашивание, FcγR cross-linking и заканчивая гранулярных анализа потока.

С помощью протокола, изложенные в рамках, мы представляем репрезентативных данных, демонстрируя потока гранулярных обнаружение производства рос в результате стимуляции WT C57BL/6J BMDMs через FcγR. Как и ожидалось, мы наблюдаем минимальные изменения в значения параметров FL1 и FL2 флуоресценции ?...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃŽÂ³R Cross-linking at JoVE.com

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃƒÅ½Ã‚Â³R Cross-linking

Это исследование демонстрирует использование проточной цитометрии для обнаружения реактивнооксигенных видов (ров) производства в результате активации FcγR. Этот метод может использоваться для оценки изменений в противомикробные и сигнальные функции фагоцитов в ответ иммунные комплексы, опсонизированными микроорганизмов или прямого FcγR cross-linking окислительно-восстановительные.

Измерение расхода гранулярных производства рос в макрофагах в ответ на FcγR сшивки

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...

Измерение реактивных видов кислорода или ROS, как известно, проблематично. В этом видео мы продемонстрируем воспроизводимое измерение ROS в ответ на перекрестное скрещивание рецепторов FC-гамма с использованием флуоресцентных зондов и цитометрии потока. Основными преимуществами этого метода являются воспроизводимость анализа и использование этого метода с конкретными антигенными стимулами, а не только митогенами или известными индукторами ROS.Дисрегулируемое производство ROS имеет центральное значение для развития многих заболеваний, таких как хронические гранулематозные заболевания или CGD. Точное измерение ROS может составлять одну часть молекулярной диагностики CGD. Изучение производства FC-опосредованного ROS имеет важное значение в изучении иммунодефицитов, таких как CGD, но и в изучении аутоиммунного заболевания, или нейродегенеративных заболеваний, где слишком много ROS приводит к окислительному стрессу и воспалению.Сроки проведения анализа имеют решающее значение. Я бы посоветовал кому-то попробовать этот протокол в первый раз, чтобы подготовиться тщательно и сделать макет эксперимента, если это возможно. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение для того, чтобы подчеркнуть шаги анализа, которые нуждаются в особом внимании, таких как сроки анализа.Для начала подготовьтесь к макрофагам, полученным из костного мозга, используя условные средства массовой информации, описанные в сопроводительном текстовом протоколе. После грунтовки макрофагов на ночь, аспирировать супернатант и мыть клетки один раз с PBS. Сыворотка голодают клетки, заменив средства массовой информации с тем же объемом с низким содержанием сыворотки DMEM.Для каждой мыши, одна пластина будет рассматриваться с анти-BSA IgG1 в то время как сыворотка голодает, а другая останется без лечения. Добавьте только низкосерийный DMEM к необработанным пластинам и добавьте в обработанные пластины DMEM с низким содержанием сыворотки, содержащий 2,5 микрограмма на миллилитр мурина anti-BSA IgG1. Обязательно включите одну дополнительную необработанную пластину для каждого эксперимента, чтобы выступать в качестве контроля цитометрической компенсации потока.Инкубировать пластины четыре часа при 37 градусах по Цельсию, 5%CO2. Во время четырехчасовой инкубации подготовьтесь к 2X-решению реактивных зондов видов кислорода. На каждые 10 миллилитров необходимого DMEM с низким содержанием сыворотки добавьте четыре микролитров окислительного реагента обнаружения стресса и четыре микролитера реагента обнаружения супероксида.Затем подготовь решения зонда 2X, содержащие только окислительный реагент обнаружения стресса или содержащие только реагент обнаружения супероксида. После четырехчасовой инкубации, урожай клеток, осторожно соскоб пластин, собирая их в помечены, пять миллилитров круглого дна труб. Центрифуга труб при 750 раз г в течение пяти минут.Не забудьте отслеживать, какие клетки были обработаны мурин анти-BSA IgG1. Далее, мыть клеточные гранулы с двумя миллилитров PBS, чтобы избавиться от любых остаточных анти-BSA из обработанных клеток. Центрифуга труб при 750 раз г в течение пяти минут.Затем, аспирировать PBS и повторного перерасхода клеток гранулы в 600 микролитров с низким содержанием сыворотки DMEM. Из 600-микролитровой клеточной подвески, aliquot 200 микролитров в предварительно помеченные пятими миллилитровые круглые нижние трубки. Из необработанных клеток возьмите 200 микролитров для трубок, помеченных нестимулированными, 200 микролитров для трубок с маркировкой положительного индуктора и 200 микролитров для труб с маркировкой положительного индуктора плюс ингибитор.Затем, из анти-BSA IgG1 обработанных клеток, принять 200 микролитров для труб помечены FC-гамма рецепторов перекрестного, и 200 микролитров для труб помечены FC-гамма-рецептор перекрестного плюс ингибитор. Из необработанных клеток, которые будут использоваться для компенсации контроля, принять 200 микролитров для трубки помечены неочищенных unstimulated, 200 микролитров для зеленого плюс индуктор управления, и 200 микролитров для оранжевого плюс индуктор контроля. Приготовьте 2X положительный индукторный раствор, разбавляя pyocyanin от одного до 100 в каждом из 2X зонд решений в концентрации 500 микромоляров.Затем подготовь решение 2X BSA, разбавляя решение BSA в растворе зонда 2X, чтобы получить 2X-концентрацию в два микрограмма на миллилитр. Перед началом специфической стимуляции, такой как перекрестное скрещивание рецепторов FC-gamma, убедитесь, что все реагенты и клетки готовы и поместите трубки на лед в том порядке, в котором они будут стимулироваться. Для цитометров потока с помощью автоамплера обратите внимание на время, которое требуется цитометру для анализа одного образца и перехода к следующему.Обязательно включите любые шаги смешивания и промывания зонда. Сроки очень важно для этого анализа. Для того, чтобы каждое условие было хорошо контролируется, стимуляция должна быть проведена ровно в 30 минут для каждого состояния.Стимулируть клетки в порядке и включать время задержки между приобретениями выборки потоком цитометра. При выполнении ручной компенсации на данный момент, стимулировать контрольные трубы, которые будут использоваться для компенсации, добавив 200 микролитров 2X зонд решение, содержащее окислительный реагент обнаружения стресса и индуктор в трубки отмечены зеленый плюс индуктор. Затем добавьте 200 микролитров раствора зонда 2X, содержащего реагент обнаружения супероксида и индуктор в трубки с оранжевым плюс индуктор.Инкубировать клетки в течение 30 минут в темноте. Используя программное обеспечение цитометрии потока, генерировать и маркировать три образца файлов для управления, незапачканные, необработанные, зеленый плюс индуктор, и оранжевый плюс индуктор образцов, убедившись, что указать каналы и параметры, которые будут проанализированы. Кроме того, введите желаемые условия остановки.После настройки контрольных образцов создать и обозначить аналогичный набор файлов для экспериментальных образцов. Теперь запустите неочищенный, необработанный образец. Откройте точечный участок для форварда рассеяния по оси X по сравнению с боковым рассеянием на оси Y и нарисуйте ворота вокруг представляющих интерес ячеек, исключая мертвые клетки и мусор.Затем используйте ворота этой ячейки, чтобы открыть еще один точечный участок первого маркера флуоресценции, FL1, на X-оси, по сравнению со вторым маркером флуоресценции, FL2, на оси Y. Нарисуйте начальные квадрантные ворота, а затем отрегулируйте квадрантные ворота так, чтобы события появились на левом нижнем квадранте участка FL1 против FL2. После завершения, запустить зеленый плюс индуктор образца.Отрегулируйте напряжение так, чтобы события появлялись на левом нижнем и правом квадрантах участка FL1 против FL2. Затем примените эту матрицу компенсации ко всем трем файлам образца. Теперь запустите оранжевый плюс образец индуктора.Отрегулируйте напряжение так, чтобы события появлялись на верхних и нижних левых квадрантах участка FL1 против FL2, а затем примените эту матрицу компенсации ко всем трем файлам образца. Проверьте каждый файл компенсации и убедитесь, что неочищенные, необработанные события появляются на левом нижнем квадранте, зеленые плюс индукторные события появляются на нижних левых и правых квадрантах, а оранжевые плюс индукторные события появляются на верхних и нижних левых квадрантах участка FL1 против FL2. Затем примените матрицу компенсации ко всем экспериментальным файлам образца.После того, как ручная компенсация была выполнена и экспериментальный шаблон был получен, перейти к экспериментальным образцам. Перед лечением клеток с положительным индуктором или проведением стимуляции клеток FC-гамма-рецепторов, отметь, какие трубки получат ингибитор ROS. Лечить эти клетки с ингибитором ROS по крайней мере за 30 минут до положительного индуктора или стимуляции рецепторов FC-гамма, добавив один микролитр ингибитора до 200 микролитров resuspended клеток для окончательной концентрации пяти миллимоляров.Для нестимулированных клеток, лечить клетки с 200 микролитров 2X зонда решение без каких-либо стимулов добавил к 200 микролитров клеточной подвески помечены окрашенные, unstimulated. Для положительного контроля, лечить клетки с 200 микролитров 2X положительный индуктор решение 200 микролитров клеточной подвески помечены положительный индуктор или положительный индуктор плюс ингибитор. Наконец, для клеток, стимулируемых перекрестного пересечения рецепторов FC-гамма, лечить их с 200 микролитров 2X BSA решение добавил к 200 микролитров клеточной подвески помечены FC-гамма-рецептор перекрестного или FC-гамма-рецептор перекрестного плюс ингибитор.Инкубировать клетки в течение 30 минут в темноте. После инкубации проанализируйте образцы в том порядке, в котором они стимулировались, используя цитометр потока и шаблоны анализа, генерируемые в ходе первоначальных компенсационных шагов. Данные, показанные здесь, демонстрируют цитометрическое обнаружение потока реактивных видов кислорода в результате стимуляции макрофагов через рецептор FC-gamma.Существует заметное увеличение FL1 и FL2 флуоресценции, когда клетки стимулируются с FC-гамма рецепторов перекрестного агента. Когда клетки были обработаны с реактивным ингибитором вида кислорода до перекрестного пересечения рецепторов FC-гамма, это увеличение флуоресценции возвращается к базальным уровням. В отличие от этого, эти точечные участки представляют если неуспешный эксперимент, где наблюдалось неоптимального реактивного производства кислорода в результате стимуляции FC-гамма-рецепторов.Чтобы подчеркнуть большие различия между ожидаемыми процентами или увеличением МФО, эти данные показывают, как выглядят образцы с минимальным увеличением флуоресценции FL1 и FL2. Текущий протокол использует 24-часовой этап грунтовки. При сравнении 24-часового по сравнению с 48-часовым временем грунтовки, не было заметной разницы в проценте клеток, положительных для зеленого окислительного реагента стресса.Тем не менее, увеличение времени грунтовки до 48 часов сделал увеличить процент клеток положительные для оранжевой флуоресценции. Наиболее важные вещи, чтобы помнить при выполнении этой процедуры планирует заранее, и быть последовательным о сроках анализа, чтобы получить воспроизводимые результаты.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Многоцветный проточной цитометрии Анализ клеточного иммунного ответа на резус-макак

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Количественные измерения иммунного ответа и сна в<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Анализ растворителей доступность остатков цистеина на<em&gt; Кукуруза rayado Fino вирус</em&gt; Вирус типа частиц, образующихся в<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; Растения и Перекрестное связывание пептидов VLPs

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Использование РНК-интерференции по расследованию врожденного иммунного ответа у мышей макрофагов

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Простой проточной цитометрии метод измерения глюкозы и глюкозы Transporter выражение для моноцитов субпопуляциях в цельной крови

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Поток Cytometric Анализ связанного с твердыми частицами Bet v 1 аллергена в PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flow Cytometric Анализ естественных клеток-киллеров литической активности в человеческой цельной крови

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Изоляция Salmonella typhimurium-содержащих Phagosomes от макрофагов

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Изоляции и в пробирке культуры мышиных и человека альвеолярные макрофаги

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Цитометрический анализ инфильтрации лимфоцитов в Центральной нервной системе во время экспериментального аутоиммунного энцефаломиелита

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...