Name: flow cytometric measurement of ros production in macrophages in response to fc&#947;r cross-linking
Uploaded: 2019-03-07T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃŽÂ³R Cross-linking at JoVE.com

Los autores desean agradecer a otros miembros del laboratorio de Tigno Aranjuez como Madelyn H. Miller, Omar Cardona, Andjie Jeudy, Roopin Singh por su ayuda en el mantenimiento de colonias de mantenimiento y el ratón de laboratorio. Apoyo para esta investigación fue proporcionado por grant R00 HL122365 y fondos de puesta en marcha a J.T.T-A.

El protocolo para el manejo de animales fue aprobado por el Comité institucional el cuidado Animal y del uso (IACUC) de University of Central Florida.
1. generación de la médula ósea derivados de macrófagos (BMDMs)
<ol><li>
Preparación de medios de cultivo
	<ol>
<li>Preparar los medios base D10F: A de Dulbecco modificado Eagle Medium (DMEM), añadir 10% calor inactiva el suero bovino fetal (FBS), piruvato de sodio 1 m m, 10 m m 4-(2-hydroxyethyl)-1--1-ácido ácido (HE...

<ol>
	<li>Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+Oxygen+Species+and+Neutrophil+Function.">Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).</li><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress.">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).</li><li>Robinson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+in+phagocytic+leukocytes.">Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).</li><li>Thomas, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phagocyte+respiratory+burst:+Historical+perspectives+and+recent+advances.">The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances.</a> Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).</li><li>Fang, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+actions+of+reactive+oxygen+species.">Antimicrobial actions of reactive oxygen species.</a> MBio. 2 (5), (2011).</li><li>Iles, K. E., Forman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+signaling+and+respiratory+burst.">Macrophage signaling and respiratory burst.</a> Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).</li><li>Curnutte, J. T., Whitten, D. M., Babior, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+superoxide+production+by+granulocytes+from+patients+with+chronic+granulomatous+disease.">Defective superoxide production by granulocytes from patients with chronic granulomatous disease.</a> New England Journal of Medicine. 290 (11), 593-597 (1974).</li><li>Good, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatal+(chronic)+granulomatous+disease+of+childhood:+a+hereditary+defect+of+leukocyte+function.">Fatal (chronic) granulomatous disease of childhood: a hereditary defect of leukocyte function.</a> Seminars in Hematology. 5 (3), 215-254 (1968).</li><li>Holmes, B., Page, A. R., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+the+metabolic+activity+of+leukocytes+from+patients+with+a+genetic+abnormality+of+phagocytic+function.">Studies of the metabolic activity of leukocytes from patients with a genetic abnormality of phagocytic function.</a> Journal of Clinical Investigation. 46 (9), 1422-1432 (1967).</li><li>Windhorst, D. B., Page, A. R., Holmes, B., Quie, P. G., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pattern+of+genetic+transmission+of+the+leukocyte+defect+in+fatal+granulomatous+disease+of+childhood.">The pattern of genetic transmission of the leukocyte defect in fatal granulomatous disease of childhood.</a> Journal of Clinical Investigation. 47 (5), 1026-1034 (1968).</li><li>Dikalov, S. I., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species.">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).</li><li>Held, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Reactive+Oxygen+Species:+Measurement+of+ROS+in+cells.">An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in cells.</a> White Paper. , (2015).</li><li>Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+reactive+oxygen+species+measurement+in+biological+systems.">Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).</li><li>Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2',7'-Dichlorodihydrofluorescein+as+a+fluorescent+probe+for+reactive+oxygen+species+measurement:+Forty+years+of+application+and+controversy.">2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy.</a> Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).</li><li>Zielonka, J., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroethidine-+and+MitoSOX-derived+red+fluorescence+is+not+a+reliable+indicator+of+intracellular+superoxide+formation:+another+inconvenient+truth.">Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).</li><li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification+and+labeling+of+mouse+bone+marrow+neutrophils+for+functional+studies+and+adoptive+transfer+experiments.">Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).</li></ol>

DCFH2-DA y detección basada en DHE de ROS es una técnica ampliamente utilizada14,15. Facilidad de uso y la adaptabilidad de estas sondas ROS para microplacas cinética formatos, análisis de fluorescencia microscopía o flujo cytometric ha contribuido a su popularidad. Sin embargo, en nuestros estudios de las funciones de macrófagos mediada por FcγR, no parecía ser un protocolo estándar para la realización de este ensayo para el análisis cytome...

Especies reactivas del oxígeno (ROS) son moléculas reactivas o radicales libres que son subproductos de la respiración aeróbica (revisado en 1). Estas incluyen el anión superóxido, peróxido, peróxido de hidrógeno, radical hidroxilo y los iones hidroxilo, entre otros. En condiciones fisiológicas normales, ROS son producidos principalmente por las mitocondrias y oxidasas de nicotinamida adenina dinucleótido fosfato (NADPH) y son desintoxicados rápidamente por varias enzimas y proteínas tales como la superóxido dismutasa y glutatión. Una exagerada producción de ROS o un defecto en la capacidad de eliminar ROS puede resultar en estrés oxidativo, por el que especies reactivas de oxígeno promueven el daño de las proteínas, lípidos y ADN llevando a estados patológicos de la enfermedad o la muerte y el estrés celular. Sin embargo, actualmente se aprecia que ROS también pueden actuar como moléculas de señalización (redox signaling), y modificación mediada por ROS de diversas moléculas y productos intermedios de la vía puede influenciar metabolismo celular, proliferación, supervivencia, inflamatoria señalización y envejecimiento2. En las células fagocíticas, ROS juega un papel esencial en la prestación de la actividad antimicrobiana durante el llamado "Estallido respiratorio"1,3,4,5,6. Durante la respuesta de los fagocitos a los estímulos externos, componentes de la NADPH oxidasa complejo (p40phox, p47phox, p67phox) translocan desde el citosol a la membrana phagosomal que contiene la gp91phox y p22phox subunidades, y junto con las acciones de Rac1/2, forman un completamente funcional NADPH oxidasa complejo de la enzima. La oxidasa de NADPH montada entonces utiliza NADPH para reducir el oxígeno a superóxido dentro de la vacuola phagosomal. Aniones superóxido pueden dañar directamente o dismutated en peróxido de hidrógeno. Superóxido y peróxido de hidrógeno pueden reaccionar con otras moléculas para generar a radicales hidroxilo altamente reactivo. Daño es mediado por la reacción de estos ROS con racimos de hierro-azufre en proteínas o haciendo base oxidación del ADN, en última instancia conduce al limitado metabolismo microbiano o la muerte del microbio5. La importancia de la enzima oxidasa de NADPH complejo y ROS producidos durante la explosión respiratoria se ilustra clínicamente en pacientes con enfermedad granulomatosa crónica (CGD)7,8,9, 10. individuos con CGD poseen mutaciones en gp91phox, resultando en una falta de producción de ROS y la susceptibilidad a infecciones recurrentes con bacterias y hongos que normalmente no son una preocupación con los individuos inmunocompetentes. Por lo tanto, si estudiar oxidativo estrés redox señalización y defensa del huésped, pudiendo medir la producción de ROS en tiempo real es un esfuerzo útil.
Múltiples ensayos se han utilizado para la producción de ROS de medida o los resultados de estrés oxidativo11,12,13. Entre éstos, uno de los más utilizados es la sonda fluorescente 2', 7' dichlorodihydrofluorescein diacetato (DCFH2-DA)14. Esta molécula es incoloro y lipofílicas. Difusión de DCFH2-DA a través de la membrana celular permite que se actuó por esterasas intracelulares, que deacetylates DCFH2, haciéndola celular impermeable. Las acciones de múltiples tipos de ROS (peróxido de hidrógeno, peroxinitrito, radicales hidroxilo, óxido nítrico y los radicales Peroxoborato) DCFH2 oxidan en DCF que es fluorescente (divulgado Ex / Em: 485-500 nm/515-530 nm) y pueden ser detectados usando un flujo de citómetro equipado con un filtro estándar de fluoresceína (FL1 canal). Superóxido no reacciona fuertemente con DCFH2 pero puede reaccionar con otra sonda dihydroethidium (DHE) para producir el producto fluorescente 2-hydroxyethidium (así como otros productos de la oxidación de superóxido-independiente fluorescente)15. Los productos fluorescentes de oxidación DHE pueden detectarse con una longitud de onda de excitación de 518 nm y una longitud de onda de la emisión de 605 nm (FL2 canal). Aunque relativamente fáciles de usar, la utilización de estas sondas para la detección de ROS requiere conocimiento de sus limitaciones y cuidadosa incorporación de tinción procedimientos y controles en el ensayo específico se realiza para poder tener validez experimental resultados y conclusiones. El protocolo siguiente muestra el uso de un kit disponible en el mercado que emplean estos 2 puntas de prueba diseñadas para medir ROS por citometría de flujo. Mancha preparados macrófagos derivados de médula ósea con estas puntas de prueba e inducir la producción de ROS a través de cross-linking FcγR. Presentamos datos representativos obtenidos usando este protocolo y recalcar las precauciones apropiadas que se deben emprender para la experimentación exitosa.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:623px;" width="623">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-BSA IgG1</td>
			<td style="width:121px;">Innovative Research</td>
			<td style="width:119px;">IBSA9E2C2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-mouse CD16/32</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:121px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">565853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">123108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647&#160;</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">101218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">beta-mercaptoethanol (BME)</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M3148-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">C57BL/6J&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Jackson labs</td>
			<td>Stock No.000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CM-H2DCFDA</td>
			<td style="width:121px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">C6827</td>
			<td>Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dihydroethidium (DHE)</td>
			<td style="width:121px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">D11347</td>
			<td>Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM 1x</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM no phenol red</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31053-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMF Anhydrous&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">61094-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FITC Rat IgG2a, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L glutamine</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LADMAC cells</td>
			<td style="width:121px;">ATCC</td>
			<td>CRL-2420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MEM</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mouse IFN-g</td>
			<td style="width:121px;">GoldBio</td>
			<td style="width:119px;">1360-06-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td style="width:121px;">EMD Milipore</td>
			<td style="width:119px;">106425</td>
			<td>Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Novocyte flow cytometer with autosampler</td>
			<td style="width:121px;">Acea</td>
			<td style="width:119px;">2060R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pyocyanin (ROS inducer)</td>
			<td style="width:121px;">Cayman chemical</td>
			<td style="width:119px;">10009594</td>
			<td>Can be a substitute for inducer in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ROS-ID total ROS/superoxide detection kit</td>
			<td style="width:121px;">ENZO</td>
			<td style="width:119px;">ENZ-51010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium pyruvate (100mM)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric measurement of ros production in macrophages in response to fc&#947;r cross-linking

La explosión oxidativa o respiratoria se utiliza para describir el rápido consumo de oxígeno y la generación de especies reactivas del oxígeno (ROS) por los fagocitos en respuesta a varios estímulos inmunes. ROS generados durante la activación inmune ejerce potente actividad antimicrobiana sobre todo a través de la capacidad de ROS para dañar el ADN y las proteínas, causando la muerte de los microorganismos. Ser capaz de medir la producción de ROS reproducible y con facilidad es necesario para evaluar la contribución de varias vías y moléculas para este mecanismo de defensa del huésped. En este trabajo, demostrar el uso de sondas fluorescentes y citometría de flujo para detectar la producción de ROS. Aunque ampliamente utilizado, es muy problemático, especialmente en cuanto a medición de ROS inducida por estímulos específicos y no mitogénicos medición fluorescente de ROS. Presentamos una metodología detallada para la detección de ROS generados como resultado de la estimulación específica de FcγR comenzando con generación de macrófago, cebado, coloración, FcγR Cross-linking y terminando con el análisis cytometric del flujo.

Utilizando el protocolo descrito dentro, presentamos datos representativos mostrando detección cytometric del flujo de producción de ROS resultantes de la estimulación de WT C57BL/6J BMDMs a través del FcγR. Como se esperaba, observamos cambios mínimos en la fluorescencia FL1 o FL2 por encima de los niveles de fondo en las células sin estimular (Figura 3A, Comparar "manchadas, sin estimular" vs "sin manchas, sin estimular" punto parcelas). Observamos un marcado aumento en fluorescenci...

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Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃƒÅ½Ã‚Â³R Cross-linking

Este estudio demuestra el uso de citometría de flujo para detectar la producción de (ROS) las especies reactivas de oxígeno resultante de la activación de la FcγR. Este método puede utilizarse para evaluar los cambios en el antimicrobiano y función de los fagocitos en respuesta a complejos inmunes, microorganismos opsonizadas o FcγR directa Cross-linking de señalización redox.

Medición de Cytometric del flujo de producción de ROS en los macrófagos en respuesta a Cross-linking FcγR

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...

La medición de especies reactivas de oxígeno o ROS es notoriamente problemática. En este video, demostraremos la medición reproducible de ROS en respuesta al reticulación del receptor FC-gamma utilizando sondas fluorescentes y citometría de flujo. Las principales ventajas de esta técnica son la reproducibilidad del ensayo y el uso de este método con estímulos antigénicos específicos, no sólo mitógenos o inductores ROS conocidos.La producción de ROS desregulada es fundamental para el desarrollo de muchas enfermedades como la enfermedad granulomatosa crónica o la EC. La medición precisa de la ROS podría constituir una parte del diagnóstico molecular de la EC. Estudiar la producción de ROS mediada por FC es importante en el estudio de las inmunodeficiencias, como la EC, pero también en el estudio de enfermedades autoinmunes, o enfermedades neurodegenerativas, donde demasiado ROS conduce al estrés oxidativo y la inflamación.El momento del ensayo es crítico. Yo aconsejaría a alguien que intenta este protocolo por primera vez para prepararse a fondo y hacer un experimento simulado si es posible. La demostración visual de este método es fundamental para subrayar los pasos del ensayo que necesitan una atención especial, como el momento del ensayo.Para comenzar, prepare macrófagos derivados de la médula ósea utilizando medios condicionados como se describe en el protocolo de texto adjunto. Después de cebar los macrófagos durante la noche, aspirar el sobrenadante y lavar las células una vez con PBS. El suero muere de hambre a las células reemplazando los medios con el mismo volumen de DMEM bajo en suero.Para cada ratón, una placa será tratada con anti-BSA IgG1 mientras el suero se muere de hambre mientras que la otra no se tratará. Añadir sólo DMEM de bajo suero a las placas no tratadas y añadir DMEM de bajo suero que contenga 2,5 microgramos por mililitro de IgG1 de murino anti-BSA a las placas tratadas. Asegúrese de incluir una placa no tratada adicional para cada experimento que actúe como control de compensación citométrica de flujo.Incubar las placas cuatro horas a 37 grados centígrados, 5%CO2. Durante las cuatro horas de incubación, preparar una solución 2X de las sondas reactivas de especies de oxígeno. Por cada 10 mililitros de DMEM de bajo suero necesarios, agregue cuatro microlitros de un reactivo de detección de esfuerzo oxidativo y cuatro microlitros de un reactivo de detección de superóxido.A continuación, prepare las soluciones de sonda 2X que contienen solo el reactivo de detección de estrés oxidativo o que contienen solo el reactivo de detección de superóxido. Después de la incubación de cuatro horas, cosecha las células raspando suavemente las placas, recogiéndolas en tubos de fondo redondo etiquetados de cinco mililitros. Centrifugar los tubos a 750 g durante cinco minutos.Asegúrese de realizar un seguimiento de las células que fueron tratadas con murino anti-BSA IgG1. A continuación, lave los gránulos celulares con dos mililitros de PBS para deshacerse de cualquier anti-BSA residual de las células tratadas. Centrifugar los tubos a 750 g durante cinco minutos.Luego, aspirar el PBS y resuspender el pellet celular en 600 microlitros de DMEM de bajo suero. A partir de la suspensión de células de 600 microlitros, alícuotas 200 microlitros en los tubos de fondo redondo de cinco mililitros preetiquetados. De las células no tratadas, tomar 200 microlitros para los tubos etiquetados sin estimular, 200 microlitros para los tubos etiquetados inductor positivo, y 200 microlitros para los tubos etiquetados inductor positivo más inhibidor.Luego, de las células tratadas contra-BSA IgG1, tomar 200 microlitros para tubos etiquetados con el entrecruzamiento del receptor FC-gamma, y 200 microlitros para tubos etiquetados CON el receptor FC-gamma reticulando más inhibidor. De las células no tratadas que se utilizarán para los controles de compensación, tome 200 microlitros para el tubo etiquetado sin astimular, 200 microlitros para el control del inductor verde más, y 200 microlitros para el control de naranja más inductor. Preparar una solución inductor 2X positivo diluyendo la pyocyanina de uno a 100 en cada una de las soluciones de sonda 2X a una concentración de 500 micromolares.A continuación, prepare una solución de BSA 2X diluyendo la solución de stock de BSA en la solución de sonda 2X para obtener una concentración de 2X de dos microgramos por mililitro. Antes de iniciar la estimulación específica, como la reticulación del receptor FC-gamma, asegúrese de que todos los reactivos y células estén listos y coloque los tubos sobre hielo en el orden en que serán estimulados. Para los citometros de flujo con un muestreador automático, tome nota del tiempo que tarda el citometro en analizar una muestra y pasar a la siguiente.Asegúrese de incluir cualquier paso de mezcla y lavado de sondas. El tiempo es muy crítico para este ensayo. Para que cada condición esté bien controlada, la estimulación debe llevarse a cabo en exactamente 30 minutos para cada condición.Estimular las células en orden e incorporar el tiempo de retraso entre las adquisiciones de muestras por el citometro de flujo. Si realiza una compensación manual en este punto, estimule los tubos de control que se utilizarán para la compensación añadiendo 200 microlitros de la solución de sonda 2X que contiene el reactivo de detección de tensión oxidativa y el inductor en los tubos marcados en verde más inductor. A continuación, añada 200 microlitros de solución de sonda 2X que contengan el reactivo de detección de superóxido y el inductor en los tubos marcados como naranja más inductor.Incubar las células durante 30 minutos en la oscuridad. Usando el software de citometría de flujo, genere y etiquete tres archivos de muestra para el control, sin mancha, sin tratar, el inductor plus verde y las muestras de inductor naranja plus, asegurándose de indicar los canales y parámetros a analizar. Además, introduzca las condiciones de parada deseadas.Una vez configuradas las muestras de control, genere y etiquete un conjunto similar de archivos para las muestras experimentales. Ahora, ejecuta la muestra sin mancha y sin tratar. Abra un gráfico de puntos para la dispersión hacia delante en el eje X frente a la dispersión lateral en el eje Y y dibuje una puerta alrededor de las celdas de interés, excluyendo las celdas muertas y los desechos.A continuación, utilice la puerta de esta celda para abrir otra gráfica de puntos del primer marcador de fluorescencia, FL1, en el eje X, frente al segundo marcador de fluorescencia, FL2, en el eje Y. Dibuje una puerta de cuadrante inicial y, a continuación, ajuste la puerta del cuadrante para que los eventos aparezcan en el cuadrante inferior izquierdo de la gráfica FL1 frente a FL2. Cuando haya terminado, ejecute la muestra de inductor verde más.Ajuste el voltaje para que los eventos aparezcan en los cuadrantes inferior izquierdo y derecho de la gráfica FL1 frente a FL2. A continuación, aplique esta matriz de compensación a los tres archivos de ejemplo. Ahora, ejecute la muestra naranja más inductor.Ajuste el voltaje para que los eventos aparezcan en los cuadrantes superior e inferior izquierdo de la gráfica FL1 frente a FL2 y, a continuación, aplique esta matriz de compensación a los tres archivos de muestra. Compruebe cada archivo de compensación y asegúrese de que los eventos no detenidos y no tratados aparezcan en el cuadrante inferior izquierdo, los eventos de inductor más verde aparecen en los cuadrantes inferior izquierdo y derecho, y los eventos de inductor naranja más aparecen en los cuadrantes superior e inferior izquierdo de la gráfica FL1 frente a FL2. A continuación, aplique la matriz de compensación a todos los archivos de ejemplo experimentales.Una vez realizada la compensación manual y obtenida una plantilla experimental, pase a las muestras experimentales. Antes de tratar las células con un inductor positivo o realizar la estimulación de la célula del receptor FC-gamma, marque qué tubos obtendrán un inhibidor de la ROS. Tratar estas células con el inhibidor DE ROS al menos 30 minutos antes del inductor positivo o estimulación del receptor FC-gamma añadiendo un microlitro del inhibidor a 200 microlitros de células resuspendidas para una concentración final de cinco mililitros.Para las células no estimuladas, trate las células con 200 microlitros de la solución de sonda 2X sin ningún estímulo añadido a los 200 microlitros de suspensión celular etiquetados manchados, sin estimulación. Para controles positivos, trate las células con 200 microlitros de la solución inductor 2X positiva a 200 microlitros de suspensión celular etiquetado inductor positivo o inductor positivo más inhibidor. Finalmente, para las células estimuladas por el reticulamiento del receptor FC-gamma, tratarlas con 200 microlitros de la solución 2X BSA añadidas a 200 microlitros de la suspensión celular etiquetada con el receptor FC-gamma reticulante o el reticulante del receptor FC-gamma más inhibidor.Incubar las células durante 30 minutos en la oscuridad. Después de la incubación, analizar las muestras en el orden en que fueron estimuladas, utilizando el citómetro de flujo y las plantillas de análisis generadas durante los pasos de compensación inicial. Los datos mostrados aquí demuestran la detección citométrica de flujo de la producción reactiva de especies de oxígeno resultante de la estimulación de los macrófagos a través del receptor FC-gamma.Hay un aumento marcado en la fluorescencia FL1 y FL2 cuando las células se estimulan con el agente reticulante del receptor FC-gamma. Cuando las células fueron tratadas con el inhibidor de especies reactivas de oxígeno antes de la reticulación del receptor FC-gamma, este aumento de la fluorescencia se devuelve a los niveles basales. Por el contrario, estas gráficas de puntos presentan un experimento fallido, donde se observó la producción de especies de oxígeno reactivas subóptimas como resultado de la estimulación del receptor FC-gamma.Para resaltar las grandes diferencias entre los porcentajes esperados o los aumentos de IMF, estos datos muestran cómo se ven las muestras con un aumento mínimo de la fluorescencia FL1 y FL2. El protocolo actual utiliza un paso de cebado de 24 horas. Al comparar un tiempo de cebado de 24 horas frente a un tiempo de cebado de 48 horas, no hubo diferencia marcada en el porcentaje de células positivas para el reactivo de estrés oxidativo verde.Sin embargo, aumentar el tiempo de cebado a 48 horas aumentó el porcentaje de células positivas para la fluorescencia naranja. Las cosas más importantes a recordar al realizar este procedimiento es planificar con anticipación, y ser consistente sobre el momento del ensayo para obtener resultados reproducibles.

Research

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