Name: preparation of gushukang (gsk) granules for in vivo and in vitro experiments
Uploaded: 2019-05-09T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Preparation Of Gushukang GSK Granules for In Vivo and In Vitro Experiments at JoVE.com

Questo studio è stato sostenuto da sovvenzioni della National Natural Science Foundation of China (81804116, 81673991, 81770107, 81603643 e 81330085), il programma per il Team Innovativo, Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina (2015RA4002 a WYJ), il programma per il Team Innovativo, Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina (2015RA4002 a WYJ), il programma per il Team Innovativo, Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina (2015RA4002 a WYJ), il programma per il Team Innovativo, il Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina (2015RA4002 a WYJ), il programma per il Team Innovativo, il Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina (2015RA4002 a WYJ), il programma per il Team Innovativo, il Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina (2015RA4002 a WYJ), il programma per il Team Innovativo, il Ministero della Scienza e della Tecnologia della Cina (2015RA4002 a WYJ Team innovativo, Ministero dell'Educazione della Cina (Da IRT1270 a WYJ), Shanghai TCM Medical Center of Chronic Disease (2017-01010 a WYJ), Tripyears Action to Accelerate the Development of Traditional Chinese Medicine Plan (Y(2018-2020)-CCCX-3003 to WYJ), e progetti chiave per lo sviluppo della ricerca (2018YFC1704302).

Tutte le procedure sperimentali sono state eseguite con l'approvazione di Institutional Animal Care and Use Committee della Shanghai University of TCM (S -Y201604005).
1. Preparazione e somministrazione della soluzione di lavoro GSK
<ol><li>Calcolare le dosi equivalenti di granuli GSK per il mouse.<ol>
<li>Calcolare la superficie del corpo in base all'equazione Meeh-Rubner15: superficie del corpo - K x (peso corporeo2/3)/1000, dove i valori K sono 10.6 per umano e 9.1 p...

<ol>
	<li>Shu, B., Shi, Q., Wang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shen+(Kidney)-tonifying+principle+for+primary+osteoporosis:+to+treat+both+the+disease+and+the+Chinese+medicine+syndrome.">Shen (Kidney)-tonifying principle for primary osteoporosis: to treat both the disease and the Chinese medicine syndrome.</a> Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (9), 656-661 (2015).</li><li>Zhao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+naturally+derived+small+compound+Osthole+inhibits+osteoclastogenesis+to+prevent+ovariectomy-induced+bone+loss+in+mice.">The naturally derived small compound Osthole inhibits osteoclastogenesis to prevent ovariectomy-induced bone loss in mice.</a> Menopause. 25 (12), 1459-1469 (2018).</li><li>Liu, S. F., Sun, Y. L., Li, J., Dong, J. C., Bian, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Herbal+Medicine:+Er-Xian+Decoction+and+Er-Xian-containing+Serum+for+In+vivo+and+In+vitro+Experiments.">Preparation of Herbal Medicine: Er-Xian Decoction and Er-Xian-containing Serum for In vivo and In vitro Experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55654 (2017).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+systemic+bone+protective+effects+of+Gushukang+granules+in+ovariectomized+mice+by+inhibiting+osteoclastogenesis+and+stimulating+osteoblastogenesis.">The systemic bone protective effects of Gushukang granules in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis and stimulating osteoblastogenesis.</a> Journal of Pharmacological Sciences. 136 (3), 155-164 (2018).</li><li>Bian, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oleanolic+acid+exerts+an+osteoprotective+effect+in+ovariectomy-induced+osteoporotic+rats+and+stimulates+the+osteoblastic+differentiation+of+bone+mesenchymal+stem+cells+in+vitro.">Oleanolic acid exerts an osteoprotective effect in ovariectomy-induced osteoporotic rats and stimulates the osteoblastic differentiation of bone mesenchymal stem cells in vitro.</a> Menopause. 19 (2), 225-233 (2012).</li><li>Zhao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oleanolic+acid+exerts+bone+protective+effects+in+ovariectomized+mice+by+inhibiting+osteoclastogenesis.">Oleanolic acid exerts bone protective effects in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis.</a> Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 76-85 (2018).</li><li>Tang, D. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osthole+Stimulates+Osteoblast+Differentiation+and+Bone+Formation+by+Activation+of+&#946;-Catenin-BMP+Signaling.">Osthole Stimulates Osteoblast Differentiation and Bone Formation by Activation of &#946;-Catenin-BMP Signaling.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 25 (6), 1234-1245 (2010).</li><li>Tashino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Serum+pharmacology"+and+"serum+pharmaceutical+chemistry":+from+pharmacology+of+Chinese+traditional+medicines+to+start+a+new+measurement+of+drug+concentration+in+blood.">"Serum pharmacology" and "serum pharmaceutical chemistry": from pharmacology of Chinese traditional medicines to start a new measurement of drug concentration in blood.</a> Therapeutic Drug Monitoring Research. 5, 54-64 (1988).</li><li>Fu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+Stromal+Cell-Derived+Factor+1-Mediated+Differentiation+of+Mouse+Bone+Marrow+Mesenchymal+Stem+Cells+into+Hepatocytes+Is+Enhanced+by+Chinese+Medicine+Yiguanjian+Drug-Containing+Serum.">Ex vivo Stromal Cell-Derived Factor 1-Mediated Differentiation of Mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Hepatocytes Is Enhanced by Chinese Medicine Yiguanjian Drug-Containing Serum.</a> Evidence Based Complement Alternative Medicine. , 7380439 (2016).</li><li>Cao, Y., Liu, F., Huang, Z., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+Guanxin+Shutong+capsule+drug-containing+serum+on+tumor+necrosis+factor-alpha+induced+endothelial+dysfunction+through+nicotinamide+adenine+dinucleotide+phosphate+oxidase+and+the+nitric+oxide+pathway.">Protective effects of Guanxin Shutong capsule drug-containing serum on tumor necrosis factor-alpha induced endothelial dysfunction through nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase and the nitric oxide pathway.</a> Experimental and Therapeutic. 8 (3), 998-1004 (2014).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+serum+pharmacology+in+evaluating+the+antitumor+effect+of+Fuzheng+Yiliu+Decoction+from+Chinese+Medicine.">Application of serum pharmacology in evaluating the antitumor effect of Fuzheng Yiliu Decoction from Chinese Medicine.</a> Chinese Journal of Integrative Medicine. 20 (6), 450-455 (2014).</li><li>Li, X. L., Wang, L., Bi, X. L., Chen, B. B., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gushukang+exerts+osteopreserve+effects+by+regulating+Vitamin+D+and+Calcium+metabolism+in+ovariectomized+mice.">Gushukang exerts osteopreserve effects by regulating Vitamin D and Calcium metabolism in ovariectomized mice.</a> Journal of Bone Mineral Metabolism. , 1-11 (2018).</li><li>Cui, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+study+of+Shen+(Kidney)tonifying+prescription+Gushukang+in+Preventing+and+Treating+Primary+Osteoporosis.">Mechanistic study of Shen (Kidney)tonifying prescription Gushukang in Preventing and Treating Primary Osteoporosis.</a> Journal of Chinese Medical University. 30 (16), 351-354 (2001).</li><li>Wang, Y., Shang, K., Li, Y. K., Tao, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+gushukang+on+osteoclast+cultured+from+type+I+diabetic+rat+in+vitro-a+preliminary+study.">Effect of gushukang on osteoclast cultured from type I diabetic rat in vitro-a preliminary study.</a> Chinese Journal of Bone Tumor and Bone Disease. 3 (12), 22-24 (2004).</li><li>Zhang, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pharmacology Experiment. , (1996).</li><li>Zhao, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophosphamide+causes+osteoporosis+in+C57BL/6+male+mice:+suppressive+effects+of+cyclophosphamide+on+osteoblastogenesis+and+osteoclastogenesis.">Cyclophosphamide causes osteoporosis in C57BL/6 male mice: suppressive effects of cyclophosphamide on osteoblastogenesis and osteoclastogenesis.</a> Oncotarget. 8 (58), 98163-98183 (2017).</li><li>Zhong, L. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+randomized,+double-blind,+controlled+trial+of+a+Chinese+herbal+formula+(Er-Xian+decoction)+for+menopausal+symptoms+in+Hong+Kong+perimenopausal+women.">A randomized, double-blind, controlled trial of a Chinese herbal formula (Er-Xian decoction) for menopausal symptoms in Hong Kong perimenopausal women.</a> Menopause. 20 (7), 767-776 (2013).</li><li>Zhang, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Issues+and+strategies+for+study+of+serum+pharmcology+in+oncology.">Issues and strategies for study of serum pharmcology in oncology.</a> Zhong Yi Yan Jiu. 17 (5), 13-14 (2004).</li><li>Nair, A. B., Jacob, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+practice+guide+for+dose+conversion+between+animals+and+human).">A simple practice guide for dose conversion between animals and human).</a> Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+of+the+traditional+Chinese+medicine+xuesaitong+on+intestinal+ischemia-reperfusion+injury+in+rats.">Protective effect of the traditional Chinese medicine xuesaitong on intestinal ischemia-reperfusion injury in rats.</a> International Journal of Clinical and Experiments Medicine. 8 (2), 1768-1779 (2015).</li><li>Jiang, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Chinese+herbal+drug-containing+serum+for+activating-blood+and+dispelling-toxin+on+ox-LDL-induced+inflammatory+factors'+expression+in+endothelial+cells.">Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating-blood and dispelling-toxin on ox-LDL-induced inflammatory factors' expression in endothelial cells.</a> Chinese Journal of Integrative Medicine. 18 (1), 30-33 (2012).</li><li>Li, Y., Xia, J. Y., Chen, W., Deng, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Ling+Qi+Juan+Gan+capsule+drug-containing+serum+on+PDGF-induced+proliferation+and+JAK/STAT+signaling+of+HSC-T6+cells.">Effects of Ling Qi Juan Gan capsule drug-containing serum on PDGF-induced proliferation and JAK/STAT signaling of HSC-T6 cells.</a> Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 21 (9), 663-667 (2013).</li><li>Guo, C. Y., Ma, X. J., Liu, Q., Yin, H. J., Shi, D. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Chinese+herbal+drug-containing+serum+for+activating+blood,+activating+blood+and+dispelling+toxin+on+TNF-alpha-induced+adherence+between+endothelial+cells+and+neutrophils+and+the+expression+of+MAPK+pathway.">Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating blood, activating blood and dispelling toxin on TNF-alpha-induced adherence between endothelial cells and neutrophils and the expression of MAPK pathway.</a> Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 35 (2), 204-209 (2015).</li><li>Li, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+issues+in+methology+of+Chinese+herbs+serum+pharmcology.">Some issues in methology of Chinese herbs serum pharmcology.</a> Zhong Yao Xin Yao Yu Lin Chuang Yao Li. 10 (5), 263 (1999).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+Chinese+herbs+serum+pharmcology+methodological+study.">A review of Chinese herbs serum pharmcology methodological study.</a> Nan Jing Zhong Yi Yao Da Xue Xue Bao. 18 (4), 254 (2002).</li><li>Pacifici, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen,+cytokines,+and+pathogenesis+of+postmenopausal+osteoporosis.">Estrogen, cytokines, and pathogenesis of postmenopausal osteoporosis.</a> Journal. Bone Mineral Research. 11, 1043-1051 (1996).</li><li>Ammann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+expressing+soluble+tumor+necrosis+factor-receptor+are+protected+against+bone+loss+caused+by+estrogen+deficiency.">Transgenic mice expressing soluble tumor necrosis factor-receptor are protected against bone loss caused by estrogen deficiency.</a> Journal Clinical Investigation. 99, 1699-1703 (1997).</li><li>Kimble, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+block+of+interleukin-1+and+tumor+necrosis+factor+is+required+to+completely+prevent+bone+loss+in+the+early+postovariectomy+period.">Simultaneous block of interleukin-1 and tumor necrosis factor is required to completely prevent bone loss in the early postovariectomy period.</a> Endocrinology. 136, 3054-3061 (1995).</li></ol>

I granuli degli agenti MTC sono diventati una delle scelte comuni per formulazioni o prescrizioni. Granuli GSK sono composti da diversi farmaci a base di erbe basati su esperienze cliniche o la teoria TCM, ed esercitano migliori effetti curativi con meno effetti collaterali4. Rispetto al decotto dell'acqua, i granuli hanno questi vantaggi: buon gusto, convenienza di consegna, stoccaggio a lungo termine, protocollo standard ed effetti curativi coerenti, nonché una maggiore produttività. Attualmen...

La medicina tradizionale cinese (TCM) è uno degli importanti approcci complementari e alternativi per il trattamento dell'osteoporosi1,2. Il decotto d'acqua è la forma di base e più comunemente utilizzata della formula3. Tuttavia, esistono anche inconvenienti: cattivo gusto, disagio per il trasporto, breve durata di conservazione e protocolli incoerenti, limitando gli usi così come gli effetti curativi. Per evitare gli svantaggi di cui sopra e per perseguire effetti migliori, granuli sono stati sviluppati e sono stati ampiamente utilizzati4. Anche se molti studi hanno esplorato i meccanismi farmacologici di uno o più componenti efficaci dai granuli5,6,7, i meccanismi esatti e i processi farmacologici sottostanti sono ancora difficile da identificare. Questo perché troppi componenti efficaci da un granulo possono contemporaneamente esercitare effetti simili o opposti4. Pertanto, lo sviluppo di un protocollo standard per preparare i granuli prima di consegnare al corpo non solo avrebbe un grande impatto sugli esiti terapeutici, ma è richiesto anche per i saggi in vivo e in vitro.
Inoltre, gli effetti curativi dei granuli in clinica sono difficili da confermare ed identificare esattamente utilizzando studi in vitro o ex vivo, il che crea una sfida perché i meccanismi farmacologici sono troppo complessi. Per risolvere questo problema, la preparazione del siero contenente farmaci è stata proposta per la prima volta da Tashino neglianni '80 8. Da allora in poi, numerosi ricercatori hanno applicato il siero contenente farmaci alla medicina a base di erbe, compresi i granuli9,10,11. Attualmente, la scelta del siero contenente di farmaci per le indagini in vitro è considerata come una strategia che imita da vicino le condizioni fisiologiche.
I granuli di Gushukang (GSK) sono stati sviluppati per trattare l'osteoporosi postmenopausale (POP) basata sulla pratica clinica alla luce della teoria della MTC. I granuli GSK prevengono la perdita ossea nei topi ovariati (OVX) in vivo, inibiscono il riorspo osseo osteoclasta e stimolano la formazione ossea osteoblastica4. Di conseguenza, Li et al.12 ha scoperto che i granuli GSK hanno effetti protettivi ossei nei topi OVX migliorando le attività del recettore del calcio per stimolare la formazione ossea. Per confermare gli effetti ossei-protettivi e gli effetti farmacologici dei granuli GSK, gli autori qui forniscono una procedura dettagliata per la preparazione di soluzioni di lavoro e siero contenente farmaci (granulo GSK). Inoltre, questo articolo descrive l'applicazione dei granuli GSK in un modello di topo osteoporotico indotta da OVX e nel siero contenente granulo GSK per l'osteoclastogenesi in vitro/osteoblastogenesi.
I granuli GSK sono composti da diverse erbe13,14 e possono essere completamente disciolti in salina facilmente. Pertanto, salina serve come veicolo. I topi a sham (Sham) e OVX sono stati somministrati lo stesso volume di salina dei topi somministrati al granulo. Le dosi equivalenti di granuli GSK per il topo sono state calcolate in base all'equazione Meeh-Rubner15. Questa equazione non solo ha il vantaggio di ottenere dosaggi sicuri, ma garantisce anche effetti farmacologici15. I tre dosaggi di granuli GSK sono stati generati come segue: (1) GSKL: OVX - granuli GSK a basso dosaggio, 2 g/kg/giorno. (2) GSKM: OVX - granuli GSK a media dose, 4 g/kg/giorno. (3) GSKH: OVX - granuli GSK ad alta dose, 8 g/kg/giorno. I topi dei gruppi GSKL, GSKM e GSKH sono stati somministrati intragastricamente i granuli GSK. Il carbonato di calcio di calcio (600 mg/compressa) con vitamina D3 (125 unità/compressa internazionale), ad esempio, in un prodotto maturo e commercializzato (ad esempio, Caltrate [CAL]) per il trattamento e la prevenzione dell'osteoporosi, è stato utilizzato come controllo positivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Hyclone 
			laboratories</td>
			<td>SH30265.018</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Glycerophosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5422</td>
			<td>Osteoblastogenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caltrate (CAL)</td>
			<td>Wyeth</td>
			<td>L96625</td>
			<td>Animal interventation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>SLAC Laboratory 
			Animal Co. Ltd.</td>
			<td>Random</td>
			<td>Ainimal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethsome</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438</td>
			<td>Cell frozen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>60-00-4</td>
			<td>Samples treatmnet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>FL-24562</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gushukang granules</td>
			<td>kangcheng companyin china</td>
			<td>Z20003255</td>
			<td>Herbal prescription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus BX50</td>
			<td>Olympus BX50</td>
			<td>Images for osteoclastogenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid 2-phosphate sequinagneium slat hyclrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960-5G</td>
			<td>Osteoblastogenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI300B</td>
			<td>Osteocast and osteoblast imagine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-300-25-10</td>
			<td>Osteoclastogenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#924;icro-CT</td>
			<td>Scanco 
			Medical AG</td>
			<td>&#956;CT80 radiograph microtomograph</td>
			<td>Bone Structural analsysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RANKL</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>11682-HNCHF</td>
			<td>Osteoclastogenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley</td>
			<td>SLAC Laboratory 
			Animal Co. Ltd.</td>
			<td>Random</td>
			<td>Blood serum collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tartrate-Resistant Acid Phosphate (TRAP) Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A-1KT</td>
			<td>TRAP staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of gushukang (gsk) granules for in vivo and in vitro experiments

La medicina tradizionale cinese a base di erbe svolge un ruolo come metodo alternativo nel trattamento di molte malattie, come l'osteoporosi postmenopausale (POP). I granuli di Gushukang (GSK), una prescrizione commercializzata in Cina, hanno effetti ossei-protettivi nel trattamento del POP. Prima della somministrazione al corpo, una procedura di preparazione standard è comunemente necessaria, che mira a promuovere il rilascio di costituenti attivi da erbe crude e migliorare gli effetti farmacologici così come gli esiti terapeutici. Questo studio propone un protocollo dettagliato per l'utilizzo di granuli GSK in vivo e in analisi sperimentali in vitro. Gli autori forniscono innanzitutto un protocollo dettagliato per calcolare i dosaggi adatti agli animali dei granuli per l'indagine in vivo: pesatura, dissoluzione, stoccaggio e somministrazione. In secondo luogo, questo articolo descrive i protocolli per la scansione micro-CT e la misurazione dei parametri ossei. Sono stati valutati i protocolli per l'esecuzione della macchina micro-CT e la quantificazione dei parametri ossei. In terzo luogo, vengono preparati granuli GSK contenenti siero e il siero contenente farmaci viene estratto per l'osteoclastogenesi in vitro e l'osteoblastogenesi. I granuli GSK sono stati somministrati intragastricamente due volte al giorno ai ratti per tre giorni consecutivi. Il sangue è stato poi raccolto, centrifugo, inattivato e filtrato. Infine, il siero è stato diluito e utilizzato per eseguire l'osteoclastogenesi e l'osteoblastogenesi. Il protocollo qui descritto può essere considerato un riferimento per le indagini farmacologiche di farmaci a base di erbe, come i granuli.

I risultati della scansione micro-CT hanno indicato che i topi OVX hanno mostrato una perdita ossea significativa rispetto ai topi di controllo salino (Figura 1A). L'intervento (90 giorni) dei granuli GSK ha notevolmente aumentato il BMD, in particolare nel gruppo GSKM (Figura 1B). Sono stati quantificati i parametri della struttura ossea, come BMD, BV/TV, Tb.N e Tb.Th. I trattamenti di granuli GSK hanno portato a un aumento del ...

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Preparation Of Gushukang GSK Granules for In Vivo and In Vitro Experiments

Questo articolo fornisce un protocollo dettagliato per la preparazione di una soluzione di lavoro di granuli di Gushukang per studi sugli animali e granulo GSK contenenti siero per esperimenti in vitro. Questo protocollo può essere applicato alle indagini farmacologiche di farmaci a base di erbe, nonché alle prescrizioni sia per esperimenti in vivo che in vitro.

Preparazione di Gushukang (GSK) Granuli per in vivo e in vitro

Traditional Chinese herbal medicine plays a role as an alternative method in treating many diseases, such as postmenopausal osteoporosis (POP). Gushukang ...

Questo protocollo facilities la preparazione di una soluzione di lavoro di granuli per studi in vivo, nonché la preparazione di siero contenente granuli per esperimenti in vitro. Un vantaggio di questa tecnica è che il metodo può essere facilmente ripetuto a causa del basso costo dei materiali e degli animali che crei per gli esperimenti. Inizia aggiungendo otto, 16 e 24 grammi di gushukang, o GSK, granuli a singoli tubi da 50 millilitri.Aggiungere 48 millilitri di acqua ad ogni tubo e agitare i tubi per sciogliere completamente i granuli. Quindi, posizionare 1,6 compresse di carbonato di calcio integrato con vitamina D3 in un altro tubo da 50 millilitri e sciogliere le compresse in 48 millilitri di soluzione salina con agitazione. Per la somministrazione intragastrica delle soluzioni, in primo luogo trattenere delicatamente ma saldamente manualmente un topo C57 Black 6 di un mese, femmina, per due o tre minuti.Quando il mouse si è calmato, caricare un ago di gavage numero 12 di 40 millimetri con 0,24 millilitri di una soluzione funzionante di granuli GSK e posizionare l'ago di gavage nel mouse attraverso un lato della bocca fino a quando non si sente la resistenza dell'ago, indicando che l'ago ha raggiunto lo stomaco. Iniettare l'intero volume di soluzione di lavoro nell'animale. Quindi, ritrarre l'ago di gavage e riportare il topo nella sua gabbia mentre agli altri topi viene somministrato GSK prima di iniettare 0,24 millilitri di carbonato di calcio e soluzione di vitamina D3 in ogni topo nello stesso modo.Per la raccolta del siero del sangue contenente GSK, dopo aver consegnato le concentrazioni appropriate di GSK a un ratto per gavage come appena dimostrato, confermare una mancanza di risposta al dito del giorno un'ora dopo l'ultima somministrazione di granuli GSK. Fai una pelle addominale e un'incisione peritoneale ed esponi l'addome al fondo del torace. Utilizzare carta velina per rimuovere il tessuto connettivo dell'aorta addominale per esporre chiaramente il vaso e utilizzare una siringa da 10 millilitri dotata di un ago calibro 22 per prelevare il sangue dall'aorta.Trasferire il sangue in un tubo sterile da 15 millilitri e posizionare il tubo in posizione verticale a temperatura ambiente per 30-60 minuti. Quando il sangue si è coagulato, centrifugare il tubo per separare il siero e trasferire tutto il siero per un massimo di sei ratti in un nuovo tubo da 50 millilitri. Agitare il tubo per mescolare i sieri prima di inattivare i componenti del siero in un bagno d'acqua Celsius di 56 gradi per 30 minuti.Quindi, filtrare il siero attraverso un filtro a siringa polieteresolfone idrofilo di dimensioni di 0,22 micrometri per la conservazione a meno 80 gradi Celsius per un massimo di un anno. Per l'osteoclastogenesi in vitro, diluire i tre dosaggi del siero contenente GSK ad un rapporto uno-quattro con il mezzo minimo dell'Aquila integrato con L-glutammina, ribonucleosides e deossiribonucleosides. Aggiungere 200 microlitri di ogni diluizione ad ogni pozzo di una coltura di macrofagi del midollo osseo in una piastra da 96 porri.Quindi, inizia l'ultima generazione stimolando ogni pozzo con fattore stimolante per la colonia di macrofagi e attivatore del recettore per il ligando del fattore nucleare-kappa B. Per l'osteoblastogenesi in vitro, aggiungere due millilitri di siero diluito contenente GSK ad ogni pozzo di una coltura di cellule staminali mesenchimali ossee a 24 pozzi. I risultati della scansione della tomografia micro-calcolata indicano che i topi ovariectomizzati dimostrano una significativa perdita ossea rispetto ai topi di controllo salini.L'intervento con 90 giorni di trattamento con granulo GSK aumenta notevolmente la densità del midollo osseo, in particolare negli animali trattati con GSK a media dose. Il trattamento con granulo GSK porta anche ad un aumento del numero osseo trabecolare, del volume osseo sul volume totale e dello spessore osseo trabecolare, ma una diminuzione della separazione ossea trabecolare. La colorazione della fosfatasi acida resistente ai tartrati, o TRAP, rivela un aumento del numero di osteoclasti nei topi ovariectomizzati rispetto agli animali di controllo, mentre i trattamenti dei granuli GSK riducono la differenziazione osteoclasta positiva trap rispetto agli animali ovariectomizzati.Il siero contenente granuli GSK riduce anche il numero di osteoclasti positivi trap rispetto al siero raccolto dagli animali di controllo. La penetrazione riuscita dell'ago nell'aorta addominale è fondamentale per garantire che un sangue abbastanza alto sia raccolto da ogni ratto. Un'esecuzione riuscita di questo metodo dovrebbe assegnare l'accumulo di 15-20 millimetri di sangue, abbastanza materiale da utilizzare per esperimenti in vitro.

Research

JoVE Journal

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