Name: flow cytometric measurement of ros production in macrophages in response to fc&#947;r cross-linking
Uploaded: 2019-03-07T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃŽÂ³R Cross-linking at JoVE.com

Författarna vill tacka övriga ledamöter i Tigno-Aranjuez labbet inklusive Madelyn H. Miller, Omar Cardona, Andjie Jeudy och Roopin Singh för deras hjälp i laboratoriet underhåll och mus kolonin underhåll. Stöd för denna forskning tillhandahölls av grant R00 HL122365 och nystartade fonder till J.T.T-A.

Protokollet för djurhantering godkändes av den institutionella djur vård och användning kommittén (IACUC) av University of Central Florida.
1. generering av benmärgen härrör makrofager (BMDMs)
<ol><li>
Kultur media förberedelse
	<ol>
<li>Förbered D10F bas: till Dulbeccos modifierade Eagle Medium (DMEM), lägga till 10% värme inaktiverat fetalt bovint serum (FBS), 1 mM natrium Pyruvat, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic syra (HEPES) och 0,05 mM β-...

<ol>
	<li>Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+Oxygen+Species+and+Neutrophil+Function.">Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).</li><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress.">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).</li><li>Robinson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+in+phagocytic+leukocytes.">Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).</li><li>Thomas, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phagocyte+respiratory+burst:+Historical+perspectives+and+recent+advances.">The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances.</a> Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).</li><li>Fang, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+actions+of+reactive+oxygen+species.">Antimicrobial actions of reactive oxygen species.</a> MBio. 2 (5), (2011).</li><li>Iles, K. E., Forman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+signaling+and+respiratory+burst.">Macrophage signaling and respiratory burst.</a> Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).</li><li>Curnutte, J. T., Whitten, D. M., Babior, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+superoxide+production+by+granulocytes+from+patients+with+chronic+granulomatous+disease.">Defective superoxide production by granulocytes from patients with chronic granulomatous disease.</a> New England Journal of Medicine. 290 (11), 593-597 (1974).</li><li>Good, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatal+(chronic)+granulomatous+disease+of+childhood:+a+hereditary+defect+of+leukocyte+function.">Fatal (chronic) granulomatous disease of childhood: a hereditary defect of leukocyte function.</a> Seminars in Hematology. 5 (3), 215-254 (1968).</li><li>Holmes, B., Page, A. R., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+the+metabolic+activity+of+leukocytes+from+patients+with+a+genetic+abnormality+of+phagocytic+function.">Studies of the metabolic activity of leukocytes from patients with a genetic abnormality of phagocytic function.</a> Journal of Clinical Investigation. 46 (9), 1422-1432 (1967).</li><li>Windhorst, D. B., Page, A. R., Holmes, B., Quie, P. G., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pattern+of+genetic+transmission+of+the+leukocyte+defect+in+fatal+granulomatous+disease+of+childhood.">The pattern of genetic transmission of the leukocyte defect in fatal granulomatous disease of childhood.</a> Journal of Clinical Investigation. 47 (5), 1026-1034 (1968).</li><li>Dikalov, S. I., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species.">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).</li><li>Held, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Reactive+Oxygen+Species:+Measurement+of+ROS+in+cells.">An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in cells.</a> White Paper. , (2015).</li><li>Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+reactive+oxygen+species+measurement+in+biological+systems.">Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).</li><li>Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2',7'-Dichlorodihydrofluorescein+as+a+fluorescent+probe+for+reactive+oxygen+species+measurement:+Forty+years+of+application+and+controversy.">2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy.</a> Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).</li><li>Zielonka, J., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroethidine-+and+MitoSOX-derived+red+fluorescence+is+not+a+reliable+indicator+of+intracellular+superoxide+formation:+another+inconvenient+truth.">Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).</li><li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification+and+labeling+of+mouse+bone+marrow+neutrophils+for+functional+studies+and+adoptive+transfer+experiments.">Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).</li></ol>

DCFH2-DA och DHE-baserad detektion av ROS är en allmänt använd teknik14,15. Användarvänlighet och anpassningsförmåga av dessa ROS sonder för kinetiska mikroplattan format, fluorescence mikroskopi eller flöde flödescytometrisk analys har bidragit till deras popularitet. Dock i våra studier av FcγR-medierad makrofag funktioner verkade det inte vara ett standardprotokoll för att utföra denna analys för flöde flödescytometrisk analys av Fc...

Reaktiva syreradikaler (ROS) är reaktiva molekyler eller fria radikaler som är biprodukter av aerob respiration (ses i 1). Dessa inkluderar den superoxid anjon, peroxid, väteperoxid, hydroxyl radikala och hydroxyljoner, bland andra. Under normala fysiologiska förhållanden, ROS produceras främst av mitokondrier och nikotinamid-adenin-dinukleotid fosfat (NADPH) oxidases och är snabbt Dekon-olika enzymer och proteiner som superoxiddismutas och glutation. En överdriven produktion av ROS eller en defekt i förmågan att ta bort ROS kan leda till oxidativ stress, whereby reaktiva syreradikaler främja skadan av proteiner, lipider och DNA vilket leder till cellulär stress eller död och patologiska sjukdomstillstånd. Men uppskattas det för närvarande att ROS kan också fungera som signalmolekyler (redox signalering) och ROS-medierad modifiering av olika molekyler och pathway intermediärer kan påverka cellulär metabolism, spridning, överlevnad, inflammatoriska signalering och åldrande2. I Fagocytos celler spelar ROS en viktig roll i att tillhandahålla Antimikrobiell aktivitet under den så kallade ”respiratory burst”1,3,4,5,6. Under fagocyter svar på yttre stimuli translocate komponenter av NADPH-oxidas komplexa (p40phox, p47phox, p67phox) från cytosolen till phagosomal membranet som innehåller gp91phox och p22phox subenheter, och tillsammans med åtgärderna för Rac1/2, bildar en fullt fungerande NADPH-oxidas enzymkomplex. Den monterade NADPH-oxidasen använder sedan tredjeparts NADPH för att reducera syre till superoxid inom den phagosomal vakuol. Superoxid anjoner kan direkt skada eller vara dismutated i väteperoxid. Både superoxid och väteperoxid kan reagera med andra molekyler för att generera mycket reaktiva hydroxylradikaler. Skador medieras genom reaktion av dessa ROS med järn-svavel kluster på proteiner eller orsakar bas oxidering av DNA, vilket slutligen leder till begränsad mikrobiell metabolism eller döden av mikrob5. Betydelsen av NADPH-oxidas enzymet komplexa och ROS som producerats under respiratory burst illustreras kliniskt på patienter med kronisk granulomatös sjukdom (CGD)7,8,9, 10. individer med CGD besitter mutationer i gp91phox, vilket resulterar i en brist på ROS produktion och känslighet för återkommande infektioner med bakterier och svampar som inte vanligtvis är ett bekymmer med immunkompetenta individer. Därför, om studera oxidativ stress, redox signalering eller värd försvar, att kunna mäta ROS produktionen i realtid är en användbar strävan.
Flera analyser har utnyttjats till åtgärd ROS produktion eller resultaten av oxidativ stress11,12,13. Bland dessa är en av de mest använda fluorescerande sond 2', 7' dichlorodihydrofluorescein diacetat (DCFH2-DA)14. Denna molekyl är färglös och lipofila. Diffusionen av DCFH2-DA över cellmembranet gör att den kan vara handlat av intracellulära esteraser, som deacetylates det i DCFH2, gör den cell ogenomtränglig. Åtgärder av flera typer av ROS (väteperoxid, peroxynitrit, hydroxylradikaler, kväveoxid och peroxy radikaler) på DCFH2 oxidera det till DCF som är fluorescerande (rapporterade Ex / Em: 485-500 nm/515-530 nm) och kan upptäckas med hjälp av ett flöde cytometer utrustad med ett standardfilter för fluorescein (FL1 kanal). Superoxid reagerar inte starkt med DCFH2 men kan reagera med en annan sond dihydroethidium (DHE) ge de fluorescerande produkt 2-hydroxyethidium (liksom andra fluorescerande superoxid-oberoende oxidationsprodukter)15. De fluorescerande produkterna DHE oxidation kan upptäckas med hjälp av en magnetisering våglängd 518 nm och emissionsvåglängden 605 nm (FL2 kanal). Även om det är relativt enkelt att använda, kräver utnyttjande av dessa sonder för detektion av ROS kunskap om sina begränsningar och försiktig införlivandet av färgning förfaranden och kontroller till specifika analysen utförs för att ha giltiga experimentella resultat och slutsatser. Följande protokoll visar användningen av ett kommersiellt tillgängliga kit anställa dessa 2 givare för att mäta ROS av flödescytometri. Vi fläcken primade benmärg-derived makrofager med dessa sonder och framkalla ROS produktion genom FcγR cross-linking. Vi presenterar representativa uppgifter som erhållits med hjälp av detta protokoll och betona lämpliga försiktighetsåtgärder som måste vidtas för framgångsrika experiment.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:623px;" width="623">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-BSA IgG1</td>
			<td style="width:121px;">Innovative Research</td>
			<td style="width:119px;">IBSA9E2C2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-mouse CD16/32</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:121px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">565853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">123108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647&#160;</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">101218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">beta-mercaptoethanol (BME)</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M3148-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">C57BL/6J&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Jackson labs</td>
			<td>Stock No.000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CM-H2DCFDA</td>
			<td style="width:121px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">C6827</td>
			<td>Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dihydroethidium (DHE)</td>
			<td style="width:121px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">D11347</td>
			<td>Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM 1x</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM no phenol red</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31053-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMF Anhydrous&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">61094-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FITC Rat IgG2a, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L glutamine</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LADMAC cells</td>
			<td style="width:121px;">ATCC</td>
			<td>CRL-2420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MEM</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mouse IFN-g</td>
			<td style="width:121px;">GoldBio</td>
			<td style="width:119px;">1360-06-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td style="width:121px;">EMD Milipore</td>
			<td style="width:119px;">106425</td>
			<td>Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Novocyte flow cytometer with autosampler</td>
			<td style="width:121px;">Acea</td>
			<td style="width:119px;">2060R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pyocyanin (ROS inducer)</td>
			<td style="width:121px;">Cayman chemical</td>
			<td style="width:119px;">10009594</td>
			<td>Can be a substitute for inducer in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ROS-ID total ROS/superoxide detection kit</td>
			<td style="width:121px;">ENZO</td>
			<td style="width:119px;">ENZ-51010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium pyruvate (100mM)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric measurement of ros production in macrophages in response to fc&#947;r cross-linking

Oxidativa eller respiratorisk burst används att beskriva snabb konsumtion av syre och generering av reaktiva syreradikaler (ROS) av fagocyter som svar på olika immun stimuli. ROS som genereras under immunsystemets aktivering utövar potent Antimikrobiell aktivitet främst genom ROS förmåga att skada DNA och proteiner, orsakar döden av mikroorganismer. Att kunna mäta ROS produktion reproducibly och med lätthet är nödvändigt för att bedöma olika vägar och molekyler till denna mekanism av värd försvar bidrag. I detta papper, vi demonstrera användningen av fluorescerande sonder och flödescytometri för att upptäcka ROS produktion. Även om utbrett, är fluorescerande mätning av ROS notoriskt problematiska, särskilt när det gäller mätning av ROS som induceras av specifika och inte mitogena stimuli. Vi presenterar en detaljerad metod för att upptäcka ROS som genereras till följd av specifika FcγR stimulering börjar med makrofag generation, grundning, färgning, FcγR cross-linking och slutar med flöde flödescytometrisk analys.

Använder protokollet beskrivs inom, presenterar vi representativa uppgifter som visar flöde flödescytometrisk detektion av ROS produktion som härrör från stimulering av WT C57BL/6J BMDMs genom FcγR. Som förväntat, vi observerar minimala förändringar i FL1 eller FL2 fluorescens ovan bakgrundsnivåerna i ostimulerade celler (figur 3A, jämför ”färgade, ostimulerade” vs ”ofärgade, ostimulerade” dot tomter). Vi ser en markant ökning i FL1 och FL2 fluorescens när celler st...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃŽÂ³R Cross-linking at JoVE.com

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃƒÅ½Ã‚Â³R Cross-linking

Denna studie visar användningen av flödescytometri att upptäcka reaktivt syre arter (ROS) produktion följd aktivering av FcγR. Denna metod kan användas för att bedöma förändringar i antimikrobiella och redox signalering funktion av fagocyter i svar till immunkomplex, opsonized mikroorganismer eller direkt FcγR cross-linking.

Flödescytometrisk flödesmätning av ROS produktion i makrofager som svar på FcγR Cross-linking

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...

Mätning av reaktiva syrearter eller ROS är notoriskt problematiskt. I denna video kommer vi att demonstrera reproducerbara mätning av ROS som svar på FC-gamma receptor crosslinking med hjälp av fluorescerande sonder och flöde cytometry. De viktigaste fördelarna med denna teknik är analysens reproducerbarhet och användningen av denna metod med specifika antigena stimuli, inte bara mitogener eller kända ROS-inducerare.Dysregulated ROS produktion är centralt för utvecklingen av många sjukdomar såsom kronisk granulomatös sjukdom eller CGD. Exakt mäta ROS skulle kunna utgöra en del av den molekylära diagnos av CGD. Att studera FC-medierad ROS-produktion är viktigt för att studera immunodeficiencies, såsom CGD, men också för att studera autoimmuna sjukdomar, eller neurodegenerativa sjukdomar, där för mycket ROS leder till oxidativ stress och inflammation.Tidpunkten för analysen är kritisk. Jag skulle råda någon som försöker detta protokoll för första gången att förbereda grundligt och göra en mock experiment om möjligt. Visuell demonstration av denna metod är kritisk för att betona stegen i analysen som behöver särskild uppmärksamhet såsom tidpunkten för analysen.Till att börja med förbereda benmärg-härledda makrofager med hjälp av betingade medier som beskrivs i den medföljande textprotokoll. Efter priming makrofager över natten, aspirera supernatanten och tvätta cellerna en gång med PBS. Serum svälta cellerna genom att ersätta media med samma volym av låg-serum DMEM.För varje mus kommer en platta att behandlas med anti-BSA IgG1 medan serum svälter medan den andra kommer att lämnas obehandlad. Lägg endast till LOW-serum DMEM till de obehandlade plattorna och tillsätt low-serum DMEM som innehåller 2,5 mikrogram per milliliter murin anti-BSA IgG1 till de behandlade plattorna. Var noga med att inkludera ytterligare en obehandlad platta för varje experiment att fungera som flödet cytometrisk kompensation kontroll.Inkubera plattorna fyra timmar vid 37 grader Celsius, 5%CO2. Under den fyra timmar långa inkubationen, förbered en 2X-lösning av de reaktiva syrearterna. För varje 10 milliliter av låg-serum DMEM behövs, tillsätt fyra mikroliter av en oxidativ stressdetektionsreagens och fyra mikroliter av en superoxiddetektionsreagens.Förbered sedan 2X-sondlösningarna som innehåller endast det oxidativa stressdetektionsreagensen eller som endast innehåller superoxiddetektionsreagensen. Efter den fyra timmar långa inkubationen, skörda cellerna genom att försiktigt skrapa plattorna, samla dem i märkta, fem milliliter rundbottnad rör. Centrifugera rören vid 750 gånger g i fem minuter.Var noga med att hålla reda på vilka celler som behandlades med murine anti-BSA IgG1. Därefter tvätta cellen pellets med två milliliter PBS att bli av med eventuella kvarvarande anti-BSA från de behandlade cellerna. Centrifugera rören vid 750 gånger g i fem minuter.Därefter aspirera PBS och resuspend cell pelleten i 600 mikroliter av låg-serum DMEM. Från 600-microliter cell suspension, aliquot 200 mikroliter i prelabeled fem-milliliter rund-botten rör. Från de obehandlade cellerna, ta 200 mikroliter för rören märkta ostimulerade, 200 mikroliter för rören märkta positiva inducerare, och 200 mikroliter för rören märkta positiva inducerare plus hämmare.Sedan, från anti-BSA IgG1 behandlade celler, ta 200 mikroliter för rör märkta FC-gamma receptor crosslinking, och 200 mikroliter för rör märkta FC-gamma receptor crosslinking plus inhibitor. Från de obehandlade cellerna som ska användas för kompensationskontroller, ta 200 mikroliter för röret märkt obefläckade ostimulerade, 200 mikroliter för den gröna plus inducerningen kontroll, och 200 mikroliter för orange plus inducerkontroll. Bered en 2X-positiv inducerlösning genom att späda ut pyocyanin en till 100 i var och en av 2X-problösningarna till en koncentration av 500 mikromolar.Förbered sedan en 2X BSA-lösning genom att späda ut BSA-stamlösningen i 2X-sondlösningen för att få en 2X-koncentration på två mikrogram per milliliter. Innan du börjar den specifika stimulering, såsom FC-gamma receptor crosslinking, se till att alla reagenser och celler är redo och placera rören på is i den ordning som de kommer att stimuleras. För flödescytmetrar med en autosampler, ta del av den tid som cytometern tar för att analysera ett prov och gå vidare till nästa.Var noga med att inkludera alla blandning och sond-tvättsteg. Timing är mycket kritisk för denna analys. För att varje tillstånd ska vara välkontrollerat måste stimuleringen utföras på exakt 30 minuter för varje tillstånd.Stimulera cellerna i ordning och införliva fördröjningen mellan provförvärv av flödescytometern. Om du utför manuell kompensation på denna punkt, stimulera kontrollrör som ska användas för ersättning genom att tillsätta 200 mikroliter av 2X-sondlösningen som innehåller det oxidativa stressdetektionsreagensen och induceraren i rören som är märkta med grönt plus inducer. Tillsätt sedan 200 mikroliter av 2X-probelösning som innehåller superoxiddetektionsreagensen och induceraren i rören som är märkta med orange plus inducerare.Inkubera cellerna i 30 minuter i mörker. Med hjälp av flödescytometriprogramvaran, generera och märka tre provfiler för kontrollen, opåverkad, obehandlad, den gröna plus induceraren, och de orange plus inducerareprover, se till att indikera kanaler och parametrar som ska analyseras. Ange också önskade stoppvillkor.När kontrollproverna har ställts in, generera och märka en liknande uppsättning filer för de experimentella proverna. Kör nu det obefläckade, obehandlade provet. Öppna en punkt plot för framåt scatter på X-axeln kontra sidan scatter på Y-axeln och rita en grind runt cellerna av intresse, exklusive döda celler och skräp.Därefter använder denna cell grind för att öppna en annan punkt tomt av den första fluorescens markör, FL1, på X-axeln, jämfört med den andra fluorescens markör, FL2, på Y-axeln. Rita en inledande kvadrantgrind och justera sedan kvadrantporten så att händelserna visas på den nedre vänstra kvadranten av FL1 kontra FL2-observationsområdet. När du är klar, kör den gröna plus inducerare prov.Justera spänningen så att händelserna visas på nedre vänstra och högra kvadranterna i FL1 kontra FL2-observationsområdet. Sedan, tillämpa denna kompensation matris till alla tre exempelfiler. Kör nu det orange plus inducerprovet.Justera spänningen så att händelserna visas på de övre och nedre vänstra kvadranterna i FL1 kontra FL2-observationsområdet, och tillämpa sedan denna kompensationsmatris på alla tre provfilerna. Kontrollera varje kompensationsfil och se till att ouppsända, obehandlade händelser visas på den nedre vänstra kvadranten, de gröna plus inducerhändelserna visas på nedre vänstra och högra kvadranterna, och händelserna med orange plus inducerer visas på de övre och nedre vänstra kvadranterna i FL1 kontra FL2-tomten. Sedan, tillämpa kompensation matris till alla de experimentella provfiler.När manuell kompensation har utförts och en experimentell mall har erhållits, gå vidare till de experimentella proverna. Innan du behandlar cellerna med en positiv inducerare eller utför FC-gamma receptorcell stimulering, markera vilka rör kommer att få en ROS-hämmare. Behandla dessa celler med ROS-hämmaren minst 30 minuter före den positiva induceraren eller FC-gammareceptorn stimulering genom att lägga till en mikroliter av hämmaren till 200 mikroliter av återanvända celler för en slutlig koncentration av fem millimolar.För ostimulerade celler, behandla cellerna med 200 mikroliter av 2X sondlösning utan någon stimulans läggas till de 200 mikroliter av cell suspension märkt färgade, ostimulerade. För positiva kontroller, behandla cellerna med 200 mikroliter av 2X-positiva inducerlösning till 200 mikroliter av cell suspension märkt positiv inducerare eller positiv inducerare plus inhibitor. Slutligen, för celler stimuleras av FC-gamma receptorn crosslinking, behandla dem med 200 mikroliter av 2X BSA lösning läggas till 200 mikroliter av cellen suspensionen märkt FC-gamma receptor crosslinking eller FC-gamma receptor crosslinking plus inhibitor.Inkubera cellerna i 30 minuter i mörker. Efter inkubation, analysera proverna i den ordning de stimulerades, med hjälp av flödescytometern och analysmallarna som genereras under de inledande kompensationsstegen. De data som visas här visar flödescytometrisk detektion av reaktiv syreradikasproduktion som härrör från stimulering av makrofager genom FC-gamma-receptorn.Det finns en markant ökning av FL1 och FL2 fluorescens när celler stimuleras med FC-gamma receptor crosslinking agent. När celler behandlades med den reaktiva syreartens inhibitor före FC-gamma-receptorn crosslinking, denna ökade fluorescens förs tillbaka till basala nivåer. Däremot dessa dot tomter presentera ett misslyckat experiment, där suboptimala reaktiva syrearter produktion som ett resultat av FC-gamma receptor stimulering observerades.För att belysa de stora skillnaderna mellan de förväntade procentsatserna, eller MFI ökar, visar dessa data hur samplingar med en minimal ökning av FL1 och FL2 fluorescens ser ut. Det aktuella protokollet utnyttjar ett 24-timmars priming-steg. Vid jämförelse av en 24-timmars jämfört med en 48-timmars priming tid, fanns det ingen markant skillnad i andelen celler positiva för den gröna oxidativa stress reagens.Men ökade priming tid till 48 timmar ökade andelen celler positiva för orange fluorescens. De viktigaste sakerna att komma ihåg när du utför detta förfarande är planering framåt, och att vara konsekvent om tidpunkten för analysen att få reproducerbara resultat.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Multicolor flödescytometrisystem Analyser av cellulära immunförsvaret i Rhesus makaker

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Kvantitativ mätning av immunsvaret och sova i<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Analys av lösningsmedel tillgänglighet av cysteinrester på<em&gt; Majs rayado fino-virus</em&gt; Virusliknande partiklar framställda i<em&gt; Nicotiana benthamiana</em&gt; Växter och tvärbindning av peptider till VLP

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Att använda RNA-interferens för att undersöka det medfödda immunsvar i musmakrofager

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

En enkel Flödescytometriska metod för att mäta glukosupptag och glukostransportör uttryck för monocyt Subpopulationer i helblod

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

Flödescytometrisk analys av partikelbundna Bet v 1 Allergen i PM10

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

Flödescytometrisk analys av Natural Killer Cell lytisk aktivitet i humant helblod

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolering av Salmonella typhimurium-innehållande Phagosomes från makrofager

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolering och In Vitro kultur av murina och mänskliga alveolära makrofager

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Flöde Cytometric Analys av lymfocyt infiltration i centrala nervsystemet under experimentell autoimmun encefalomyelit

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...