Name: preparation of gushukang (gsk) granules for in vivo and in vitro experiments
Uploaded: 2019-05-09T12:30:00
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Diese Studie wurde durch Stipendien der National Natural Science Foundation of China (81804116, 81673991, 81770107, 81603643 und 81330085), das Programm für Innovatives Team, Ministerium für Wissenschaft und Technologie chinas (2015RA4002 bis WYJ), das Programm für Innovatives Team, Bildungsministerium Chinas (IRT1270 bis WYJ), Shanghai TCM Medical Center of Chronic Disease (2017ZZ01010 bis WYJ), Dreijahre Aktion zur Beschleunigung der Entwicklung des Plans für traditionelle chinesische Medizin (ZY(2018-2020)-CCCX-3003 bis WYJ) und nationalen wichtigsten Forschungsentwicklungsprojekte (2018YFC1704302).

Alle experimentellen Verfahren wurden mit Genehmigung des Institutional Animal Care and Use Committee der Shanghai University of TCM (SZY201604005) durchgeführt.
1. Vorbereitung und Verwaltung der GSK-Arbeitslösung
<ol><li>Berechnen Sie die äquivalenten Dosen von GSK-Granulat für die Maus.<ol>
<li>Berechnen Sie die Körperoberfläche basierend auf der Meeh-Rubner-Gleichung15: Körperoberfläche = K x (Körpergewicht2/3)/1000, wobei die K-Werte 10,6 für den Menschen...

<ol>
	<li>Shu, B., Shi, Q., Wang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shen+(Kidney)-tonifying+principle+for+primary+osteoporosis:+to+treat+both+the+disease+and+the+Chinese+medicine+syndrome.">Shen (Kidney)-tonifying principle for primary osteoporosis: to treat both the disease and the Chinese medicine syndrome.</a> Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (9), 656-661 (2015).</li><li>Zhao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+naturally+derived+small+compound+Osthole+inhibits+osteoclastogenesis+to+prevent+ovariectomy-induced+bone+loss+in+mice.">The naturally derived small compound Osthole inhibits osteoclastogenesis to prevent ovariectomy-induced bone loss in mice.</a> Menopause. 25 (12), 1459-1469 (2018).</li><li>Liu, S. F., Sun, Y. L., Li, J., Dong, J. C., Bian, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Herbal+Medicine:+Er-Xian+Decoction+and+Er-Xian-containing+Serum+for+In+vivo+and+In+vitro+Experiments.">Preparation of Herbal Medicine: Er-Xian Decoction and Er-Xian-containing Serum for In vivo and In vitro Experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. 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F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophosphamide+causes+osteoporosis+in+C57BL/6+male+mice:+suppressive+effects+of+cyclophosphamide+on+osteoblastogenesis+and+osteoclastogenesis.">Cyclophosphamide causes osteoporosis in C57BL/6 male mice: suppressive effects of cyclophosphamide on osteoblastogenesis and osteoclastogenesis.</a> Oncotarget. 8 (58), 98163-98183 (2017).</li><li>Zhong, L. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Ling+Qi+Juan+Gan+capsule+drug-containing+serum+on+PDGF-induced+proliferation+and+JAK/STAT+signaling+of+HSC-T6+cells.">Effects of Ling Qi Juan Gan capsule drug-containing serum on PDGF-induced proliferation and JAK/STAT signaling of HSC-T6 cells.</a> Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 21 (9), 663-667 (2013).</li><li>Guo, C. Y., Ma, X. J., Liu, Q., Yin, H. J., Shi, D. 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Bone Mineral Research. 11, 1043-1051 (1996).</li><li>Ammann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+expressing+soluble+tumor+necrosis+factor-receptor+are+protected+against+bone+loss+caused+by+estrogen+deficiency.">Transgenic mice expressing soluble tumor necrosis factor-receptor are protected against bone loss caused by estrogen deficiency.</a> Journal Clinical Investigation. 99, 1699-1703 (1997).</li><li>Kimble, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+block+of+interleukin-1+and+tumor+necrosis+factor+is+required+to+completely+prevent+bone+loss+in+the+early+postovariectomy+period.">Simultaneous block of interleukin-1 and tumor necrosis factor is required to completely prevent bone loss in the early postovariectomy period.</a> Endocrinology. 136, 3054-3061 (1995).</li></ol>

Granulat von TCM-Agenten sind eine der gemeinsamen Entscheidungen für Formulierungen oder Rezepte geworden. GSK-Granulat besteht aus mehreren pflanzlichen Arzneimitteln auf der Grundlage klinischer Erfahrungen oder der TCM-Theorie, und sie üben bessere heilende Effekte mit weniger Nebenwirkungen4. Im Vergleich zur Wasserabkochung haben die Granulate folgende Vorteile: guter Geschmack, Lieferkomfort, Langzeitlagerung, Standardprotokoll und konsistente Heileffekte sowie höhere Produktivität. Der...

Die Traditionelle Chinesische Medizin (TCM) ist einer der wichtigen ergänzenden und alternativen Ansätze zur Behandlung von Osteoporose1,2. Wasserabkochung ist die grundlegende und am häufigsten verwendete Form der Formel3. Es gibt jedoch auch Nachteile: schlechter Geschmack, Unannehmlichkeiten für den Transport, kurze Haltbarkeit und inkonsistente Protokolle, Begrenzung der Verwendungen sowie die heilende Wirkung. Um die oben genannten Nachteile zu vermeiden und um bessere Effekte zu erzielen, wurden Granulate entwickelt und weit verbreitet4verwendet. Obwohl viele Studien die pharmakologischen Mechanismen einer oder mehrerer wirksamer Komponenten aus dem Granulat5,6,7untersucht haben, sind die genauen Mechanismen und zugrunde liegenden pharmakologischen Prozesse schwer zu identifizieren. Dies liegt daran, dass zu viele effektive Komponenten aus einem Granulat gleichzeitig ähnliche oder entgegengesetzte Effekte ausüben können4. Daher würde die Entwicklung eines Standardprotokolls zur Vorbereitung des Granulats vor der Lieferung an den Körper nicht nur einen großen Einfluss auf die therapeutischen Ergebnisse haben, sondern ist auch für In-vivo- und In-vitro-Assays erforderlich.
Darüber hinaus sind die heilenden Wirkungen von Granulaten in der Klinik schwer zu bestätigen und anhand von In-vitro- oder Ex-vivo-Studien genau zu identifizieren, was eine Herausforderung schafft, da die pharmakologischen Mechanismen zu komplex sind. Um dies zu lösen, wurde die Herstellung von drogenhaltigem Serum zuerst von Tashino in den 1980er Jahrenvorgeschlagen 8. Von da an wandten zahlreiche Forscher medikamentenhaltiges Serum auf die Kräutermedizin an, einschließlich Granulat9,10,11. Derzeit wird die Wahl des medikamentenhaltigen Serums für In-vitro-Untersuchungen als eine Strategie betrachtet, die physiologische Bedingungen genau nachahmt.
Gushukang (GSK) Granulat wurde entwickelt, um postmenopausale Osteoporose (POP) auf der Grundlage der klinischen Praxis im Lichte der Theorie der TCM zu behandeln. GSK-Granulat verhindert Knochenverlust bei ovariectomisierten (OVX) Mäusen in vivo, hemmt die osteoklastische Knochenresorption und stimuliert die osteoblastische Knochenbildung4. Daher fanden Li et al.12 heraus, dass GSK-Granulate bei OVX-Mäusen Knochenschutzwirkungen haben, indem sie die Aktivitäten des Calciumrezeptors zur Stimulierung der Knochenbildung verbessern. Zur Bestätigung der knochenschützenden Wirkungen sowie der pharmakologischen Wirkungen von GSK-Granulat stellen die Autoren hier ein detailliertes Verfahren zur Herstellung von Arbeitslösungen und Medikamenten (GSK-Granulat) -haltigem Serum zur Verfügung. Darüber hinaus beschreibt dieser Artikel die Anwendung von GSK-Granulat in einem OVX-induzierten osteoporotischen Mausmodell und GSK-Granulat-haltigem Serum für In-vitro-Osteoclastogenese/Osteoblastogenese.
GSK-Granulat besteht aus mehreren Kräutern13,14 und kann leicht in Derinline gelöst werden. Daher dient Saline als Fahrzeug. Scheinoperierte Mäuse (Sham) und OVX-Mäuse wurden das gleiche Volumen an Salin verabreicht wie die mit Granulat verabreichten Mäuse. Die Äquivalentdosen von GSK-Granulat für die Maus wurden auf der Grundlage der Meeh-Rubner-Gleichung15berechnet. Diese Gleichung hat nicht nur den Vorteil, sichere Dosierungen zu erhalten, sondern garantiert auch pharmakologische Effekte15. Die drei Dosierungen von GSK-Granulat wurden wie folgt erzeugt: (1) GSKL: OVX + niedrig dosierte GSK-Granulate, 2 g/kg/Tag. (2) GSKM: OVX + mitteldosiertes GSK-Granulat, 4 g/kg/Tag. (3) GSKH: OVX + hochdosiertes GSK-Granulat, 8 g/kg/Tag. Mäuse in den GSKL-, GSKM- und GSKH-Gruppen wurden intragastrisch mit GSK-Granulat verabreicht. Als Positivkontrolle wurde beispielsweise Calciumcarbonat (600 mg/Tablette) mit Vitamin D3 (125 internationale Einheit/Tablette) in einem ausgereiften und vermarkteten Produkt (z. B. Caltrat [CAL]) zur Behandlung und Vorbeugung von Osteoporose verwendet.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Hyclone 
			laboratories</td>
			<td>SH30265.018</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Glycerophosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5422</td>
			<td>Osteoblastogenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caltrate (CAL)</td>
			<td>Wyeth</td>
			<td>L96625</td>
			<td>Animal interventation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>SLAC Laboratory 
			Animal Co. Ltd.</td>
			<td>Random</td>
			<td>Ainimal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethsome</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438</td>
			<td>Cell frozen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>60-00-4</td>
			<td>Samples treatmnet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>FL-24562</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gushukang granules</td>
			<td>kangcheng companyin china</td>
			<td>Z20003255</td>
			<td>Herbal prescription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus BX50</td>
			<td>Olympus BX50</td>
			<td>Images for osteoclastogenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid 2-phosphate sequinagneium slat hyclrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960-5G</td>
			<td>Osteoblastogenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI300B</td>
			<td>Osteocast and osteoblast imagine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-300-25-10</td>
			<td>Osteoclastogenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#924;icro-CT</td>
			<td>Scanco 
			Medical AG</td>
			<td>&#956;CT80 radiograph microtomograph</td>
			<td>Bone Structural analsysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RANKL</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>11682-HNCHF</td>
			<td>Osteoclastogenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley</td>
			<td>SLAC Laboratory 
			Animal Co. Ltd.</td>
			<td>Random</td>
			<td>Blood serum collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tartrate-Resistant Acid Phosphate (TRAP) Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A-1KT</td>
			<td>TRAP staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of gushukang (gsk) granules for in vivo and in vitro experiments

Die traditionelle chinesische Kräutermedizin spielt eine Rolle als alternative Methode bei der Behandlung vieler Krankheiten, wie postmenopausale Osteoporose (POP). Gushukang (GSK) Granulat, ein vermarktetes Rezept in China, haben knochenschützende Wirkung bei der Behandlung von POP. Vor der Verabreichung an den Körper, ein Standard-Vorbereitungsverfahren ist allgemein erforderlich, die die Freisetzung von aktiven Bestandteilen aus Rohkräutern fördern und die pharmakologischen Wirkungen sowie therapeutische Ergebnisse zu verbessern. Diese Studie schlägt ein detailliertes Protokoll für die Verwendung von GSK-Granulat in in vivo- und in vitro-Experimentellen Assays vor. Die Autoren liefern zunächst ein detailliertes Protokoll zur Berechnung der tiergerechten Dosierungen von Granulaten für in vivo-Untersuchungen: Wiegen, Auflösen, Lagern und Verstoffen. Zweitens werden in diesem Artikel Protokolle für Mikro-CT-Scans und die Messung von Knochenparametern beschrieben. Die Probenvorbereitung, Protokolle zum Betrieb der Mikro-CT-Maschine und die Quantifizierung der Knochenparameter wurden ausgewertet. Drittens werden serumhaltige GSK-Granulate hergestellt und medikamentenhaltiges Serum für In-vitro-Osteoclastogenese und Osteoblastogenese extrahiert. GSK-Granulat wurde zweimal täglich an drei aufeinanderfolgenden Tagen intragastrisch an Ratten verabreicht. Anschließend wurde Blut entnommen, zentrifugiert, inaktiviert und gefiltert. Schließlich wurde Serum verdünnt und zur Durchführung von Osteoclastogenese und Osteoblastogenese verwendet. Das hier beschriebene Protokoll kann als Referenz für pharmakologische Untersuchungen von verschreibungspflichtigen pflanzlichen Arzneimitteln wie Granulaten betrachtet werden.

Die Ergebnisse des Mikro-CT-Scans zeigten, dass die OVX-Mäuse im Vergleich zu Saline-Kontrollmäusen einen signifikanten Knochenverlust zeigten (Abbildung 1A). Die Intervention (90 Tage) von GSK-Granulat hat die BMD stark erhöht, insbesondere in der GSKM-Gruppe (Abbildung 1B). Die Knochenstrukturparameter wie BMD, BV/TV, Tb.N und Tb.Th wurden quantifiziert. GSK-Granulatbehandlungen führten zu erhöhten BMD, BV/TV, Tb.N und Tb....

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Preparation Of Gushukang GSK Granules for In Vivo and In Vitro Experiments

Dieser Artikel enthält ein detailliertes Protokoll zur Vorbereitung einer Arbeitslösung von Gushukang-Granulat für Tierstudien und GSK-Granulat, das Serum für In-vitro-Experimente enthält. Dieses Protokoll kann auf pharmakologische Untersuchungen von pflanzlichen Arzneimitteln sowie auf Verschreibungen für In-vivo- und In-vitro-Experimente angewendet werden.

Vorbereitung von Gushukang (GSK) Granulat en for In Vivo und In Vitro Experiments

Traditional Chinese herbal medicine plays a role as an alternative method in treating many diseases, such as postmenopausal osteoporosis (POP). Gushukang ...

Dieses Protokoll bietet die Herstellung einer Arbeitslösung von Granulaten für In-vivo-Studien sowie die Herstellung von granulathaltigem Serum für In-vitro-Experimente. Ein Vorteil dieser Technik ist, dass die Methode aufgrund der geringen Kosten der Materialien und der Tiere, die Sie für die Experimente erstellen, leicht wiederholt werden kann. Beginnen Sie mit dem Hinzufügen von acht, 16 und 24 Gramm Gushukang, oder GSK, Granulat zu einzelnen 50-Milliliter-Röhren.Fügen Sie 48 Milliliter Wasser in jedes Rohr, und schütteln Sie die Rohre, um das Granulat vollständig aufzulösen. Dann 1,6 Tabletten Calciumcarbonat, ergänzt mit Vitamin D3, in eine weitere 50-Milliliter-Röhre geben und die Tabletten in 48 Milliliter Saline mit Schütteln auflösen. Für die intragastrische Verabreichung der Lösungen, zunächst sanft, aber fest manuell eine ein Monatige alte, weibliche, C57 Black 6 Maus für zwei bis drei Minuten zurückhalten.Wenn die Maus beruhigt ist, laden Sie eine 40-Millimeter-, Nummer 12-Gavage-Nadel mit 0,24 Millilitern einer Arbeitslösung von GSK-Granulat, und legen Sie die Gavage-Nadel in die Maus durch eine Seite des Mundes, bis der Nadelwiderstand gefühlt wird, was darauf hindeutet, dass die Nadel den Magen erreicht hat. Injizieren Sie das gesamte Volumen der Arbeitslösung in das Tier. Ziehen Sie dann die Gavage-Nadel zurück und geben Sie die Maus in ihren Käfig zurück, während den anderen Mäusen GSK verabreicht wird, bevor sie 0,24 Milliliter Calciumcarbonat und Vitamin-D3-Lösung auf die gleiche Weise in jede Maus injizieren.Für GSK-haltige Blutserum-Sammlung, nach der Lieferung der entsprechenden Konzentrationen von GSK an eine Ratte durch Gavage, wie gerade gezeigt, bestätigen sie einen Mangel an Reaktion auf Zehenkneifen eine Stunde nach der letzten GSK-Granulat-Verabreichung. Machen Sie eine Bauchhaut und Peritonealschnitt, und setzen Sie den Bauch auf dem Boden des Thorax. Verwenden Sie Tissue-Papier, um das Bindegewebe der Bauchaorta zu entfernen, um das Gefäß deutlich zu belichten, und verwenden Sie eine 10-Milliliter-Spritze, die mit einer 22-Spur-Nadel ausgestattet ist, um Blut aus der Aorta zu ziehen.Übertragen Sie das Blut in eine sterile 15-Milliliter-Röhre und stellen Sie die Röhre bei Raumtemperatur 30 bis 60 Minuten aufrecht. Wenn das Blut geklont ist, zentrifugieren Sie das Rohr, um das Serum zu trennen, und übertragen Sie das gesamte Serum für bis zu sechs Ratten in eine neue 50-Milliliter-Röhre. Schütteln Sie das Rohr, um die Sera zu mischen, bevor Sie die Serumkomponenten in einem 56-Grad-Celsius-Wasserbad für 30 Minuten inaktivieren.Filtern Sie dann das Serum durch einen hydrophilen Polyethersulfon-Spritzenfilter in Größe von 0,22 Mikrometer poregröße, um es bis zu einem Jahr bei minus 80 Grad Celsius zu lagern. Bei der In-vitro-Osteoclastogenese die drei Dosierungen von GSK-haltigem Serum im Verhältnis eins zu vier mit einem minimalen Eagle-Medium, ergänzt durch L-Glutamin, Ribonukleoside und Desoxyribonukleoside, verdünnen. Fügen Sie 200 Mikroliter jeder Verdünnung zu jedem Brunnen einer Knochenmarkmakrophagenkultur in einer 96-Well-Platte hinzu.Dann initiieren Osteoklast-Generation durch Stimulierung jeder Brunnen mit Makrophagen Kolonie-stimulierenden Faktor und Rezeptor-Aktivator für Kernfaktor-Kappa B Liganden. Für die In-vitro-Osteoblastogenese fügen Sie jedem Brunnen einer 24-Well-Platte mesenchymalen Stammzellkultur zwei Milliliter verdünntes GSK-haltiges Serum hinzu. Die Ergebnisse des Mikrocomputertomographie-Scans deuten darauf hin, dass eialisierte Mäuse im Vergleich zu Saline-Kontrollmäusen einen signifikanten Knochenverlust zeigen.Intervention mit 90 Tagen GSK-Granulatbehandlung erhöht die Knochenmarkdichte erheblich, insbesondere bei mit mittlerer Dosis behandelten GSK-behandelten Tieren. Die GSK-Granulatbehandlung führt auch zu einer erhöhten Trabekularknochenzahl, Knochenvolumen über das Gesamtvolumen und trabekuläre Knochendicke, aber zu einer verringerten Knochentrennung. Tartrate-resistente Säurephosphatase, oder TRAP, Färbung zeigt eine Zunahme der Anzahl der Osteoklasten in ovariectomisierten Mäusen im Vergleich zu Kontrolltieren, während GSK-Granulatbehandlungen TRAP-positive Osteoklastdifferenzierung im Vergleich zu den ovariectomisierten Tieren verringern.GSK-Granulat-haltiges Serum reduziert auch die Anzahl der TRAP-positiven Osteoklasten im Vergleich zu Serum, das von Kontrolltieren gesammelt wurde. Das erfolgreiche Eindringen der Nadel in die Bauchaorta ist entscheidend, um sicherzustellen, dass von jeder Ratte ein ausreichend volumenreiches Blut geerntet wird. Eine erfolgreiche Ausführung dieser Methode sollte die Ansammlung von 15 bis 20 MillimeterBlut zuteilen, genug Material, um für In-vitro-Experimente verwendet werden.

Research

JoVE Journal

Medicine

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