Name: preparation of gushukang (gsk) granules for in vivo and in vitro experiments
Uploaded: 2019-05-09T12:30:00
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Cette étude a été soutenue par des subventions de la National Natural Science Foundation of China (81804116, 81673991, 81770107, 81603643, et 81330085), le programme pour l'équipe innovante, le ministère des Sciences et de la Technologie de la Chine (2015RA4002 à WYJ), le programme pour Équipe innovante, Ministère de l'éducation de la Chine (IRT1270 à WYJ), Shanghai TCM Medical Center of Chronic Disease (2017ZZ01010 à WYJ), Three Years Action to Accelerate the Development of Traditional Chinese Medicine Plan (ZY(2018-2020)-CCCX-3003 to WYJ), et projets nationaux clés de développement de la recherche (2018YFC1704302).

Toutes les procédures expérimentales ont été effectuées avec l'approbation du Comité institutionnel de soins et d'utilisation des animaux de l'Université de Shanghai de TCM (SZY201604005).
1. Préparation et administration de la solution de travail GSK
<ol><li>Calculez les doses équivalentes de granules GSK pour la souris.<ol>
<li>Calculer la surface du corps en fonction de l'équation Meeh-Rubner15: surface du corps k x (poids corporel2/3)/1000, où les valeurs...

<ol>
	<li>Shu, B., Shi, Q., Wang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shen+(Kidney)-tonifying+principle+for+primary+osteoporosis:+to+treat+both+the+disease+and+the+Chinese+medicine+syndrome.">Shen (Kidney)-tonifying principle for primary osteoporosis: to treat both the disease and the Chinese medicine syndrome.</a> Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (9), 656-661 (2015).</li><li>Zhao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+naturally+derived+small+compound+Osthole+inhibits+osteoclastogenesis+to+prevent+ovariectomy-induced+bone+loss+in+mice.">The naturally derived small compound Osthole inhibits osteoclastogenesis to prevent ovariectomy-induced bone loss in mice.</a> Menopause. 25 (12), 1459-1469 (2018).</li><li>Liu, S. F., Sun, Y. L., Li, J., Dong, J. C., Bian, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Herbal+Medicine:+Er-Xian+Decoction+and+Er-Xian-containing+Serum+for+In+vivo+and+In+vitro+Experiments.">Preparation of Herbal Medicine: Er-Xian Decoction and Er-Xian-containing Serum for In vivo and In vitro Experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55654 (2017).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+systemic+bone+protective+effects+of+Gushukang+granules+in+ovariectomized+mice+by+inhibiting+osteoclastogenesis+and+stimulating+osteoblastogenesis.">The systemic bone protective effects of Gushukang granules in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis and stimulating osteoblastogenesis.</a> Journal of Pharmacological Sciences. 136 (3), 155-164 (2018).</li><li>Bian, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oleanolic+acid+exerts+an+osteoprotective+effect+in+ovariectomy-induced+osteoporotic+rats+and+stimulates+the+osteoblastic+differentiation+of+bone+mesenchymal+stem+cells+in+vitro.">Oleanolic acid exerts an osteoprotective effect in ovariectomy-induced osteoporotic rats and stimulates the osteoblastic differentiation of bone mesenchymal stem cells in vitro.</a> Menopause. 19 (2), 225-233 (2012).</li><li>Zhao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oleanolic+acid+exerts+bone+protective+effects+in+ovariectomized+mice+by+inhibiting+osteoclastogenesis.">Oleanolic acid exerts bone protective effects in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis.</a> Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 76-85 (2018).</li><li>Tang, D. 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L., Wang, L., Bi, X. L., Chen, B. B., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gushukang+exerts+osteopreserve+effects+by+regulating+Vitamin+D+and+Calcium+metabolism+in+ovariectomized+mice.">Gushukang exerts osteopreserve effects by regulating Vitamin D and Calcium metabolism in ovariectomized mice.</a> Journal of Bone Mineral Metabolism. , 1-11 (2018).</li><li>Cui, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+study+of+Shen+(Kidney)tonifying+prescription+Gushukang+in+Preventing+and+Treating+Primary+Osteoporosis.">Mechanistic study of Shen (Kidney)tonifying prescription Gushukang in Preventing and Treating Primary Osteoporosis.</a> Journal of Chinese Medical University. 30 (16), 351-354 (2001).</li><li>Wang, Y., Shang, K., Li, Y. K., Tao, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+gushukang+on+osteoclast+cultured+from+type+I+diabetic+rat+in+vitro-a+preliminary+study.">Effect of gushukang on osteoclast cultured from type I diabetic rat in vitro-a preliminary study.</a> Chinese Journal of Bone Tumor and Bone Disease. 3 (12), 22-24 (2004).</li><li>Zhang, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pharmacology Experiment. , (1996).</li><li>Zhao, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophosphamide+causes+osteoporosis+in+C57BL/6+male+mice:+suppressive+effects+of+cyclophosphamide+on+osteoblastogenesis+and+osteoclastogenesis.">Cyclophosphamide causes osteoporosis in C57BL/6 male mice: suppressive effects of cyclophosphamide on osteoblastogenesis and osteoclastogenesis.</a> Oncotarget. 8 (58), 98163-98183 (2017).</li><li>Zhong, L. 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B., Jacob, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+practice+guide+for+dose+conversion+between+animals+and+human).">A simple practice guide for dose conversion between animals and human).</a> Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+of+the+traditional+Chinese+medicine+xuesaitong+on+intestinal+ischemia-reperfusion+injury+in+rats.">Protective effect of the traditional Chinese medicine xuesaitong on intestinal ischemia-reperfusion injury in rats.</a> International Journal of Clinical and Experiments Medicine. 8 (2), 1768-1779 (2015).</li><li>Jiang, Y. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Ling+Qi+Juan+Gan+capsule+drug-containing+serum+on+PDGF-induced+proliferation+and+JAK/STAT+signaling+of+HSC-T6+cells.">Effects of Ling Qi Juan Gan capsule drug-containing serum on PDGF-induced proliferation and JAK/STAT signaling of HSC-T6 cells.</a> Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 21 (9), 663-667 (2013).</li><li>Guo, C. Y., Ma, X. J., Liu, Q., Yin, H. J., Shi, D. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Chinese+herbal+drug-containing+serum+for+activating+blood,+activating+blood+and+dispelling+toxin+on+TNF-alpha-induced+adherence+between+endothelial+cells+and+neutrophils+and+the+expression+of+MAPK+pathway.">Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating blood, activating blood and dispelling toxin on TNF-alpha-induced adherence between endothelial cells and neutrophils and the expression of MAPK pathway.</a> Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 35 (2), 204-209 (2015).</li><li>Li, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+issues+in+methology+of+Chinese+herbs+serum+pharmcology.">Some issues in methology of Chinese herbs serum pharmcology.</a> Zhong Yao Xin Yao Yu Lin Chuang Yao Li. 10 (5), 263 (1999).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+Chinese+herbs+serum+pharmcology+methodological+study.">A review of Chinese herbs serum pharmcology methodological study.</a> Nan Jing Zhong Yi Yao Da Xue Xue Bao. 18 (4), 254 (2002).</li><li>Pacifici, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen,+cytokines,+and+pathogenesis+of+postmenopausal+osteoporosis.">Estrogen, cytokines, and pathogenesis of postmenopausal osteoporosis.</a> Journal. Bone Mineral Research. 11, 1043-1051 (1996).</li><li>Ammann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+expressing+soluble+tumor+necrosis+factor-receptor+are+protected+against+bone+loss+caused+by+estrogen+deficiency.">Transgenic mice expressing soluble tumor necrosis factor-receptor are protected against bone loss caused by estrogen deficiency.</a> Journal Clinical Investigation. 99, 1699-1703 (1997).</li><li>Kimble, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+block+of+interleukin-1+and+tumor+necrosis+factor+is+required+to+completely+prevent+bone+loss+in+the+early+postovariectomy+period.">Simultaneous block of interleukin-1 and tumor necrosis factor is required to completely prevent bone loss in the early postovariectomy period.</a> Endocrinology. 136, 3054-3061 (1995).</li></ol>

Granules d'agents TCM sont devenus l'un des choix communs pour les formulations ou les prescriptions. Les granules de GSK sont composés de plusieurs plantes médicinales basées sur des expériences cliniques ou la théorie de la MTC, et ils exercent de meilleurs effets curatifs avec moins d'effets secondaires4. Par rapport à la décoction de l'eau, les granules ont ces avantages : bon goût, commodité de livraison, stockage à long terme, protocole standard et effets curatifs cohérents, ainsi...

La médecine traditionnelle chinoise (MTC) est l'une des approches complémentaires et alternatives importantes pour traiter l'ostéoporose1,2. La décoction d'eau est la forme de base et la plus couramment utilisée de la formule3. Cependant, des inconvénients existent également : mauvais goût, inconvénients pour le transport, courte durée de conservation et protocoles incohérents, limitant les utilisations ainsi que les effets curatifs. Pour éviter les inconvénients ci-dessus ainsi que de poursuivre de meilleurs effets, granules ont été développés et ont été largement utilisés4. Bien que de nombreuses études aient exploré les mécanismes pharmacologiques d'un ou de plusieurs composants efficaces des granules5,6,7, les mécanismes exacts et les processus pharmacologiques sous-jacents sont encore difficile à identifier. C'est parce que trop de composants efficaces d'un granule peuvent simultanément exercer des effets similaires ou opposés4. Par conséquent, le développement d'un protocole standard pour préparer les granules avant de livrer à l'organisme aurait non seulement un grand impact sur les résultats thérapeutiques, mais est également nécessaire pour les essais in vivo et in vitro.
En outre, les effets curatifs des granules dans la clinique sont difficiles à confirmer et à identifier exactement à l'aide d'études in vitro ou ex vivo, ce qui crée un défi parce que les mécanismes pharmacologiques sont trop complexes. Pour résoudre ce problème, la préparation du sérum contenant des médicaments a été proposée pour la première fois par Tashino dans les années 19808. Dès lors, de nombreux chercheurs ont appliqué le sérum contenant des médicaments à la phytothérapie, y compris les granules9,10,11. Actuellement, le choix du sérum contenant des médicaments pour les enquêtes in vitro est considéré comme une stratégie qui imite étroitement les conditions physiologiques.
Les granules de Gushukang (GSK) ont été développés pour traiter l'ostéoporose postménopausique (POP) basée sur la pratique clinique à la lumière de la théorie de TCM. Les granules de GSK empêchent la perte d'os dans les souris ovariectomized (OVX) in vivo, inhibent la résorption osteoclastic d'os, et stimulent la formation osteoblastic d'os4. Par conséquent, Li et coll.12 ont constaté que les granules de GSK ont des effets protecteurs osseux chez les souris OVX en améliorant les activités du récepteur du calcium pour stimuler la formation osseuse. Pour confirmer les effets os-protecteurs aussi bien que les effets pharmacologiques des granules de GSK, les auteurs fournissent ici une procédure détaillée pour la préparation des solutions de travail et du sérum de drogue (GSK granule). En outre, cet article décrit l'application des granules de GSK dans un modèle osteoporotic de souris OVX-induit et le sérum de granule-contenant de GSK pour l'osteoclastogenesis/osteoblastogenesis in vitro.
Les granules DE GSK sont composés de plusieurs herbes13,14 et peuvent être complètement dissous dans saline facilement. Par conséquent, saline sert de véhicule. Les souris opérées par Sham (Sham) et LES souris OVX ont été administrées le même volume de saline que les souris administrées par les granulés. Les doses équivalentes de granules GSK pour la souris ont été calculées sur la base de l'équation Meeh-Rubner15. Cette équation a non seulement l'avantage d'obtenir des doses sûres, mais garantit également des effets pharmacologiques15. Les trois doses de granules GSK ont été générées comme suit: (1) GSKL: OVX - granules GSK à faible dose, 2 g/kg/jour. (2) GSKM : OVX et granules GSK à dose moyenne, 4 g/kg/jour. (3) GSKH : OVX et granules GSK à forte dose, 8 g/kg/jour. Des souris dans les groupes gskL, GSKM et GSKH ont été administrées intragastriquement des granules de GSK. Le carbonate de calcium (600 mg/comprimé) avec vitamine D3 (125 unité/comprimé international), par exemple, dans un produit mature et commercialisé (p. ex., Caltrate [CAL]) pour le traitement et la prévention de l'ostéoporose, a été utilisé comme un contrôle positif.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Hyclone 
			laboratories</td>
			<td>SH30265.018</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Glycerophosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5422</td>
			<td>Osteoblastogenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caltrate (CAL)</td>
			<td>Wyeth</td>
			<td>L96625</td>
			<td>Animal interventation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>SLAC Laboratory 
			Animal Co. Ltd.</td>
			<td>Random</td>
			<td>Ainimal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethsome</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438</td>
			<td>Cell frozen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>60-00-4</td>
			<td>Samples treatmnet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>FL-24562</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gushukang granules</td>
			<td>kangcheng companyin china</td>
			<td>Z20003255</td>
			<td>Herbal prescription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus BX50</td>
			<td>Olympus BX50</td>
			<td>Images for osteoclastogenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid 2-phosphate sequinagneium slat hyclrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960-5G</td>
			<td>Osteoblastogenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI300B</td>
			<td>Osteocast and osteoblast imagine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-300-25-10</td>
			<td>Osteoclastogenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#924;icro-CT</td>
			<td>Scanco 
			Medical AG</td>
			<td>&#956;CT80 radiograph microtomograph</td>
			<td>Bone Structural analsysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RANKL</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>11682-HNCHF</td>
			<td>Osteoclastogenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley</td>
			<td>SLAC Laboratory 
			Animal Co. Ltd.</td>
			<td>Random</td>
			<td>Blood serum collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tartrate-Resistant Acid Phosphate (TRAP) Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A-1KT</td>
			<td>TRAP staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of gushukang (gsk) granules for in vivo and in vitro experiments

La phytothérapie traditionnelle chinoise joue un rôle comme méthode alternative dans le traitement de nombreuses maladies, telles que l'ostéoporose postménopausique (POP). Les granules de Gushukang (GSK), une prescription commercialisée en Chine, ont des effets protecteurs osseux dans le traitement du POP. Avant l'administration au corps, une procédure standard de préparation est généralement nécessaire, qui vise à promouvoir la libération des constituants actifs à partir d'herbes premières et d'améliorer les effets pharmacologiques ainsi que les résultats thérapeutiques. Cette étude propose un protocole détaillé pour l'utilisation des granules GSK in vivo et in vitro essais expérimentaux. Les auteurs fournissent d'abord un protocole détaillé pour calculer les doses appropriées pour l'animal des granules pour l'enquête in vivo : pesée, dissolution, stockage, et administration. Deuxièmement, cet article décrit des protocoles pour le balayage de micro-CT et la mesure des paramètres d'os. La préparation des échantillons, les protocoles d'exécution de la machine à micro-CT et la quantification des paramètres osseux ont été évalués. Troisièmement, des granules GSK contenant du sérum sont préparés, et le sérum contenant des médicaments est extrait pour l'ostéoclastogenèse in vitro et l'ostéoblastogenesis. Les granules de GSK ont été administrés intragastriquement deux fois par jour aux rats pendant trois jours consécutifs. Le sang a ensuite été recueilli, centrifuge, inactivé et filtré. Enfin, le sérum a été dilué et utilisé pour effectuer l'ostéoclastogenèse et l'ostéoblastogenesis. Le protocole décrit ici peut être considéré comme une référence pour les études pharmacologiques des médicaments d'ordonnance à base de plantes, tels que les granules.

Les résultats de la micro-ToCont ont indiqué que les souris OVX présentaient une perte osseuse importante par rapport aux souris témoins salins (figure 1A). L'intervention (90 jours) des granulés GSK a considérablement augmenté la BMD, en particulier dans le groupe GSKM (figure 1B). Les paramètres de structure osseuse, tels que BMD, BV/TV, Tb.N, et Tb.Th, ont été quantifiés. Les traitements de granule de GSK ont mené ...

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Preparation Of Gushukang GSK Granules for In Vivo and In Vitro Experiments

Cet article fournit un protocole détaillé pour la préparation d'une solution de travail de granules de Gushukang pour les études animales et de granule GSK contenant du sérum pour les expériences in vitro. Ce protocole peut être appliqué aux études pharmacologiques des plantes médicinales ainsi qu'aux prescriptions d'expériences in vivo et in vitro.

Préparation des granules de Gushukang (GSK) pour les expériences in vivo et in vitro

Traditional Chinese herbal medicine plays a role as an alternative method in treating many diseases, such as postmenopausal osteoporosis (POP). Gushukang ...

Ce protocole prévoit la préparation d’une solution de travail de granules pour les études in vivo, ainsi que la préparation de sérum contenant du granule pour des expériences in vitro. Un avantage de cette technique est que la méthode peut être facilement répétée en raison du faible coût des matériaux et des animaux que vous créez pour les expériences. Commencez par ajouter huit, 16 et 24 grammes de granules Gushukang, ou GSK, à des tubes individuels de 50 millilitres.Ajouter 48 millilitres d’eau à chaque tube et secouer les tubes pour dissoudre complètement les granules. Ensuite, placez 1,6 comprimé de carbonate de calcium complété par de la vitamine D3 dans un autre tube de 50 millilitres, et dissoudre les comprimés en 48 millilitres de solution saline avec secousses. Pour l’administration intragastrique des solutions, d’abord doucement mais fermement retenir manuellement un mois, femelle, C57 Noir 6 souris pendant deux à trois minutes.Lorsque la souris s’est calmée, chargez une aiguille de gavage numéro 12 de 40 millimètres avec 0,24 millilitres d’une solution de travail de granules GSK et placez l’aiguille de gavage dans la souris d’un côté de sa bouche jusqu’à ce que la résistance à l’aiguille soit ressentie, ce qui indique que l’aiguille a atteint l’estomac. Injectez tout le volume de solution de travail dans l’animal. Puis, rétractez l’aiguille de gavage, et retournez la souris dans sa cage pendant que les autres souris sont administrées GSK avant d’injecter 0,24 millilitres de carbonate de calcium et de vitamine D3 solution dans chaque souris de la même manière.Pour la collecte de sérum sanguin contenant gsk, après avoir livré les concentrations appropriées de GSK à un rat par gavage comme vient de le démontrer, confirmer un manque de réponse à pincement des pieds une heure après la dernière administration granule GSK. Faire une peau abdominale et une incision péritonéale, et exposer l’abdomen au fond du thorax. Utilisez du papier de soie pour enlever le tissu conjonctif de l’aorte abdominale pour exposer clairement le vaisseau, et utilisez une seringue de 10 millilitres équipée d’une aiguille de calibre 22 pour prélever le sang de l’aorte.Transférer le sang dans un tube stérile de 15 millilitres et placer le tube à la température ambiante pendant 30 à 60 minutes. Lorsque le sang a coagulé, centrifuger le tube pour séparer le sérum, et transférer tout le sérum pour un jusqu’à six rats dans un nouveau tube de 50 millilitres. Secouez le tube pour mélanger le sérail avant d’inactiver les composants du sérum dans un bain d’eau de 56 degrés Celsius pendant 30 minutes.Filtrez ensuite le sérum à l’aide d’un filtre à seringues hydrophiles polyéthersulfone de taille 0,22 micromètre-pore pour un stockage à moins 80 degrés Celsius jusqu’à un an. Pour l’ostéoclastogenèse in vitro, diluer les trois doses de sérum contenant GSK à un rapport d’un à quatre avec un minimum eagle’s moyen complété avec L-glutamine, ribonucleosides, et deoxyribonucleosides. Ajouter 200 microlitres de chaque dilution à chaque puits d’une culture macrophage de moelle osseuse dans une plaque de 96 puits.Puis, initier la génération ostéoclaste en stimulant chaque puits avec macrophage colonie stimulant facteur et activateur récepteur pour le facteur nucléaire kappa B ligand. Pour l’ostéoblastogenèse in vitro, ajoutez deux millilitres de sérum dilué contenant GSK à chaque puits d’une culture mésenchymale de cellules souches mésenchymales d’os de plaque de 24 puits. Les résultats de balayage de tomographie micro-calculée indiquent que les souris ovariectomized démontrent la perte significative d’os comparée aux souris salines de contrôle.L’intervention avec 90 jours de traitement de granule de GSK augmente considérablement la densité de moelle, particulièrement chez les animaux GSK-traités à dose moyenne. Le traitement de granule de GSK mène également à un nombre trabecular accru d’os, au volume d’os au-dessus du volume total, et à l’épaisseur trabecular d’os, mais à une séparation diminuée d’os os-trabecular. La coloration à l’acide résistante au tartrate, ou TRAP, révèle une augmentation du nombre d’ostéoclastes chez les souris ovariectomisées par rapport aux animaux témoins, tandis que les traitements de granules GSK diminuent la différenciation ostéoclaste trap-positive par rapport aux animaux ovariectomisés.Le sérum contenant du granule GSK réduit également le nombre d’ostéoclastes positifs au TRAP par rapport au sérum prélevé sur les animaux de contrôle. La pénétration réussie de l’aiguille dans l’aorte abdominale est essentielle pour garantir qu’un volume suffisamment élevé de sang est récolté à partir de chaque rat. Une exécution réussie de cette méthode devrait attribuer l’accumulation de 15 à 20 millimètres de sang, suffisamment de matériel pour être utilisé pour des expériences in vitro.

Research

JoVE Journal

Medicine

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