Name: flow cytometric measurement of ros production in macrophages in response to fc&#947;r cross-linking
Uploaded: 2019-03-07T15:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃŽÂ³R Cross-linking at JoVE.com

Yazarlar Tigno-Aranjuez Laboratuvar Laboratuvar bakım ve fare koloni bakım yardım için Madelyn H. Miller, Omar Cardona, Andjie Jeudy ve Roopin Singh gibi diğer üyelerine teşekkür etmek istiyorum. Bu araştırma için destek hibe R00 HL122365 ve J.T.T-A. başlangıç fonlar tarafından sağlanan

İletişim kuralı işleme hayvan için kurumsal hayvan bakım ve kullanım komite Central Florida Üniversitesi tarafından (IACUC) kabul edildi.
1. kemik iliği nesil makrofajlar (BMDMs) türetilmiş
<ol><li>
Kültür medyası hazırlama
	<ol>
<li>D10F temel ortam hazırlamak: Dulbecco'nın modifiye kartal orta (DMEM için), % 10 ısı inaktive fetal sığır serum (FBS), 1 mM sodyum pyruvate, 10 mM 4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic asit (HEPES) ve 0.05 mM β-m...

<ol>
	<li>Winterbourn, C. C., Kettle, A. J., Hampton, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+Oxygen+Species+and+Neutrophil+Function.">Reactive Oxygen Species and Neutrophil Function.</a> Annual Review of Biochemistry. 85, 765-792 (2016).</li><li>Schieber, M., Chandel, N. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=ROS+function+in+redox+signaling+and+oxidative+stress.">ROS function in redox signaling and oxidative stress.</a> Current Biology. 24 (10), R453-R462 (2014).</li><li>Robinson, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Reactive+oxygen+species+in+phagocytic+leukocytes.">Reactive oxygen species in phagocytic leukocytes.</a> Histochemistry and Cell Biology. 130 (2), 281-297 (2008).</li><li>Thomas, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+phagocyte+respiratory+burst:+Historical+perspectives+and+recent+advances.">The phagocyte respiratory burst: Historical perspectives and recent advances.</a> Immunology Letters. 192, 88-96 (2017).</li><li>Fang, F. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antimicrobial+actions+of+reactive+oxygen+species.">Antimicrobial actions of reactive oxygen species.</a> MBio. 2 (5), (2011).</li><li>Iles, K. E., Forman, H. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Macrophage+signaling+and+respiratory+burst.">Macrophage signaling and respiratory burst.</a> Immunologic Research. 26 (1-3), 95-105 (2002).</li><li>Curnutte, J. T., Whitten, D. M., Babior, B. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Defective+superoxide+production+by+granulocytes+from+patients+with+chronic+granulomatous+disease.">Defective superoxide production by granulocytes from patients with chronic granulomatous disease.</a> New England Journal of Medicine. 290 (11), 593-597 (1974).</li><li>Good, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatal+(chronic)+granulomatous+disease+of+childhood:+a+hereditary+defect+of+leukocyte+function.">Fatal (chronic) granulomatous disease of childhood: a hereditary defect of leukocyte function.</a> Seminars in Hematology. 5 (3), 215-254 (1968).</li><li>Holmes, B., Page, A. R., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Studies+of+the+metabolic+activity+of+leukocytes+from+patients+with+a+genetic+abnormality+of+phagocytic+function.">Studies of the metabolic activity of leukocytes from patients with a genetic abnormality of phagocytic function.</a> Journal of Clinical Investigation. 46 (9), 1422-1432 (1967).</li><li>Windhorst, D. B., Page, A. R., Holmes, B., Quie, P. G., Good, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+pattern+of+genetic+transmission+of+the+leukocyte+defect+in+fatal+granulomatous+disease+of+childhood.">The pattern of genetic transmission of the leukocyte defect in fatal granulomatous disease of childhood.</a> Journal of Clinical Investigation. 47 (5), 1026-1034 (1968).</li><li>Dikalov, S. I., Harrison, D. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Methods+for+detection+of+mitochondrial+and+cellular+reactive+oxygen+species.">Methods for detection of mitochondrial and cellular reactive oxygen species.</a> Antioxidants &amp; Redox Signaling. 20 (2), 372-382 (2014).</li><li>Held, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Introduction+to+Reactive+Oxygen+Species:+Measurement+of+ROS+in+cells.">An Introduction to Reactive Oxygen Species: Measurement of ROS in cells.</a> White Paper. , (2015).</li><li>Woolley, J. F., Stanicka, J., Cotter, T. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recent+advances+in+reactive+oxygen+species+measurement+in+biological+systems.">Recent advances in reactive oxygen species measurement in biological systems.</a> Trends in Biochemical Sciences. 38 (11), 556-565 (2013).</li><li>Chen, X., Zhong, Z., Xu, Z., Chen, L., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=2',7'-Dichlorodihydrofluorescein+as+a+fluorescent+probe+for+reactive+oxygen+species+measurement:+Forty+years+of+application+and+controversy.">2',7'-Dichlorodihydrofluorescein as a fluorescent probe for reactive oxygen species measurement: Forty years of application and controversy.</a> Free Radical Research. 44 (6), 587-604 (2010).</li><li>Zielonka, J., Kalyanaraman, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hydroethidine-+and+MitoSOX-derived+red+fluorescence+is+not+a+reliable+indicator+of+intracellular+superoxide+formation:+another+inconvenient+truth.">Hydroethidine- and MitoSOX-derived red fluorescence is not a reliable indicator of intracellular superoxide formation: another inconvenient truth.</a> Free Radical Biology and Medicine. 48 (8), 983-1001 (2010).</li><li>Swamydas, M., Lionakis, M. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation,+purification+and+labeling+of+mouse+bone+marrow+neutrophils+for+functional+studies+and+adoptive+transfer+experiments.">Isolation, purification and labeling of mouse bone marrow neutrophils for functional studies and adoptive transfer experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (77), e50586 (2013).</li></ol>

DCFH2-DA ve DHE tabanlı algılama ROS, yaygın olarak kullanılan teknik14,15var. Kullanım kolaylığı ve Kinetik Mikroplaka biçimleri için bu ROS probları adaptasyon, floresan mikroskopi veya akış sitometrik analiz onların popülerlik için katkıda bulunmuştur. Ancak, çalışmalarımız FcγR-aracılı makrofaj fonksiyonların, değil gibi görünüyor bu tahlil için FcγR çapraz bağlı hücre akış sitometrik çözümlemesi gerçekle?...

Reaktif oksijen türleri (ROS) reaktif molekülleri veya serbest radikallerin yan ürünleri ( 1' de gözden) Aerobik solunum vardır. Bunlar, süperoksit anyon, peroksit, hidrojen peroksit, radikal hidroksil ve hidroksil iyonları, diğerleri arasında içerir. Normal fizyolojik şartlarda ROS esas olarak mitokondri ve Nikotinamid adenin dinükleotit fosfat (NADPH) oxidases tarafından üretilen ve çeşitli enzimler ve protein süperoksit dismutaz ve glutatyon gibi hızla detoxified. ROS veya ROS çıkarılması yeteneğini bir üründe abartılı bir üretim oksidatif stres, mademki proteinler, lipidler ve hücresel stres ya da ölüm ve patolojik hastalık durumlarında yol DNA hasar Reaktif oksijen türleri teşvik neden olabilir. Ancak, bu şu anda ROS de sinyal molekülleri (redoks sinyal) hareket edebilir ve çeşitli moleküller ve yolu ara ürün ROS-aracılı değişiklik etkileyebilir hücresel metabolizma, nükleer silahların yayılmasına karşı hayatta kalma, inflamatuar beğeni topluyor sinyalizasyon ve2yaşlanma. Fagositik hücreleri, ROS antimikrobiyal aktivite sırasında sözde "solunum patlama"1,3,4,5,6sağlayan önemli bir rol oynar. Dış uyaranlara karşı fagositler tepki sırasında NADPH oksidaz karmaşık (p40phox, p47phox, p67phox) bileşenlerinin sitozol gp91phox ve p22phox içeren phagosomal membran translocate alt birimleri, ve Rac1/2 eylemleri ile birlikte, bir tam işlevsel NADPH oksidaz enzimi karmaşık form. Birleştirilmiş NADPH oksidaz sonra NADPH oksijen süperoksit phagosomal çarpıtması içinde azaltmak için kullanır. Süperoksit anyon doğrudan zarar verebilir ya da hidrojen peroksit dismutated. Süperoksit ve hidrojen peroksit büyük ölçüde reaktif hidroksil radikalleri oluşturmak için diğer molekülleri ile tepki verebilir. Hasar bu ROS proteinler kümelerde demir-kükürt ile reaksiyon veya sonuçta kısıtlı mikrobiyal metabolizma veya mikrop5ölüm önde gelen DNA'ın temel oksidasyon neden aracılık ettiği. ROS esnasında solunum patlamış üretilen ve NADPH oksidaz enzimi karmaşık önemi resimli klinik hastalarda kronik Granulomatous hastalığı (ÇGD)7,8,9, 10. CGD olan bireyler sahip gp91phox, mutasyonların ROS üretim ve bakteri ve mantarlar genellikle immün bireyler ile bir endişe olmayan tekrarlayan enfeksiyonlara yatkınlık eksikliği sonuçlanan. Bu nedenle, oksidatif stres, Redoks Sinyal veya ana savunma, varlık ölçmek mümkün eğitim ROS üretim gerçek zamanlı olarak yararlı bir çaba olup.
Tedbir ROS üretim veya oksidatif stres11,12,13sonuçlarını birden çok testleri kullanılmıştır. Bunlar arasında en çok kullanılan biridir floresan sonda 2', 7' dichlorodihydrofluorescein diacetate (DCFH2-DA)14. Bu renksiz ve lipofilik moleküldür. DCFH2-DA hücre zarı arasında Difüzyon hücre içi esterazlar tarafından üzerine hareket hangi hücre geçirimsiz işleme DCFH2, deacetylates sağlar. ROS (hidrojen peroksit, peroxynitrite, hidroksil radikalleri, nitrik oksit ve peroxy radikaller) DCFH2 üzerinde birden çok türde eylemler floresan olan DCF okside (Ex bildirilen / Em: 485-500 nm/515-530 nm) ve bir akış kullanarak tespit edilebilir sitometresi floresein (FL1 kanal) için ayarla Standart filtre ile donatılmıştır. Süperoksit şiddetle DCFH2 ile cevap vermiyor ama floresan ürün 2-hydroxyethidium (yanı sıra diğer floresan süperoksit bağımsız oksidasyon ürünleri)15verim için başka bir sonda dihydroethidium ile (DHE) tepki verebilir. DHE oksidasyon floresan ürünlerin bir uyarma dalga boyu 518 kullanarak tespit edilebilir nm ve emisyon dalga boyu 605 nm (FL2 kanal). Bu sondalar ROS algılanması için kullanımı gerektirir onların sınırlamalar bilgi ve yordamlar ve denetimleri geçerli olması için gerçekleştirilen özel tahlil içine deneysel boyama dikkatli ana kullanmak nispeten basit olmasına rağmen sonuçları ve sonuçlara. Aşağıdaki iletişim kuralı tarafından Akış Sitometresi ROS ölçmek için tasarlanmış bu 2 probları istihdam bir ticari olarak mevcut kit kullanımı gösterilmiştir. Bu sonda ile astarlanmış kemik iliği türevi makrofajlar leke ve FcγR cross-linking aracılığıyla ROS üretim teşvik. Bu iletişim kuralı kullanılarak elde temsilcisi verileri sunmak ve başarılı deneme için üstlenilen uygun önlemler stres.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:623px;" width="623">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-BSA IgG1</td>
			<td style="width:121px;">Innovative Research</td>
			<td style="width:119px;">IBSA9E2C2</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Alexa Fluor 647 Rat IgG2b, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400626</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Anti-mouse CD16/32</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">101302</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to Alexa Fluor 647</td>
			<td style="width:121px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:119px;">565853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Anti-mouse F4/80 antibody conjugated to FITC</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">123108</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">Anti-mouse/human CD11b antibodyconjugated to Alexa Fluor 647&#160;</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">101218</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">beta-mercaptoethanol (BME)</td>
			<td style="width:121px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">M3148-100ml</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Bovine Serum Albumin (BSA) FractionV</td>
			<td style="width:121px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">BP1600-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">C57BL/6J&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Jackson labs</td>
			<td>Stock No.000664</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">CM-H2DCFDA</td>
			<td style="width:121px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">C6827</td>
			<td>Can be a substitute for oxidative stress detection reagent in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Dihydroethidium (DHE)</td>
			<td style="width:121px;">Molecular Probes</td>
			<td style="width:119px;">D11347</td>
			<td>Can be a substitute for superoxide detection reagent in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM 1x</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-013-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMEM no phenol red</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">31053-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">DMF Anhydrous&#160;</td>
			<td style="width:121px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:119px;">61094-1000</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Fetal Bovine Serum (FBS)</td>
			<td style="width:121px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">97068-085</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">FITC Rat IgG2a, &#954; Isotype Ctrl Antibody</td>
			<td style="width:121px;">BioLegend</td>
			<td style="width:119px;">400506</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">HEPES (1M)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">15630-080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">L glutamine</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25030-081</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">LADMAC cells</td>
			<td style="width:121px;">ATCC</td>
			<td>CRL-2420</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">MEM</td>
			<td style="width:121px;">Corning</td>
			<td style="width:119px;">10-010-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">mouse IFN-g</td>
			<td style="width:121px;">GoldBio</td>
			<td style="width:119px;">1360-06-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">N-Acetyl-L-cysteine</td>
			<td style="width:121px;">EMD Milipore</td>
			<td style="width:119px;">106425</td>
			<td>Can be a substitute for ROS inhibitor/scavenger in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Novocyte flow cytometer with autosampler</td>
			<td style="width:121px;">Acea</td>
			<td style="width:119px;">2060R</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Pyocyanin (ROS inducer)</td>
			<td style="width:121px;">Cayman chemical</td>
			<td style="width:119px;">10009594</td>
			<td>Can be a substitute for inducer in the Enzo kit</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">ROS-ID total ROS/superoxide detection kit</td>
			<td style="width:121px;">ENZO</td>
			<td style="width:119px;">ENZ-51010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Sodium pyruvate (100mM)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">11360-070</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Trypsin-EDTA (0.25%)</td>
			<td style="width:121px;">Gibco</td>
			<td style="width:119px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

flow cytometric measurement of ros production in macrophages in response to fc&#947;r cross-linking

Oksidatif veya solunum aşırı oksijen tüketiminin hızlı ve Reaktif oksijen türlerine (ROS) nesil açıklamak için çeşitli bağışıklık uyaranlara yanıt olarak fagositler tarafından kullanılır. ROS bağışıklık etkinleştirme sırasında oluşturulan aracılığıyla öncelikle ROS yeteneklerini DNA ve proteinler, zarar vermek için güçlü antimikrobiyal aktivitesi mikroorganizmaların ölümüne neden olan uygular. ROS üretim tekrarlanarak ve kolaylıkla ölçmek için güçlü olmak çeşitli yollar ve bu konak savunma mekanizmasının moleküllerine katkısını değerlendirmek için gereklidir. Bu kağıt, floresan problar kullanımını gösteren ve Akış Sitometresi ROS üretim algılamak için. Her ne kadar yaygın olarak kullanılan, ROS floresan ölçümü rootkitler, özel ve değil mitogenic uyaranlara tarafından indüklenen ROS ölçümü açısından özellikle problemlidir. Biz makrofaj üretimi, astar, Boyama, FcγR cross-linking ve akış sitometrik çözümlemesi ile biten başlayarak belirli FcγR uyarılması sonucu olarak oluşturulan ROS algılamak için detaylı bir metodoloji mevcut.

İçinde özetlenen protokolü kullanarak, biz temsilcisi veri akış sitometrik algılama ROS üretim WT C57BL/6J BMDMs FcγR aracılığıyla uyarılması sonucu gösteren mevcut. Beklendiği gibi biz çok az değişiklik FL1 veya FL2 floresan arka plan düzeylerine unstimulated hücrelerdeki yukarıda içinde gözlemlemek (şekil 3A, "lekeli, unstimulated" vs "günahı, unstimulated" nokta çizer karşılaştırın). Hücreleri cross-linking agent (şekil 3A,...

Watch this Scientific Journal Video about Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃŽÂ³R Cross-linking at JoVE.com

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To FcÃƒÅ½Ã‚Â³R Cross-linking

Bu çalışmada FcγR etkinleştirilmesinden kaynaklanan Reaktif oksijen türleri (ROS) üretim algılamak için Akış Sitometresi kullanımını gösterir. Bu yöntem değişiklikleri antimikrobiyal ve fagositler yanıt bağışıklık kompleksleri, opsonized mikroorganizmalar veya doğrudan FcγR cross-linking fonksiyonlu Redoks değerlendirmek için kullanılabilir.

Akış sitometrik ölçüm makrofajlar FcγR Cross-linking yanıt ROS üretim

The oxidative or respiratory burst is used to describe the rapid consumption of oxygen and generation of reactive oxygen species (ROS) by phagocytes in ...

Reaktif oksijen türlerinin veya ROS'un ölçümü oldukça sorunludur. Bu videoda, fc-gama reseptör çapraz floresan problar ve akış sitometri kullanarak yanıt olarak ROS tekrarlanabilir ölçüm gösterecektir. Bu tekniğin başlıca avantajları, sadece mitojenler veya bilinen ROS indükleyicileri değil, bu yöntemin spesifik antijenik uyaranlarla kullanılması ve titrenin tekrarlanabilirliğidir.Disregulated ros üretimi kronik granülomatöz hastalık veya CGD gibi birçok hastalığın gelişiminde merkezi bir yerdir. ROS'un doğru bir şekilde ölçülmesi CGD'nin moleküler tanısının bir parçasını oluşturabilir. FC aracılı ROS üretiminin incelenmesi, CGD gibi immün yetmezliklerin incelenmesinde önemlidir, aynı zamanda oto-immün hastalıkların veya çok fazla ROS'un oksidatif stres ve inflamasyona yol açtığı nörodejeneratif hastalıkların incelenmesinde de önemlidir.Tazbın zamanlaması çok önemli. Ben iyice hazırlamak ve mümkünse sahte bir deney yapmak için ilk kez bu protokolü deneyen birisi tavsiye ederim. Bu yöntemin görsel gösterimi, talın zamanlaması gibi özellikle dikkat gerektiren bir talın adımlarını vurgulamak için çok önemlidir.Başlamak için, eşlik eden metin protokolünde açıklandığı gibi koşullu ortam kullanarak kemik iliği türevi makrofajlar hazırlayın. Makrofajları bir gecede astarladıktan sonra, supernatant aspire ve PBS ile bir kez hücreleri yıkayın. Serum düşük serum DMEM aynı hacimde medya değiştirerek hücreleri açlıktan.Her fare için, bir tabak anti-BSA IgG1 ile tedavi edilirken, diğeri tedavi edilmezse serum açlıktan ölür. İşlenmemiş plakalara sadece düşük serumlu DMEM ekleyin ve tedavi edilen plakalara mililitrebaşına 2,5 mikrogram içeren düşük serumlu DMEM ekleyin. Akış sitometrik kompanse kontrolü olarak hareket etmek için her deneme için bir ek işlenmemiş plaka eklediğinden emin olun.Plakaları 4 saat 37 santigrat derecede, %5 CO2'de kuluçkaya yatırın. Dört saatlik kuluçka sırasında, reaktif oksijen türleri probları bir 2X çözeltisi hazırlamak. Gerekli her 10 mililitre düşük serum DMEM için, bir oksidatif stres algılama reaktifi dört mikrolitre ve bir süperoksit algılama reaktifi dört mikrolitre ekleyin.Daha sonra, sadece oksidatif stres algılama reaktifi içeren veya sadece süperoksit algılama reaktifini içeren 2X prob çözeltilerini hazırlayın. Dört saatlik kuluçkadan sonra, hücreleri yavaşça kazıyarak, etiketli, beş mililitrelik yuvarlak dipli tüplerde toplayarak hasat edin. Tüpleri 750 kez g olarak beş dakika santrifüj edin.Hangi hücrelerin murine anti-BSA IgG1 ile tedavi edildiğini takip edin. Daha sonra, tedavi edilen hücrelerden kalan anti-BSA'dan kurtulmak için hücre peletlerini iki mililitre PBS ile yıkayın. Tüpleri 750 kez g olarak beş dakika santrifüj edin.Daha sonra, PBS aspire ve düşük serum DMEM 600 mikrolitre hücre pelet resuspend. 600 mikrolitrelik hücre süspansiyonundan, önceden etiketlenmiş beş mililitrelik yuvarlak alt tüplere 200 mikrolitre aliquot. İşlenmemiş hücrelerden, uyarılmamış olarak etiketlenmiş tüpler için 200 mikrolitre, pozitif indükleyici etiketli tüpler için 200 mikrolitre ve pozitif indükleyici artı inhibitör etiketli tüpler için 200 mikrolitre alın.Daha sonra, anti-BSA IgG1 tedavi hücrelerden, FC-gama reseptör crosslinking etiketli tüpler için 200 mikrolitre almak, ve tüpler için 200 mikrolitre FC-gama reseptör crosslinking artı inhibitörü etiketli. Tedavi edilmeyen hücrelerden telafi kontrolleri için kullanılacak, lekesiz olarak etiketlenmiş tüp için 200 mikrolitre, yeşil artı indükleyici kontrolü için 200 mikrolitre ve turuncu artı indükleyici kontrolü için 200 mikrolitre alın. Pyocyanin'i 2X prob çözeltilerinin her birine 1ila 100 oranında seyrelterek 2X pozitif indükleyici çözeltisi hazırlayın.Daha sonra, mililitre başına iki mikrogram 2X konsantrasyonu elde etmek için 2X prob çözeltisi BSA stok çözeltisini seyrelterek 2X BSA çözeltisi hazırlayın. FC-gama reseptör çapraz bağlama gibi spesifik stimülasyon başlamadan önce, tüm reaktifler ve hücrelerin hazır olduğundan emin olun ve onlar uyarılır sırasına göre buz tüpleri yerleştirin. Otomatik örnekleyicili akış sitometreleri için, sitometrenin bir örneği analiz etmek ve diğerine geçmek için aldığı zamana dikkat edin.Karıştırma ve sonda yıkama adımlarını eklediğinden emin olun. Zamanlama bu töz için çok önemlidir. Her durumun iyi kontrol edilebilmesi için, stimülasyonun her durum için tam 30 dakika içinde yapılması gerekir.Hücreleri sırayla uyarın ve akış sitometresi ile örnek alımları arasındaki gecikme süresini birleştirin. Bu noktada manuel kompanzasyon yapıyorsa, oksidatif stres algılama reaktifi ve indükleyici yi içeren 2X prob çözeltisinin 200 mikrolitresini yeşil artı indükleyici olarak işaretlenmiş tüplere ekleyerek telafi için kullanılacak kontrol tüplerini teşvik edin. Daha sonra, 200 mikrolitre 2X prob çözeltisi süperoksit algılama reaktifi ve indükleyici içeren tüpler içine turuncu artı indükleyici işaretli ekleyin.Karanlıkta hücreleri 30 dakika kuluçkaya yatırın. Akış sitometri yazılımını kullanarak, analiz edilecek kanalları ve parametreleri belirtmekten emin olmak için, kontrol, lekesiz, işlenmemiş, yeşil artı indükleyici ve turuncu artı indükleyici örnekleri için üç örnek dosya oluşturun ve etiketleyin. Ayrıca, istenilen durak koşullarını girin.Kontrol örnekleri ayarlandıktan sonra, deney örnekleri için benzer bir dosya kümesi oluşturun ve etiketleyin. Şimdi, lekelenmemiş, işlenmemiş örneği çalıştırın. Y ekseninde X ekseninde ileri dağılım için bir nokta çizimi açın ve ölü hücreler ve enkaz hariç ilgi hücrelerinin etrafına bir geçit çizin.Daha sonra, Ilk floresan belirteci, FL1, X ekseni üzerinde başka bir nokta arsa açmak için bu hücrenin kapısını kullanın, ikinci floresan marker karşı, FL2, Y-ekseni üzerinde. İlk çeyreğin kapısını çizin ve ardından fl1 ile FL2 çiziminin sol alt çeyreğinde olayların görünmesi için kadranda kapıyı ayarlayın. Bittiğinde, yeşil artı indükleyici örnek çalıştırın.Fl1 ile FL2 çiziminin sol ve sağ alt çeyreğinde olayların görünmesi için voltajı ayarlayın. Ardından, bu telafi matrisini üç örnek dosyaya da uygulayın. Şimdi, portakal artı indükleyici örneğini çalıştırın.Voltajı, fl1 ile FL2 çiziminin sol üst ve alt alt kadranında görünecek şekilde ayarlayın ve bu telafi matrisini üç örnek dosyaya da uygulayın. Her tazminat dosyasını kontrol edin ve lekesiz, işlenmemiş olayların sol alt kadranda görünmesini, yeşil artı indükleyici olayların sol alt ve sağ kadranda görünmesini ve turuncu artı indükleyici olayların FL1'e karşı FL2 arsasının üst ve alt sol kadranda görünmesini sağlayın. Ardından, tüm deneme örnek dosyalarına telafi matrisi uygulayın.Manuel kompanzasyon yapıldıktan ve deneysel bir şablon alındıktan sonra deneysel numunelere geçin. Pozitif bir indükleyici ile hücreleri tedavi veya FC-gama reseptör hücre stimülasyon iletmeden önce, tüpler bir ROS inhibitörü alacak işareti. Bu hücreleri, pozitif indükleyici veya FC-gama reseptör stimülasyonundan en az 30 dakika önce, beş milimonun son konsantrasyonu için 200 mikrolitre resuspended hücreye inhibitör mikrolitresini ekleyerek ROS inhibitörü ile tedavi edin.Uyarılmamış hücreler için, hücreleri 2X prob çözeltisinin 200 mikrolitresi ile, lekeli, uyarılmamış olarak etiketlenmiş 200 mikrolitre hücre süspansiyonuna herhangi bir uyarıcı eklenmeden tedavi edin. Pozitif kontroller için, pozitif indükleyici veya pozitif indükleyici artı inhibitör etiketli hücre süspansiyon 200 mikrolitre için 2X pozitif indükleyici çözeltisi 200 mikrolitre ile hücreleri tedavi. Son olarak, FC-gama reseptör crosslinking tarafından uyarılmış hücreler için, 2X BSA çözeltisi 200 mikrolitre ile tedavi 200 hücre süspansiyon 200 mikrolitre fc-gama reseptör crosslinking veya FC-gamma reseptör crosslinking plus inhibitörü etiketli.Karanlıkta hücreleri 30 dakika kuluçkaya yatırın. Kuluçkadan sonra, ilk telafi adımları sırasında oluşturulan akış sitometresini ve analiz şablonlarını kullanarak numuneleri uyarıldıkları sırada analiz edin. Burada gösterilen veriler, fc-gama reseptörü aracılığıyla makrofajların uyarılmasından kaynaklanan reaktif oksijen türlerinin üretiminin akış sitometrik saptanmasını göstermektedir.Fc-gama reseptör çapraz bağlama ajanı ile uyarıldığında fl1 ve FL2 floresansında belirgin bir artış vardır. Fc-gama reseptör çapraz bağlama önce hücreleri reaktif oksijen türleri inhibitörü ile tedavi edildiğinde, bu artan floresan bazal seviyelere geri getirilir. Buna karşılık, bu nokta çizimler fc-gama reseptör stimülasyonu sonucu suboptimal reaktif oksijen türleri üretimi gözlendi başarısız bir deney mevcut.Beklenen yüzdeler veya MFI artışları arasındaki büyük farkları vurgulamak için, bu veriler FL1 ve FL2 floresanlarında en az artış gösteren örneklerin neye benzediğini gösterir. Geçerli protokol 24 saatlik bir astar adımı kullanır. 24 saatlik bir primleme süresi ile 48 saatlik bir astarlama süresini karşılaştırırken, yeşil oksidatif stres reaktifi için pozitif hücrelerin yüzdesi arasında belirgin bir fark yoktu.Ancak, 48 saat priming süresini artırmak turuncu floresan için pozitif hücrelerin yüzdesi arttı. Bu yordamı gerçekleştirirken hatırlanması gereken en önemli şey önceden planlama ve tekrarlanabilir sonuçlar elde etmek için tahkikat zamanlaması hakkında tutarlı olmaktır.

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Flow Cytometric Measurement Of ROS Production In Macrophages In Response To Fc&#947;R Cross-linking

Multicolor Flow Cytometry Analyses of Cellular Immune Response in Rhesus Macaques

Rhesus Makak maymunlarının Hücresel Bağışıklık Tepkisi Multicolor Sitometrisi Analizleri

The rhesus macaque model is currently the best available model for HIV-AIDS with respect to understanding the pathogenesis as well as for the development ...

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

Quantitative Measurement of the Immune Response and Sleep in Drosophila

İmmün Yanıt ve Uyku içinde kantitatif ölçümü<em&gt; Drosophila</em

A complex interaction between the immune response and  host behavior has been described in a wide range of species. Excess sleep, in  particular, is known ...

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Analysis of the Solvent Accessibility of Cysteine Residues on Maize rayado fino virus Virus-like Particles Produced in Nicotiana benthamiana Plants and Cross-linking of Peptides to VLPs

Sistein Kalıntılarının Solvent Erişilebilirlik Analizi<em&gt; Mısır rayado fino virüsü</emÜretilen&gt; Virüs gibi parçacıklar<em&gt; Nicotiana benthamiana</emVLP&#39;ler için Peptidlerin&gt; Bitkiler ve Çapraz bağlama

Mimicking  and exploiting virus properties and physicochemical and physical  characteristics holds promise to provide solutions to some of  the world's ...

Using RNA-interference to Investigate the Innate Immune Response in Mouse Macrophages

Fare Makrofagların yılında Doğuştan Bağışıklık Tepkisi Soruşturma RNA girişimi kullanma

Macrophages are key phagocytic innate immune cells.  When macrophages encounter a pathogen, they produce antimicrobial proteins and compounds to kill the ...

A Simple Flow Cytometric Method to Measure Glucose Uptake and Glucose Transporter Expression for Monocyte Subpopulations in Whole Blood

Basit Akım Sitometrisi Yöntemi Tüm Kan Monosit subpopulations için glikoz alımını ve Glikoz Transporter Anlatım Tedbir

Monocytes are innate immune cells that can be activated by pathogens and inflammation associated with certain chronic inflammatory diseases. Activation of ...

Flow Cytometric Analysis of Particle-bound Bet v 1 Allergen in PM10

PM10 parçacık bağlı Bet v 1 Allergen Akışı Sitometrik Analizi

Flow cytometry is a method widely used to quantify suspended solids such as cells or bacteria in a size range from 0.5 to several tens of micrometers in ...

Flow Cytometric Analysis of Natural Killer Cell Lytic Activity in Human Whole Blood

İnsan Tüm Kan Natural Killer Hücre Parçalayıcı Faaliyet Akışı Sitometrik Analizi

NK cell cytotoxicity is a widely used measure to determine the effect of outside intervention on NK cell function. However, the accuracy and ...

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Isolation of Salmonella typhimurium-containing Phagosomes from Macrophages

Salmonella typhimuriumyalıtım-makrofajlar üzerinden Phagosomes içeren

Salmonella typhimurium is a facultative intracellular bacterium that causes gastroenteritis in humans. After invasion of the lamina propria, S. ...

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Isolation and In Vitro Culture of Murine and Human Alveolar Macrophages

Yalıtım ve fare ve insan alveoler makrofajlar Vitro kültürü

Alveolar macrophages are terminally differentiated, lung-resident macrophages of prenatal origin. Alveolar macrophages are unique in their long life and ...

Flow Cytometric Analysis of Lymphocyte Infiltration in Central Nervous System during Experimental Autoimmune Encephalomyelitis

Deneysel Otoimmün Ensefalomiyelit Sırasında Merkezi Sinir Sisteminde Lenfosit Infiltrasyonunun Akış Sitometrik Analizi

Multiple sclerosis (MS) is an autoimmune disease of the central nervous system (CNS) caused by the combination of environmental factors and susceptible ...