Name: preparation of gushukang (gsk) granules for in vivo and in vitro experiments
Uploaded: 2019-05-09T12:30:00
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Este estudo foi apoiado por subsídios da Fundação Nacional de ciências naturais da China (81804116, 81673991, 81770107, 81603643 e 81330085), o programa de equipe inovadora, Ministério da ciência e tecnologia da China (2015RA4002 para WYJ), o programa para Equipe inovativa, Ministry da instrução de China (IRT1270 a WYJ), centro médico de Shanghai TCM da doença crônica (2017ZZ01010 a WYJ), três anos de ação para acelerar o desenvolvimento do plano tradicional da medicina chinesa (ZY (2018-2020)-CCCX-3003 a WYJ), e projetos de desenvolvimento de pesquisa-chave nacionais (2018YFC1704302).

Todos os procedimentos experimentais foram realizados com a aprovação do Comitê institucional de cuidados e uso de animais da Universidade de Xangai do TCM (SZY201604005).
1. preparação e administração da solução de trabalho da GSK
<ol><li>Calcule as doses equivalentes de grânulos GSK para o mouse.<ol>
<li>Calcule a superfície do corpo com base na equação de meeh-Rubner15: superfície corporal = k x (peso corporal2/3)/1000, onde os valores de k são 10,6 pa...

<ol>
	<li>Shu, B., Shi, Q., Wang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shen+(Kidney)-tonifying+principle+for+primary+osteoporosis:+to+treat+both+the+disease+and+the+Chinese+medicine+syndrome.">Shen (Kidney)-tonifying principle for primary osteoporosis: to treat both the disease and the Chinese medicine syndrome.</a> Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (9), 656-661 (2015).</li><li>Zhao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+naturally+derived+small+compound+Osthole+inhibits+osteoclastogenesis+to+prevent+ovariectomy-induced+bone+loss+in+mice.">The naturally derived small compound Osthole inhibits osteoclastogenesis to prevent ovariectomy-induced bone loss in mice.</a> Menopause. 25 (12), 1459-1469 (2018).</li><li>Liu, S. F., Sun, Y. L., Li, J., Dong, J. C., Bian, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Herbal+Medicine:+Er-Xian+Decoction+and+Er-Xian-containing+Serum+for+In+vivo+and+In+vitro+Experiments.">Preparation of Herbal Medicine: Er-Xian Decoction and Er-Xian-containing Serum for In vivo and In vitro Experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. (123), e55654 (2017).</li><li>Wang, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+systemic+bone+protective+effects+of+Gushukang+granules+in+ovariectomized+mice+by+inhibiting+osteoclastogenesis+and+stimulating+osteoblastogenesis.">The systemic bone protective effects of Gushukang granules in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis and stimulating osteoblastogenesis.</a> Journal of Pharmacological Sciences. 136 (3), 155-164 (2018).</li><li>Bian, Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oleanolic+acid+exerts+an+osteoprotective+effect+in+ovariectomy-induced+osteoporotic+rats+and+stimulates+the+osteoblastic+differentiation+of+bone+mesenchymal+stem+cells+in+vitro.">Oleanolic acid exerts an osteoprotective effect in ovariectomy-induced osteoporotic rats and stimulates the osteoblastic differentiation of bone mesenchymal stem cells in vitro.</a> Menopause. 19 (2), 225-233 (2012).</li><li>Zhao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oleanolic+acid+exerts+bone+protective+effects+in+ovariectomized+mice+by+inhibiting+osteoclastogenesis.">Oleanolic acid exerts bone protective effects in ovariectomized mice by inhibiting osteoclastogenesis.</a> Journal of Pharmacological Sciences. 137 (1), 76-85 (2018).</li><li>Tang, D. Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osthole+Stimulates+Osteoblast+Differentiation+and+Bone+Formation+by+Activation+of+&#946;-Catenin-BMP+Signaling.">Osthole Stimulates Osteoblast Differentiation and Bone Formation by Activation of &#946;-Catenin-BMP Signaling.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 25 (6), 1234-1245 (2010).</li><li>Tashino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Serum+pharmacology"+and+"serum+pharmaceutical+chemistry":+from+pharmacology+of+Chinese+traditional+medicines+to+start+a+new+measurement+of+drug+concentration+in+blood.">"Serum pharmacology" and "serum pharmaceutical chemistry": from pharmacology of Chinese traditional medicines to start a new measurement of drug concentration in blood.</a> Therapeutic Drug Monitoring Research. 5, 54-64 (1988).</li><li>Fu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+Stromal+Cell-Derived+Factor+1-Mediated+Differentiation+of+Mouse+Bone+Marrow+Mesenchymal+Stem+Cells+into+Hepatocytes+Is+Enhanced+by+Chinese+Medicine+Yiguanjian+Drug-Containing+Serum.">Ex vivo Stromal Cell-Derived Factor 1-Mediated Differentiation of Mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Hepatocytes Is Enhanced by Chinese Medicine Yiguanjian Drug-Containing Serum.</a> Evidence Based Complement Alternative Medicine. , 7380439 (2016).</li><li>Cao, Y., Liu, F., Huang, Z., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+Guanxin+Shutong+capsule+drug-containing+serum+on+tumor+necrosis+factor-alpha+induced+endothelial+dysfunction+through+nicotinamide+adenine+dinucleotide+phosphate+oxidase+and+the+nitric+oxide+pathway.">Protective effects of Guanxin Shutong capsule drug-containing serum on tumor necrosis factor-alpha induced endothelial dysfunction through nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase and the nitric oxide pathway.</a> Experimental and Therapeutic. 8 (3), 998-1004 (2014).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+serum+pharmacology+in+evaluating+the+antitumor+effect+of+Fuzheng+Yiliu+Decoction+from+Chinese+Medicine.">Application of serum pharmacology in evaluating the antitumor effect of Fuzheng Yiliu Decoction from Chinese Medicine.</a> Chinese Journal of Integrative Medicine. 20 (6), 450-455 (2014).</li><li>Li, X. L., Wang, L., Bi, X. L., Chen, B. B., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gushukang+exerts+osteopreserve+effects+by+regulating+Vitamin+D+and+Calcium+metabolism+in+ovariectomized+mice.">Gushukang exerts osteopreserve effects by regulating Vitamin D and Calcium metabolism in ovariectomized mice.</a> Journal of Bone Mineral Metabolism. , 1-11 (2018).</li><li>Cui, S. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanistic+study+of+Shen+(Kidney)tonifying+prescription+Gushukang+in+Preventing+and+Treating+Primary+Osteoporosis.">Mechanistic study of Shen (Kidney)tonifying prescription Gushukang in Preventing and Treating Primary Osteoporosis.</a> Journal of Chinese Medical University. 30 (16), 351-354 (2001).</li><li>Wang, Y., Shang, K., Li, Y. K., Tao, X. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+gushukang+on+osteoclast+cultured+from+type+I+diabetic+rat+in+vitro-a+preliminary+study.">Effect of gushukang on osteoclast cultured from type I diabetic rat in vitro-a preliminary study.</a> Chinese Journal of Bone Tumor and Bone Disease. 3 (12), 22-24 (2004).</li><li>Zhang, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pharmacology Experiment. , (1996).</li><li>Zhao, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophosphamide+causes+osteoporosis+in+C57BL/6+male+mice:+suppressive+effects+of+cyclophosphamide+on+osteoblastogenesis+and+osteoclastogenesis.">Cyclophosphamide causes osteoporosis in C57BL/6 male mice: suppressive effects of cyclophosphamide on osteoblastogenesis and osteoclastogenesis.</a> Oncotarget. 8 (58), 98163-98183 (2017).</li><li>Zhong, L. 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B., Jacob, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+practice+guide+for+dose+conversion+between+animals+and+human).">A simple practice guide for dose conversion between animals and human).</a> Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+of+the+traditional+Chinese+medicine+xuesaitong+on+intestinal+ischemia-reperfusion+injury+in+rats.">Protective effect of the traditional Chinese medicine xuesaitong on intestinal ischemia-reperfusion injury in rats.</a> International Journal of Clinical and Experiments Medicine. 8 (2), 1768-1779 (2015).</li><li>Jiang, Y. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Chinese+herbal+drug-containing+serum+for+activating-blood+and+dispelling-toxin+on+ox-LDL-induced+inflammatory+factors'+expression+in+endothelial+cells.">Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating-blood and dispelling-toxin on ox-LDL-induced inflammatory factors' expression in endothelial cells.</a> Chinese Journal of Integrative Medicine. 18 (1), 30-33 (2012).</li><li>Li, Y., Xia, J. Y., Chen, W., Deng, C. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+Ling+Qi+Juan+Gan+capsule+drug-containing+serum+on+PDGF-induced+proliferation+and+JAK/STAT+signaling+of+HSC-T6+cells.">Effects of Ling Qi Juan Gan capsule drug-containing serum on PDGF-induced proliferation and JAK/STAT signaling of HSC-T6 cells.</a> Zhonghua Gan Zang Bing Za Zhi. 21 (9), 663-667 (2013).</li><li>Guo, C. Y., Ma, X. J., Liu, Q., Yin, H. J., Shi, D. Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Chinese+herbal+drug-containing+serum+for+activating+blood,+activating+blood+and+dispelling+toxin+on+TNF-alpha-induced+adherence+between+endothelial+cells+and+neutrophils+and+the+expression+of+MAPK+pathway.">Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating blood, activating blood and dispelling toxin on TNF-alpha-induced adherence between endothelial cells and neutrophils and the expression of MAPK pathway.</a> Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 35 (2), 204-209 (2015).</li><li>Li, Y. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Some+issues+in+methology+of+Chinese+herbs+serum+pharmcology.">Some issues in methology of Chinese herbs serum pharmcology.</a> Zhong Yao Xin Yao Yu Lin Chuang Yao Li. 10 (5), 263 (1999).</li><li>Zhang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+review+of+Chinese+herbs+serum+pharmcology+methodological+study.">A review of Chinese herbs serum pharmcology methodological study.</a> Nan Jing Zhong Yi Yao Da Xue Xue Bao. 18 (4), 254 (2002).</li><li>Pacifici, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Estrogen,+cytokines,+and+pathogenesis+of+postmenopausal+osteoporosis.">Estrogen, cytokines, and pathogenesis of postmenopausal osteoporosis.</a> Journal. Bone Mineral Research. 11, 1043-1051 (1996).</li><li>Ammann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+expressing+soluble+tumor+necrosis+factor-receptor+are+protected+against+bone+loss+caused+by+estrogen+deficiency.">Transgenic mice expressing soluble tumor necrosis factor-receptor are protected against bone loss caused by estrogen deficiency.</a> Journal Clinical Investigation. 99, 1699-1703 (1997).</li><li>Kimble, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+block+of+interleukin-1+and+tumor+necrosis+factor+is+required+to+completely+prevent+bone+loss+in+the+early+postovariectomy+period.">Simultaneous block of interleukin-1 and tumor necrosis factor is required to completely prevent bone loss in the early postovariectomy period.</a> Endocrinology. 136, 3054-3061 (1995).</li></ol>

Os grânulos de agentes de TCM tornaram-se uma das escolhas comuns para formulações ou prescrições. GSK grânulos são compostos de vários medicamentos fitoterápicos com base em experiências clínicas ou a teoria TCM, e eles exercem melhores efeitos curativos com menos efeitos colaterais4. Comparado com a decocção da água, os grânulo têm estas vantagens: bom gosto, conveniência da entrega, armazenamento a longo prazo, protocolo padrão e efeitos curativos consistentes, assim como uma ...

A medicina tradicional chinesa (TCM) é uma das importantes abordagens complementares e alternativas para o tratamento da osteoporose1,2. A decocção de água é a forma básica e mais comumente usada da fórmula3. No entanto, desvantagens também existem: mau gosto, inconveniente para o transporte, vida útil curta e protocolos inconsistentes, limitando os usos, bem como os efeitos curativos. Para evitar as desvantagens acima, bem como para perseguir melhores efeitos, os grânulos foram desenvolvidos e têm sido amplamente utilizados4. Embora muitos estudos tenham explorado os mecanismos farmacológicos de um ou mais componentes efetivos dos grânulos5,6,7, os mecanismos exatos e os processos farmacológicos subjacentes ainda são difícil de identificar. Isto é porque muitos componentes eficazes de um grânulo podem simultaneamente exercer efeitos semelhantes ou opostos4. Portanto, o desenvolvimento de um protocolo padrão para preparar os grânulos antes de entregar para o corpo não só teria um grande impacto sobre os resultados terapêuticos, mas também é necessária para ambos in vivo e in vitro ensaios.
Além disso, os efeitos curativos dos grânulos na clínica são difíceis de confirmar e identificam exatamente o uso de estudos in vitro ou ex vivo, o que cria um desafio porque os mecanismos farmacológicos são muito complexos. Para resolver isso, a preparação do soro contendo drogas foi proposta pela primeira vez por Tashino na década de 19808. A partir de então, numerosos pesquisadores aplicaram soro contendo medicamentos à fitoterapia,incluindo grânulos9,10,11. Atualmente, a escolha do soro contendo medicamentos para investigações in vitro é considerada como uma estratégia que imita de perto as condições fisiológicas.
Os grânulos de gushukang (GSK) foram desenvolvidos para tratar a osteoporose pós-menopausa (POP) com base na prática clínica à luz da teoria da TCM. Os grânulos de GSK impedem a perda óssea em camundongos ovariectomizados (OVX) in vivo, inibem a reabsorção óssea osteoclástica e estimulam a formação óssea osteoblástica4. Conseqüentemente, Li et al.12 descobriram que os grânulos GSK apresentam efeitos protetores ósseos em camundongos OVX, reforçando as atividades do receptor de cálcio para estimular a formação óssea. Para confirmar os efeitos protetores ósseos, bem como os efeitos farmacológicos de grânulos GSK, os autores aqui fornecem um procedimento detalhado para a preparação de soluções de trabalho e medicamentos (grânulo GSK)-contendo soro. Além disso, este artigo descreve a aplicação de grânulos de GSK em um modelo osteoporóticas OVX-induzido do rato e no soro Granule-contendo de GSK para in vitro osteoclastogenesis/osteoblastogenesis.
Os grânulos de GSK são compor de diversas ervas13,14 e podem completamente ser dissolvidos no soro fisiológico facilmente. Conseqüentemente, o soro fisiológico serve como o veículo. Camundongos Sham-operados (Sham) e camundongos OVX foram administrados o mesmo volume de soro fisiológico que os camundongos administrados por grânulos. As doses equivalentes de grânulos de GSK para o camundongo foram calculadas com base na equação de meeh-Rubner15. Esta equação não só tem a vantagem de obter dosagens seguras, mas também garante efeitos farmacológicos15. As três dosagens de grânulos de GSK foram geradas como a seguir: (1) GSKL: OVX + baixo-dose GSK grânulos, 2 g/kg/day. (2) GSKM: OVX + médio-dose GSK grânulos, 4 g/kg/dia. (3) GSKH: OVX + alta-dose GSK grânulos, 8 g/kg/dia. Camundongos nos grupos GSKL, GSKM e GSKH foram administrados em grânulos de GSK intragastricamente. O carbonato de cálcio (600 mg/comprimido) com vitamina D3 (125 unidade/comprimido internacional), por exemplo, em um produto maduro e comercializado (por exemplo, Caltrate [CAL]) para o tratamento e prevenção da osteoporose, foi usado como um controle positivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Hyclone 
			laboratories</td>
			<td>SH30265.018</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Glycerophosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5422</td>
			<td>Osteoblastogenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caltrate (CAL)</td>
			<td>Wyeth</td>
			<td>L96625</td>
			<td>Animal interventation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>SLAC Laboratory 
			Animal Co. Ltd.</td>
			<td>Random</td>
			<td>Ainimal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethsome</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438</td>
			<td>Cell frozen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>60-00-4</td>
			<td>Samples treatmnet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>FL-24562</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gushukang granules</td>
			<td>kangcheng companyin china</td>
			<td>Z20003255</td>
			<td>Herbal prescription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus BX50</td>
			<td>Olympus BX50</td>
			<td>Images for osteoclastogenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid 2-phosphate sequinagneium slat hyclrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960-5G</td>
			<td>Osteoblastogenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI300B</td>
			<td>Osteocast and osteoblast imagine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-300-25-10</td>
			<td>Osteoclastogenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#924;icro-CT</td>
			<td>Scanco 
			Medical AG</td>
			<td>&#956;CT80 radiograph microtomograph</td>
			<td>Bone Structural analsysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RANKL</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>11682-HNCHF</td>
			<td>Osteoclastogenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley</td>
			<td>SLAC Laboratory 
			Animal Co. Ltd.</td>
			<td>Random</td>
			<td>Blood serum collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tartrate-Resistant Acid Phosphate (TRAP) Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A-1KT</td>
			<td>TRAP staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of gushukang (gsk) granules for in vivo and in vitro experiments

A medicina erval chinesa tradicional joga um papel como um método alternativo em tratar muitas doenças, tais como a osteoporose na pós-menopausa (PNF). Os grânulos de gushukang (GSK), uma prescrição comercializada em China, têm efeitos osso-protetores em tratar o PNF. Antes da administração ao corpo, um procedimento padrão da preparação é exigido geralmente, que visa promover a liberação de constituintes ativos das ervas cruas e realçar os efeitos farmacológicos assim como resultados terapêuticos. Este estudo propõe um protocolo detalhado para o uso de grânulos de GSK em ensaios experimentais in vivo e in vitro. Os autores fornecem primeiramente um protocolo detalhado para calcular as dosagens animal-apropriadas dos grânulo para a investigação in vivo: pesando, dissolvendo, armazenamento, e administração. Em segundo lugar, este artigo descreve protocolos para a varredura do Micro-CT e a medida de parâmetros do osso. Foram avaliados a preparação da amostra, protocolos para a execução da máquina de microtomografia computadorizada e quantificação dos parâmetros ósseos. Em terceiro lugar, os grânulos GSK contendo soro são preparados, e o soro contendo medicamentos é extraído para osteoclastogênese in vitro e osteoblastogênese. Os grânulos de GSK foram administrados intragástrica duas vezes por o dia aos ratos por três dias consecutivos. O sangue foi então coletado, centrifugado, inativado e filtrado. Finalmente, o soro foi diluído e usado para executar o osteoclastogênese e o osteoblastogenesis. O protocolo descrito aqui pode ser considerado uma referência para investigações farmacológicas de medicamentos de prescrição de ervas, como grânulos.

Os resultados da varredura do Micro-CT indicaram que os ratos de OVX mostraram a perda óssea significativa comparada aos ratos do controle salino (Figura 1a). A intervenção (90 dias) dos grânulos de GSK aumentou grandemente a DMO, particularmente no grupo GSKM (Figura 1b). Os parâmetros da estrutura óssea, como DMO, BV/TV, TB. N e Tb.Th, foram quantificados. Os tratamentos de grânulos GSK levaram ao aumento da DMO, BV/TV, ...

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Preparation Of Gushukang GSK Granules for In Vivo and In Vitro Experiments

Este artigo fornece um protocolo detalhado para preparar uma solução de trabalho de grânulos de Gushukang para estudos animais e o grânulo de GSK que contem o soro para in vitro experimenta. Este protocolo pode ser aplicado a investigações farmacológicas de fitoterápicos, bem como prescrições para experimentos in vivo e in vitro.

Preparação de grânulos de Gushukang (GSK) para experimentos in vivo e in vitro

Traditional Chinese herbal medicine plays a role as an alternative method in treating many diseases, such as postmenopausal osteoporosis (POP). Gushukang ...

Este protocolo instala a preparação de uma solução de trabalho de grânulos para estudos in vivo, bem como a preparação de soro contendo grânulos para experimentos in vitro. Uma vantagem dessa técnica é que o método pode ser facilmente repetido devido ao baixo custo dos materiais e dos animais que você cria para os experimentos. Comece adicionando oito, 16 e 24 gramas de Gushukang, ou GSK, grânulos a tubos individuais de 50 mililitros.Adicione 48 mililitros de água a cada tubo e agite os tubos para dissolver completamente os grânulos. Em seguida, coloque 1,6 comprimidos de carbonato de cálcio suplementados com vitamina D3 em outro tubo de 50 mililitros, e dissolva os comprimidos em 48 mililitros de soro fisiológico com agitação. Para a administração intragástrica das soluções, primeiro, levemente, mas firmemente, contenha manualmente um mouse C57 Black 6 de um mês de idade por dois a três minutos.Quando o rato tiver se acalmado, carregue uma agulha de 40 milímetros, número 12, com 0,24 mililitros de uma solução de trabalho de grânulos GSK, e coloque a agulha de gavage no rato através de um lado de sua boca até que a resistência da agulha seja sentida, indicando que a agulha atingiu o estômago. Injete todo o volume de solução de trabalho no animal. Em seguida, retraia a agulha de gavage, e devolva o rato para sua gaiola enquanto os outros ratos estão sendo administrados GSK antes de injetar 0,24 mililitros de carbonato de cálcio e vitamina D3 solução em cada rato da mesma maneira.Para a coleta de soro de sangue contendo GSK, depois de entregar as concentrações apropriadas de GSK a um rato por gavage como apenas demonstrado, confirme a falta de resposta para beliscar o dedo do dedo uma hora após a última administração de grânulos GSK. Faça uma pele abdominal e incisão peritoneal, e exponha o abdômen até a parte inferior do tórax. Use papel de tecido para remover o tecido conjuntivo da aorta abdominal para expor o vaso claramente, e use uma seringa de 10 mililitros equipada com uma agulha de calibre 22 para extrair sangue da aorta.Transfira o sangue para um tubo estéril de 15 mililitros e coloque o tubo ereto à temperatura ambiente por 30 a 60 minutos. Quando o sangue tiver coagulado, centrifugar o tubo para separar o soro, e transferir todo o soro para até seis ratos em um novo tubo de 50 mililitros. Agite o tubo para misturar a soro antes de inativar os componentes do soro em um banho de água Celsius de 56 graus por 30 minutos.Em seguida, filtre o soro através de um filtro de seringa poliéfilo de tamanho de 0,22 micrômetros para armazenamento a menos 80 graus Celsius por até um ano. Para osteoclastogênese in vitro, diluir as três doses de soro contendo GSK em uma proporção de um para quatro com o meio mínimo da Águia suplementado com L-glutamina, ribonucleosídeos e desoxiribonucleosídeos. Adicione 200 microliters de cada diluição a cada poço de uma cultura macrófago de medula óssea em uma placa de 96 poços.Em seguida, inicie a geração osteoclasta estimulando cada poço com fator estimulante da colônia de macrófagos e ativador receptor para o ligante fator nuclear-kappa B. Para osteoblastogênese in vitro, adicione dois mililitros de soro contendo GSK diluídos a cada poço de uma cultura de células-tronco mesenquimal de 24 poços. Resultados de tomografia computadorizada microcomputadas indicam que camundongos ovariectomizados demonstram perda óssea significativa em comparação com camundongos de controle salino.A intervenção com 90 dias de tratamento de grânulo GSK aumenta muito a densidade da medula óssea, particularmente em animais tratados com GSK de dose média. O tratamento do grânulo GSK também leva a um aumento do número ósseo trabecular, volume ósseo acima do volume total e espessura óssea trabecular, mas uma diminuição da separação óssea-trabecular óssea. Fosfatase de ácido resistente a tartaratos, ou TRAP, a coloração revela um aumento no número de osteoclatos em camundongos ovariectomizados em comparação com animais de controle, enquanto os tratamentos de granulo GSK diminuem a diferenciação de osteoclastafatopositivo trap em comparação com os animais ovariectomizados.O soro contendo granuloso GSK também reduz o número de osteoclastas trap-positivas em comparação com o soro coletado de animais de controle. A penetração bem sucedida da agulha na aorta abdominal é fundamental para garantir que um sangue de volume alto o suficiente seja colhido de cada rato. Uma execução bem sucedida deste método deve acoplar o acúmulo de 15 a 20 milímetros de sangue, material suficiente para ser usado para experimentos in vitro.

Research

JoVE Journal

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