Name: preparation of gushukang (gsk) granules for in vivo and in vitro experiments
Uploaded: 2019-05-09T12:30:00
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Este estudio fue apoyado por subvenciones de la Fundación Nacional de Ciencias Naturales de China (81804116, 81673991, 81770107, 81603643 y 81330085), el programa de Equipo Innovador, Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (2015RA4002 a WYJ), el programa para el Equipo Innovador, Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (2015RA4002 a WYJ), el programa para el Equipo Innovador, Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (2015RA4002 a WYJ), el programa para el Equipo Innovador, Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (2015RA4002 a WYJ), el programa para el Equipo Innovador, Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (2015RA4002 a WYJ), el programa para el Equipo Innovador, Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (2015RA4002 a WYJ), el programa para el Equipo Innovador, Ministerio de Ciencia y Tecnología de China (2015RA4002 a WYJ), el programa para el Equipo Innovador, Ministerio de Ciencia y Tecnología Equipo Innovador, Ministerio de Educación de China (IRT1270 a WYJ), Shanghai TCM Medical Center of Chronic Disease (2017ZZ01010 a WYJ), Three Years Action to Accelerate the Development of Traditional Chinese Medicine Plan (ZY(2018-2020)-CCCX-3003 to WYJ), y Tres Años de Acción para Acelerar el Desarrollo del Plan de Medicina Tradicional China (ZY(2018-2020)-CCCX-3003 a WYJ), y Tres Años de Acción para Acelerar el Desarrollo del Plan de Medicina Tradicional China (ZY(2018-2020)-CCCX-3003 a WYJ), y proyectos nacionales clave de desarrollo de la investigación (2018YFC1704302).

Todos los procedimientos experimentales se realizaron con la aprobación del Comité Institucional de Cuidado y Uso de Animales de la Universidad de TCM de Shanghái (SZY201604005).
1. Preparación y administración de la solución de trabajo de GSK
<ol><li>Calcular las dosis equivalentes de gránulos GSK para ratón.<ol>
<li>Calcular la superficie corporal sobre la base de la ecuación Meeh-Rubner15: superficie del cuerpo - K x (peso corporal2/3)/1000, donde los valore...

<ol>
	<li>Shu, B., Shi, Q., Wang, Y. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Shen+(Kidney)-tonifying+principle+for+primary+osteoporosis:+to+treat+both+the+disease+and+the+Chinese+medicine+syndrome.">Shen (Kidney)-tonifying principle for primary osteoporosis: to treat both the disease and the Chinese medicine syndrome.</a> Chinese Journal of Integrative Medicine. 21 (9), 656-661 (2015).</li><li>Zhao, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+naturally+derived+small+compound+Osthole+inhibits+osteoclastogenesis+to+prevent+ovariectomy-induced+bone+loss+in+mice.">The naturally derived small compound Osthole inhibits osteoclastogenesis to prevent ovariectomy-induced bone loss in mice.</a> Menopause. 25 (12), 1459-1469 (2018).</li><li>Liu, S. F., Sun, Y. L., Li, J., Dong, J. C., Bian, Q. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preparation+of+Herbal+Medicine:+Er-Xian+Decoction+and+Er-Xian-containing+Serum+for+In+vivo+and+In+vitro+Experiments.">Preparation of Herbal Medicine: Er-Xian Decoction and Er-Xian-containing Serum for In vivo and In vitro Experiments.</a> Journal of Visualized Experiments. 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Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Osthole+Stimulates+Osteoblast+Differentiation+and+Bone+Formation+by+Activation+of+&#946;-Catenin-BMP+Signaling.">Osthole Stimulates Osteoblast Differentiation and Bone Formation by Activation of &#946;-Catenin-BMP Signaling.</a> Journal of Bone and Mineral Research. 25 (6), 1234-1245 (2010).</li><li>Tashino, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term="Serum+pharmacology"+and+"serum+pharmaceutical+chemistry":+from+pharmacology+of+Chinese+traditional+medicines+to+start+a+new+measurement+of+drug+concentration+in+blood.">"Serum pharmacology" and "serum pharmaceutical chemistry": from pharmacology of Chinese traditional medicines to start a new measurement of drug concentration in blood.</a> Therapeutic Drug Monitoring Research. 5, 54-64 (1988).</li><li>Fu, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ex+vivo+Stromal+Cell-Derived+Factor+1-Mediated+Differentiation+of+Mouse+Bone+Marrow+Mesenchymal+Stem+Cells+into+Hepatocytes+Is+Enhanced+by+Chinese+Medicine+Yiguanjian+Drug-Containing+Serum.">Ex vivo Stromal Cell-Derived Factor 1-Mediated Differentiation of Mouse Bone Marrow Mesenchymal Stem Cells into Hepatocytes Is Enhanced by Chinese Medicine Yiguanjian Drug-Containing Serum.</a> Evidence Based Complement Alternative Medicine. , 7380439 (2016).</li><li>Cao, Y., Liu, F., Huang, Z., Zhang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effects+of+Guanxin+Shutong+capsule+drug-containing+serum+on+tumor+necrosis+factor-alpha+induced+endothelial+dysfunction+through+nicotinamide+adenine+dinucleotide+phosphate+oxidase+and+the+nitric+oxide+pathway.">Protective effects of Guanxin Shutong capsule drug-containing serum on tumor necrosis factor-alpha induced endothelial dysfunction through nicotinamide adenine dinucleotide phosphate oxidase and the nitric oxide pathway.</a> Experimental and Therapeutic. 8 (3), 998-1004 (2014).</li><li>Chen, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+serum+pharmacology+in+evaluating+the+antitumor+effect+of+Fuzheng+Yiliu+Decoction+from+Chinese+Medicine.">Application of serum pharmacology in evaluating the antitumor effect of Fuzheng Yiliu Decoction from Chinese Medicine.</a> Chinese Journal of Integrative Medicine. 20 (6), 450-455 (2014).</li><li>Li, X. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+gushukang+on+osteoclast+cultured+from+type+I+diabetic+rat+in+vitro-a+preliminary+study.">Effect of gushukang on osteoclast cultured from type I diabetic rat in vitro-a preliminary study.</a> Chinese Journal of Bone Tumor and Bone Disease. 3 (12), 22-24 (2004).</li><li>Zhang, Y. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Pharmacology Experiment. , (1996).</li><li>Zhao, D. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cyclophosphamide+causes+osteoporosis+in+C57BL/6+male+mice:+suppressive+effects+of+cyclophosphamide+on+osteoblastogenesis+and+osteoclastogenesis.">Cyclophosphamide causes osteoporosis in C57BL/6 male mice: suppressive effects of cyclophosphamide on osteoblastogenesis and osteoclastogenesis.</a> Oncotarget. 8 (58), 98163-98183 (2017).</li><li>Zhong, L. 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B., Jacob, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+practice+guide+for+dose+conversion+between+animals+and+human).">A simple practice guide for dose conversion between animals and human).</a> Journal of Basic and Clinical Pharmacy. 7 (2), 27-31 (2016).</li><li>Xu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protective+effect+of+the+traditional+Chinese+medicine+xuesaitong+on+intestinal+ischemia-reperfusion+injury+in+rats.">Protective effect of the traditional Chinese medicine xuesaitong on intestinal ischemia-reperfusion injury in rats.</a> International Journal of Clinical and Experiments Medicine. 8 (2), 1768-1779 (2015).</li><li>Jiang, Y. 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Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+Chinese+herbal+drug-containing+serum+for+activating+blood,+activating+blood+and+dispelling+toxin+on+TNF-alpha-induced+adherence+between+endothelial+cells+and+neutrophils+and+the+expression+of+MAPK+pathway.">Effect of Chinese herbal drug-containing serum for activating blood, activating blood and dispelling toxin on TNF-alpha-induced adherence between endothelial cells and neutrophils and the expression of MAPK pathway.</a> Zhongguo Zhong Xi Yi Jie He Za Zhi. 35 (2), 204-209 (2015).</li><li>Li, Y. 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Bone Mineral Research. 11, 1043-1051 (1996).</li><li>Ammann, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transgenic+mice+expressing+soluble+tumor+necrosis+factor-receptor+are+protected+against+bone+loss+caused+by+estrogen+deficiency.">Transgenic mice expressing soluble tumor necrosis factor-receptor are protected against bone loss caused by estrogen deficiency.</a> Journal Clinical Investigation. 99, 1699-1703 (1997).</li><li>Kimble, R. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Simultaneous+block+of+interleukin-1+and+tumor+necrosis+factor+is+required+to+completely+prevent+bone+loss+in+the+early+postovariectomy+period.">Simultaneous block of interleukin-1 and tumor necrosis factor is required to completely prevent bone loss in the early postovariectomy period.</a> Endocrinology. 136, 3054-3061 (1995).</li></ol>

Los gránulos de agentes de MTC se han convertido en una de las opciones comunes para formulaciones o recetas. GSK gránulos se componen de varios medicamentos herbarios basados en experiencias clínicas o la teoría de la MTC, y ejercen mejores efectos curativos con menos efectos secundarios4. En comparación con la decocción de agua, los gránulos tienen estas ventajas: buen gusto, comodidad de entrega, almacenamiento a largo plazo, protocolo estándar y efectos curativos consistentes, así com...

La medicina tradicional china (TCM) es uno de los importantesenfoques complementarios y alternativos para tratar la osteoporosis 1,2. La decocción de agua es la formabásica y más utilizada de la fórmula 3. Sin embargo, también existen inconvenientes: mal gusto, inconvenientes para el transporte, vida útil corta y protocolos inconsistentes, limitando los usos, así como los efectos curativos. Para evitar las desventajas anteriores, así como para perseguir mejores efectos, gránulos fueron desarrollados y se han utilizado ampliamente4. Aunque muchos estudios han explorado los mecanismos farmacológicos de uno o más componentes eficaces de los gránulos5,6,7, los mecanismos exactos y los procesos farmacológicos subyacentes siguen difícil de identificar. Esto se debe a que demasiados componentes efectivos de un gránulo pueden ejercer simultáneamente efectos similares u opuestos4. Por lo tanto, el desarrollo de un protocolo estándar para preparar los gránulos antes de entregar al cuerpo no sólo tendría un gran impacto en los resultados terapéuticos, sino que también es necesario para ensayos in vivo e in vitro.
Además, los efectos curativos de los gránulos en la clínica son difíciles de confirmar e identificar exactamente mediante estudios in vitro o ex vivo, lo que crea un desafío porque los mecanismos farmacológicos son demasiado complejos. Para resolver esto, la preparación del suero que contiene drogas fue propuestapor primera vez por Tashino en 1980 8 . A partir de entonces, numerosos investigadores aplicaron suero que contiene drogas a la medicina herbaria, incluyendo gránulos9,10,11. Actualmente, la elección del suero que contiene fármacos para las investigaciones in vitro se considera como una estrategia que imita de cerca las condiciones fisiológicas.
Los gránulos Gushukang (GSK) fueron desarrollados para tratar la osteoporosis posmenopáusica (POP) basándose en la práctica clínica a la luz de la teoría de la MTC. Los gránulos GSK previenen la pérdida ósea en ratones ovariectomizados (OVX) in vivo, inhiben la resorción ósea osteoclástica y estimulan la formación ósea osteoblástica4. En consecuencia,12 encontró que los gránulos GSK tienen efectos protectores óseos en ratones OVX al mejorar las actividades del receptor de calcio para estimular la formación ósea. Para confirmar los efectos protectores óseos, así como los efectos farmacológicos de los gránulos GSK, los autores proporcionan aquí un procedimiento detallado para la preparación de soluciones de trabajo y suero que contiene medicamentos (gránulos GSK). Además, este artículo describe la aplicación de gránulos GSK en un modelo de ratón osteoporótico inducido por OVX y suero que contiene gránulos gránulo para osteoclastogénesis in vitro/osteoblastogénesis.
GSK gránulos se componen de varias hierbas13,14 y se pueden disolver completamente en solución salina fácilmente. Por lo tanto, la salina sirve como el vehículo. A los ratones operados por Sham (Sham) y a los ratones OVX se les administró el mismo volumen de salina que a los ratones administrados por gránulos. Las dosis equivalentes de gránulos GSK para el ratón se calcularon sobre la base de la ecuación15de Meeh-Rubner. Esta ecuación no sólo tiene la ventaja de obtener dosis seguras, sino que también garantiza efectos farmacológicos15. Las tres dosis de gránulos GSK se generaron de la siguiente manera: (1) GSKL: OVX + gránulos GSK de dosis baja, 2 g/kg/día. (2) GSKM: OVX + gránulos GSK de dosis media, 4 g/kg/día. (3) GSKH: OVX + gránulos GSK de alta dosis, 8 g/kg/día. Los ratones de los grupos GSKL, GSKM y GSKH recibieron gránulos GSK administrados por tragastrically. El carbonato de calcio (600 mg/tableta) con vitamina D3 (125 unidad/tableta internacional), por ejemplo, en un producto maduro y comercializado (por ejemplo, Caltrate [CAL]) para tratar y prevenir la osteoporosis, se utilizó como un control positivo.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>&#945;-MEM</td>
			<td>Hyclone 
			laboratories</td>
			<td>SH30265.018</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#946;-Glycerophosphate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>G5422</td>
			<td>Osteoblastogenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Caltrate (CAL)</td>
			<td>Wyeth</td>
			<td>L96625</td>
			<td>Animal interventation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>C57BL/6 mice</td>
			<td>SLAC Laboratory 
			Animal Co. Ltd.</td>
			<td>Random</td>
			<td>Ainimal preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dexamethsome</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D4902</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dimethyl sulfoxide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>D2438</td>
			<td>Cell frozen</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)</td>
			<td>Sangon Biotech</td>
			<td>60-00-4</td>
			<td>Samples treatmnet</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fetal bovine serum</td>
			<td>Gibco</td>
			<td>FL-24562</td>
			<td>For cell culture</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gushukang granules</td>
			<td>kangcheng companyin china</td>
			<td>Z20003255</td>
			<td>Herbal prescription</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Light microscope</td>
			<td>Olympus BX50</td>
			<td>Olympus BX50</td>
			<td>Images for osteoclastogenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>L-Ascorbic acid 2-phosphate sequinagneium slat hyclrate</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>A8960-5G</td>
			<td>Osteoblastogenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>DMI300B</td>
			<td>Osteocast and osteoblast imagine</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>M-CSF</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>AF-300-25-10</td>
			<td>Osteoclastogenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>&#924;icro-CT</td>
			<td>Scanco 
			Medical AG</td>
			<td>&#956;CT80 radiograph microtomograph</td>
			<td>Bone Structural analsysis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RANKL</td>
			<td>Peprotech</td>
			<td>11682-HNCHF</td>
			<td>Osteoclastogenesis</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sprague Dawley</td>
			<td>SLAC Laboratory 
			Animal Co. Ltd.</td>
			<td>Random</td>
			<td>Blood serum collection</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tartrate-Resistant Acid Phosphate (TRAP) Kit</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>387A-1KT</td>
			<td>TRAP staining</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preparation of gushukang (gsk) granules for in vivo and in vitro experiments

La medicina herbaria tradicional china desempeña un papel como método alternativo en el tratamiento de muchas enfermedades, como la osteoporosis posmenopáusica (POP). Gushukang (GSK) gránulos, una receta comercializada en China, tienen efectos protectores óseos en el tratamiento de POP. Antes de la administración al cuerpo, un procedimiento de preparación estándar es comúnmente necesario, que tiene como objetivo promover la liberación de componentes activos de hierbas crudas y mejorar los efectos farmacológicos, así como resultados terapéuticos. Este estudio propone un protocolo detallado para el uso de gránulos GSK in vivo y ensayos experimentales in vitro. Los autores proporcionan primero un protocolo detallado para calcular las dosis apropiadas para animales de gránulos para la investigación in vivo: pesaje, disolución, almacenamiento y administración. En segundo lugar, en este artículo se describen los protocolos para la exploración de micro-CT y la medición de parámetros óseos. Se evaluaron la preparación de muestras, los protocolos para ejecutar la máquina de micro-CT y la cuantificación de los parámetros óseos. En tercer lugar, se preparan gránulos GSK que contienen suero y se extrae suero que contiene fármacos para la osteoclastogénesis in vitro y la osteoblastogénesis. Los gránulos GSK se administraron intragástricamente dos veces al día a ratas durante tres días consecutivos. Luego se recogió sangre, se centrifugaba, se inactivan y se filtró. Finalmente, el suero se diluyó y se utilizó para realizar osteoclastogénesis y osteoblastogénesis. El protocolo descrito aquí puede considerarse una referencia para las investigaciones farmacológicas de medicamentos recetados a base de hierbas, como gránulos.

Los resultados de la exploración de micro-TC indicaron que los ratones OVX mostraron una pérdida ósea significativa en comparación con los ratones de control de salina (Figura1A). La intervención (90 días) de gránulos GSK aumentó considerablemente la DMO, particularmente en el grupo GSKM (Figura1B). Se cuantificaron los parámetros de la estructura ósea, como BMD, BV/TV, Tb.N y Tb.Th. Los tratamientos de gránulos GSK di...

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Preparation Of Gushukang GSK Granules for In Vivo and In Vitro Experiments

Este artículo proporciona un protocolo detallado para preparar una solución de trabajo de gránulos Gushukang para estudios en animales y gránulo GSK que contiene suero para experimentos in vitro. Este protocolo se puede aplicar a las investigaciones farmacológicas de medicamentos a base de hierbas, así como a las prescripciones para experimentos in vivo e in vitro.

Preparación de gránulos Gushukang (GSK) para experimentos in Vivo e In Vitro

Traditional Chinese herbal medicine plays a role as an alternative method in treating many diseases, such as postmenopausal osteoporosis (POP). Gushukang ...

Este protocolo proporciona la preparación de una solución de trabajo de gránulos para estudios in vivo, así como la preparación de suero que contiene gránulos para experimentos in vitro. Una ventaja de esta técnica es que el método se puede repetir fácilmente debido al bajo costo de los materiales y los animales que creas para los experimentos. Comience agregando ocho, 16 y 24 gramos de gránulos De Gushukang, o GSK, a tubos individuales de 50 mililitros.Añadir 48 mililitros de agua a cada tubo, y agitar los tubos para disolver completamente los gránulos. Luego, coloque 1,6 comprimidos de carbonato de calcio suplementados con vitamina D3 en otro tubo de 50 mililitros, y disuelva los comprimidos en 48 mililitros de solución salina con agitación. Para la administración intragástrica de las soluciones, primero sujetar manualmente un ratón C57 Black 6 de un mes de edad durante dos o tres minutos.Cuando el ratón se haya calmado, cargue una aguja de 40 milímetros número 12 con 0,24 mililitros de una solución de trabajo de gránulos GSK, y coloque la aguja de gavage en el ratón a través de un lado de su boca hasta que se sienta la resistencia de la aguja, lo que indica que la aguja ha llegado al estómago. Inyectar todo el volumen de solución de trabajo en el animal. Luego, retraiga la aguja de gavage, y regrese el ratón a su jaula mientras los otros ratones están siendo administrados GSK antes de inyectar 0.24 mililitros de carbonato de calcio y solución de vitamina D3 en cada ratón de la misma manera.Para la recolección de suero sanguíneo que contiene GSK, después de entregar las concentraciones apropiadas de GSK a una rata por gavage como acaba de demostrar, confirme una falta de respuesta al pellizco del dedo del pie una hora después de la última administración del gránulo GSK. Haz una incisión abdominal en la piel y la pertoneal, y expone el abdomen a la parte inferior del tórax. Utilice papel tisú para extraer el tejido conectivo de la aorta abdominal para exponer el vaso con claridad, y utilice una jeringa de 10 mililitros equipada con una aguja de calibre 22 para extraer sangre de la aorta.Transfiera la sangre a un tubo estéril de 15 mililitros y coloque el tubo en posición vertical a temperatura ambiente durante 30 a 60 minutos. Cuando la sangre se haya coagulado, centrifuga el tubo para separar el suero y transfiera todo el suero de hasta seis ratas a un nuevo tubo de 50 mililitros. Agitar el tubo para mezclar el suero antes de inactivar los componentes del suero en un baño de agua Celsius de 56 grados durante 30 minutos.Luego, filtre el suero a través de un filtro de jeringa de poliétersulfone hidrófilo de 0,22 micrómetros de tamaño poro para almacenarlo a menos 80 grados centígrados durante un año. Para la osteoclastogénesis in vitro, diluir las tres dosis de suero que contiene GSK en una proporción de uno a cuatro con medio mínimo de águila complementado con L-glutamina, ribonucleósidos, y desoxirribonucleósidos. Añadir 200 microlitros de cada dilución a cada pozo de un cultivo de macrófagos de médula ósea en una placa de 96 pocillos.A continuación, inicie la generación de osteoclastos estimulando cada pozo con el factor estimulante de colonias de macrófagos y el activador del receptor para el ligando del factor nuclear-kappa B. Para la osteoblastogénesis in vitro, añadir dos mililitros de suero diluido que contenga GSK a cada pozo de un cultivo de células madre mesenquimales óseas de placa de 24 pozos. Los resultados de la exploración por tomografía microcóctida indican que los ratones ovariectomizados demuestran una pérdida ósea significativa en comparación con los ratones de control salino.La intervención con 90 días de tratamiento gránulo GSK aumenta considerablemente la densidad de la médula ósea, particularmente en animales tratados con GSK en dosis medias. El tratamiento con gránulos GSK también conduce a un aumento del número de hueso trabecular, volumen óseo sobre el volumen total y espesor óseo trabecular, pero una disminución de la separación ósea-trabecular ósea. La tinción de fosfatasa ácida resistente al tartrato, o TRAP, revela un aumento en el número de osteoclastos en ratones ovariectomizados en comparación con los animales de control, mientras que los tratamientos de gránulos GSK reducen la diferenciación de osteoclastos positivas de TRAP en comparación con los animales ovariectomizados.El suero que contiene gránulos GSK también reduce el número de osteoclastos positivos trap en comparación con el suero recogido de los animales de control. La penetración exitosa de la aguja en la aorta abdominal es fundamental para garantizar que se extrae sangre de volumen suficientemente alto de cada rata. Una ejecución exitosa de este método debe asignar la acumulación de 15 a 20 milímetros de sangre, suficiente material para ser utilizado para experimentos in vitro.

Research

JoVE Journal

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