Name: in vivo calcium imaging in c. elegans body wall muscles
Uploaded: 2019-10-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles at JoVE.com

ويشكر المؤلفان الدكتور الكسندر غورسكهالك علي ZX1659 ، والمعسكر الذي يحتوي علي سلاله دوده ، والدكتور هونغكيون كيم لسلاله الدودة البطيءه-1 (eg142) ، والمشروع الوطني للموارد البيولوجية لسلاله الدودة sca-1 (tm5339) .

1. الاعداد المجهر
<ol><li>استخدام المجهر المركب مع قدرات مضان. لهذه الدراسة ، تم جمع البيانات علي المجهر تستقيم (جدول المواد) مزوده المصابيح لأثاره.</li>
	<li>من أجل تصور بشكل صحيح التغيرات الفلورية في عضلات جدار الجسم ، واستخدام هدف التكبير عاليه.<ol>
<li>للتحضيرات تشريح ، استخدام 60x NA 1.0<strong...

<ol>
	<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca2++probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics.">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Activation+of+Channelrhodopsin-2+in+Excitable+Cells+of+Caenorhabditis+elegans+Triggers+Rapid+Behavioral+Responses.">Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses.</a> Current Biology. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li><li>Liewald, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+analysis+of+synaptic+function.">Optogenetic analysis of synaptic function.</a> Nature Methods. 5 (10), 895-902 (2008).</li><li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans.">Laser Microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biology. 107, 177-206 (2012).</li><li>Lewis, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+Receptor+Mutants+of+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans.">Cholinergic Receptor Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).</li><li>Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+levamisole+resistance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).</li><li>Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+GABA+and+two+acetylcholine+receptors+function+at+the+C.+elegans+neuromuscular+junction.">One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction.</a> Nature Neuroscience. 9, 791-798 (1999).</li><li>Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Imaging+of+Caenorhabditis+elegans+Using+Nanoparticle-Mediated+Immobilization.">Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization.</a> PLoS ONE. 8 (1), 1-6 (2013).</li><li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+control+of+microscopes+using+umanager.">Computer control of microscopes using umanager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. (Suppl 92), 1-17 (2010).</li><li>Richmond, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+and+Recording+from+The+C.+Elegans+Neuromuscular+Junction.">Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction.</a> Journal of Visualized Experiments. (24), 1-4 (2009).</li><li>Hoon Cho, J., Bandyopadhyay, J., Lee, J., Park, C. S., Ahnn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+isoforms+of+sarco/endoplasmic+reticulum+calcium+ATPase+(SERCA)+are+essential+in+Caenorhabditis+elegans.">Two isoforms of sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) are essential in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 261, 211-219 (2000).</li><li>Zwaal, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sarco-Endoplasmic+Reticulum+Ca2++ATPase+Is+Required+for+Development+and+Muscle+Function+in+Caenorhabditis+elegans.">The Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase Is Required for Development and Muscle Function in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (47), 43557-43563 (2001).</li><li>Stammers, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+sarco(endo)plasmic+reticulum+calcium-ATPases+(SERCA).">The regulation of sarco(endo)plasmic reticulum calcium-ATPases (SERCA).</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93, 1-12 (2015).</li><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Signaling.">Calcium Signaling.</a> Cell. 131, 1047-1058 (2007).</li><li>Hovnanian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serca+pumps+and+human+diseases.">Serca pumps and human diseases.</a> Calcium Signalling and Disease: Molecular Pathology of Calcium. , 337-363 (2007).</li><li>Periasamy, M., Kalyanasundaram, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SERCA+pump+isoforms:+Their+role+in+calcium+transport+and+disease.">SERCA pump isoforms: Their role in calcium transport and disease.</a> Muscle and Nerve. 35 (4), 430-442 (2007).</li><li>Gehlert, S., Bloch, W., Suhr, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-Dependent+Regulations+and+Signaling+in+Skeletal+Muscle:+From+Electro-Mechanical+Coupling+to+Adaptation.">Ca2+-Dependent Regulations and Signaling in Skeletal Muscle: From Electro-Mechanical Coupling to Adaptation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16, 1066-1095 (2015).</li><li>Martin, A. A., Richmond, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sarco(endo)plasmic+reticulum+calcium+ATPase+SCA-1+regulates+the+Caenorhabditis+elegans+nicotinic+acetylcholine+receptor+ACR-16.">The sarco(endo)plasmic reticulum calcium ATPase SCA-1 regulates the Caenorhabditis elegans nicotinic acetylcholine receptor ACR-16.</a> Cell Calcium. 72, 104-115 (2018).</li><li>Wang, Z., Saifee, O., Nonet, M. L., Salkoff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLO-1+Potassium+Channels+Control+Quantal+Content+of+Neurotransmitter+Release+at+the+C.+elegans+Neuromuscular+Junction.">SLO-1 Potassium Channels Control Quantal Content of Neurotransmitter Release at the C. elegans Neuromuscular Junction.</a> Neuron. 32, 867-881 (2001).</li><li>Abraham, L. S., Oh, H. J., Sancar, F., Richmond, J. E., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Alpha-Catulin+Homologue+Controls+Neuromuscular+Function+through+Localization+of+the+Dystrophin+Complex+and+BK+Channels+in+Caenorhabditis+elegans.">An Alpha-Catulin Homologue Controls Neuromuscular Function through Localization of the Dystrophin Complex and BK Channels in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 6 (8), 1-13 (2010).</li><li>Gourgou, E., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+induced+oxidative+stress+affects+ASH+neuronal+function+and+behavior+in+C.+elegans.">Chemically induced oxidative stress affects ASH neuronal function and behavior in C. elegans.</a> Scientific Reports. 6, 1-9 (2016).</li><li>Zahratka, J. A., Williams, P. D. E., Summers, P. J., Komuniecki, R. W., Bamber, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+differentially+modulates+Ca2++transients+and+depolarization+in+a+C.+elegans+nociceptor.">Serotonin differentially modulates Ca2+ transients and depolarization in a C. elegans nociceptor.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1041-1050 (2015).</li><li>Kerr, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+calcium+transients+in+neurons+and+pharyngeal+muscle+of+C.+elegans.">Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans.</a> Neuron. 26 (3), 583-594 (2000).</li><li>Nekimken, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pneumatic+stimulation+of+C.+elegans+mechanoreceptor+neurons+in+a+microfluidic+trap.">Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap.</a> Lab Chip. 17 (6), 1116-1127 (2017).</li><li>Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Neuronal+Calcium+Imaging+in+C.+elegans.">In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), 1-9 (2013).</li><li>Jospin, M., Jacquemond, V., Mariol, M. C., S&#233;galat, L., Allard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+L-type+voltage-dependent+Ca2+channel+EGL-19+controls+body+wall+muscle+function+in+Caenorhabditis+elegans.">The L-type voltage-dependent Ca2+channel EGL-19 controls body wall muscle function in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Cell Biology. 159 (2), 337-347 (2002).</li><li>Wabnig, S., Liewald, J. F., Yu, S., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+All-Optical+Analysis+of+Synaptic+Transmission+and+Synaptic+Vesicle+Recycling+in+Caenorhabditis+elegans.">High-Throughput All-Optical Analysis of Synaptic Transmission and Synaptic Vesicle Recycling in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. , 1-26 (2015).</li></ol>

جيكاس هي أداه قويه في البيولوجيا العصبية c. اليجس . وقد استخدمت الاعمال السابقة تقنيات تصوير الكالسيوم لفحص مجموعه واسعه من الوظائف في كل من الخلايا العصبية والعضلات ، بما في ذلك الاستجابات الحسية والسلوكية ، مع أساليب متنوعة من التحفيز. وقد استخدمت بعض الدراسات المحفزات الكيميائية ل...

تقدم هذه الورقة طرقا لتصوير الكالسيوم في الجسم باستخدام عضلات جدار الهيكل c. التي تستخدم تحفيز الخلايا العصبية أوبتوجينيتيك. الاقتران العضلات التي أعرب عنها وراثيا المشفرة مؤشر الكالسيوم (جيكط) مع الضوء الأزرق أثارت الاستقطاب العصبية ويوفر نظاما لمراقبه بوضوح العابرين الكالسيوم التي أثيرت بعد المتشابك. هذا يتجنب استخدام التحفيز الكهربائي, السماح للتحليل غير الغازية من المسوخ التي تؤثر علي ديناميات الكالسيوم بوستمتشابك.
واحد-فلوكوفيري جيكسيس ، مثل gcamp ، يستخدم جزيء بروتين فلوري واحد تنصهر في مجال M13 من سلسله الضوء ميوسين كيناز في نهايته N-الطرفية و كالموديولين (CaM) في C-المحطة. علي الكالسيوم ملزمه ، والمجال كام ، والتي لديها تقارب عاليه للكالسيوم ، يخضع لتغيير المطابقة يحفز تغيير المطابقة اللاحقة في البروتين الفلورسنت مما يؤدي إلى زيادة في كثافة مضان1. ومتحمس GCaMP مضان في 488 نانومتر ، مما يجعلها غير صالحه لاستخدامها بالتزامن مع تشانيلروببسين ، الذي يحتوي علي الطول الموجي الاثاره مماثله من 473 نانومتر. التالي ، من أجل القياسات الكالسيوم زوجين مع تحفيز تشانيلروببسين ، البروتين الفلوري الأخضر من GCaMP يحتاج إلى استبداله ببروتين فلوري احمر ، mRuby (ركامب). باستخدام العضلات وأعرب RCaMP, في تركيبه مع التعبير العصبية الحركية الكوليني من تشانيلروبيبسين, يسمح الدراسات في تقاطع العصبية العضلية (NMJ) مع الاستخدام المتزامن لoptogenetics والتصوير الوظيفي داخل نفس الحيوانية 2-
استخدام تشانيلروبوبسين يتجاوز الحاجة إلى التحفيز الكهربائي لتشويه الوصلات العصبية العضلية من c. اليجانيس، والتي يمكن ان تتحقق الا في الاستعدادات تشريح ، مما يجعل هذه التقنية علي حد سواء أسهل لتوظيف وأكثر دقه عند استهداف انسجه معينه. علي سبيل المثال, وقد استخدمت في السابق تشانيلروببسين في c. اليجنس لتنشيط الخلايا العصبية المحددة بشكل عكسي, مما يؤدي إلى تنشيط قويه من الخلايا العصبية مثير أو المثبطة3,4. كما ان استخدام الاستقطاب المحفز للضوء يلتف أيضا علي مساله تلف الخلايا العصبية بسبب التحفيز الكهربائي المباشر. وهذا يوفر فرصه لدراسة اثار العديد من بروتوكولات التحفيز المختلفة, بما في ذلك المحفزات المستمرة والمتكررة, علي ديناميات الكالسيوم بوستمتشابك4.
ان الطبيعة الشفافة لل c. اليجايليس تجعله مثاليا للتحليل الوظيفي للتصوير الفلوري. ومع ذلك, عند تحفيز الخلايا العصبية المثيرة استيل في NMJ, ومن المتوقع الحيوانية للرد مع انكماش العضلات الفورية4, مما يجعل من تجميد الديدان الحرجة في تصور تغيرات الكالسيوم منفصلة. تقليديا ، وقد استخدمت وكلاء الدوائية لشل الماشية. واحد مثل هذه المخدرات المستخدمة هو levamisole, وهو اتروبين مستقبلات استيل الكولين5,6,7. منذ الليفاميزول يؤدي إلى التنشيط المستمر لنوع فرعي من مستقبلات العضلات مثير, هذا الكاشف غير مناسب لدراسة ديناميات الكالسيوم العضلات. العمل ليفيسيزول يدفع الاستقطاب بوستسينابتيك ، ورفع الكالسيوم عصاري خلوي ، والملاحظات انسداد بعد التحفيز بريسينابتيك. لتجنب استخدام الادويه المشلولة ، قمنا بفحص طريقتين بديلتين لتعبئة c. اليجايليس. تم لصقها الحيوانية اما أسفل ومن ثم تشريح مفتوحة لفضح عضلات الجسم الجدار ، علي غرار القائمة c. اليجانقاف nmj الكهربائية الطريقة8، أو استخدمت نانوبيادس لشل الكائنات السليمة9. سمح كلا الإجراءات للقياسات استنساخه من يستريح وأثار العضلات الكالسيوم العابرين التي كانت قابله للقياس بسهوله.
الطرق في هذه الورقة يمكن استخدامها لقياس مستويات الكالسيوم القاعدية السيتووليك والعابرين في خلايا العضلات الجدار الجسم بوستمتشابك في c. الايليسين. وترد أمثله للبيانات التي تستخدم التقنيتين المختلفتين للتعبئة. كلا التقنيتين الاستفادة من optogenetics لتشويه الخلايا العضلية دون استخدام التحفيز الكهربائي. وتبين هذه الامثله جدوى هذه الطريقة في تقييم الطفرات التي تؤثر علي معالجه الكالسيوم بعد المتشابك في الديدان وتشير إلى إيجابيات وسلبيات النهجين التجميد.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>all-trans retinal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2500</td>
			<td>Necessary for excitation of channel rhodopsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber LED</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RCaMP illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino UNO</td>
			<td>Mouser</td>
			<td>782-A000066</td>
			<td>Controls fluorescence illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue LED</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>channelrhodopsin illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BX51WI microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Fixed state compound microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current controlled low noise linear power supply</td>
			<td>Ametek</td>
			<td>Sorenson</td>
			<td>Controls LED intensity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro</td>
			<td>Wavemetrics</td>
			<td>Wavemetrics.com</td>
			<td>Graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>imagej.nih.gov</td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUMFLN 60x water NA 1.4</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Water immersion objective for dissected preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master-8 Stimulator</td>
			<td>A.M.P.I</td>
			<td></td>
			<td>Master timer for image acquisition and LED illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Manager</td>
			<td></td>
			<td>micro-manager.org</td>
			<td>Controls camera acquisition and LED excitiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Spreadsheet software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pco.edge 4.2 CMOS camera</td>
			<td>pco.</td>
			<td>4.2</td>
			<td>High-speed camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlanApo N 60x oil NA 1.4</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Oil immersion objective for nanobead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead microspheres</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>00876-15</td>
			<td>For worm immobilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>solid state switches</td>
			<td>Sensata Technologies</td>
			<td>Crydom CMX100D6</td>
			<td>Controls timing of LED illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 
			(h134R)::yfp,lin-15(+)}; 
			Pmyo3::RCaMP35]</td>
			<td>Richmond Lab</td>
			<td>SY1627</td>
			<td>Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 
			(h134R)::yfp,lin-15(+)}; 
			Pmyo3::RCaMP35]</td>
			<td>Richmond Lab</td>
			<td></td>
			<td>Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 
			(h134R)::yfp,lin-15(+)}; 
			Pmyo3::RCaMP35]</td>
			<td>Gottschalk Lab</td>
			<td>ZX1659</td>
			<td>Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging in c. elegans body wall muscles

يوفر نموذج الكائن الحي c. اليجانقاف نظاما ممتازا لأداء التصوير بالكالسيوم في الجسم. وتسمح هيئته الشفافة وقدرته علي التلاعب الوراثي بالتعبير المستهدف لأجهزه استشعار الكالسيوم المشفرة وراثيا. يحدد هذا البروتوكول استخدام أجهزه الاستشعار هذه لتصوير ديناميات الكالسيوم في الخلايا المستهدفة ، وعلي وجه التحديد عضلات جدار الجسم في الديدان. من خلال الاستفادة من التعبير المشترك لل بريسينابتيك تشانيلروبوبسين, تحفيز الإفراج عن استيل من الخلايا العصبية الحركية المثيرة يمكن ان يكون مستحثا باستخدام نبضات الضوء الأزرق, مما ادي إلى الاستقطاب العضلات والتغييرات القابلة للتكرار في الكالسيوم سيتوبلازمي مستويات. يتم مناقشه اثنين من تقنيات التجميد دوده مع مستويات متفاوتة من الصعوبة. وتبين المقارنة بين هذه التقنيات ان كلا النهجين يحافظان علي فسيولوجيا التقاطع العصبي العضلي ويسمح بالكمية القابلة للتكرار لعابري الكالسيوم. عن طريق الاقتران optogenetics والتصوير الوظيفي الكالسيوم ، ويمكن تقييم التغييرات في التعامل مع الكالسيوم بوستسينابتيك والتوازن في مجموعه متنوعة من الخلفيات متحولة. البيانات المقدمة بالتحقق من صحة كل من تقنيات التعبئة ويفحص علي وجه التحديد ادوار ساركو سي (اندو) بلازمي شبكي الكالسيوم ATPase وقناه البوتاسيوم BK تنشيط الكالسيوم في الجسم جدار العضلات تنظيم الكالسيوم.

قيمت هذه التقنية التغيرات في المسوخ التي يعتقد انها تؤثر علي معالجه الكالسيوم أو الاستقطاب العضلي. وقد تم تصور مستويات الخط القاعدي والعابرات الفلورية وتم تقييم الكالسيوم السيتووليك وحركيه الكالسيوم داخل العضلات. ومن المهم ان تزرع الماشية علي الشبكية المتحولة لمده ثلا...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles at JoVE.com

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

هذا الأسلوب يوفر وسيله للزوجين optogenetics والمشفرة وراثيا مجسات الكالسيوم إلى مستويات الكالسيوم القاعدية صوره الأساس والتغيرات في العابرين الكالسيوم أثارت في عضلات الجسم الجدار من الكائن الحي النموذجي c. اليجنتس.

في فيفو الكالسيوم التصوير في c. الهيئة عضلات الجدار الجسم

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

يوفر هذا البروتوكول طريقتين لتعبئة C.Elegans لأداء في التصوير الكلسيوم في الجسم من عضلات جدار الجسم. يمكن أن تساعد هذه الطريقة في الإجابة على الأسئلة المتعلقة بتحلل الكالسيوم ومعالجة الكالسيوم، وتشابك يمكن الوصول إليه في الكائن الحي القابل للتصلب وراثياً. هذه التقنية يمكن أن توفر فهما أفضل للآليات التي تنظم العضلات التوازن الكالسيوم، ويمكن، لذلك، أن تكون مهمة في تحديد الظروف أو المسارات الجزيئية التي تؤثر على اقتران انكماش الإثارة من خلال سوء تنظيم دورة الكالسيوم.هذه الأساليب يمكن أن توفر نظرة ثاقبة في مجالات البحوث بما في ذلك، ولكن ليس محدودة جدا، والبيولوجيا العصبية، والبيولوجيا التنموية، وبيولوجيا الخلايا. ويمكن تكييف هذه التقنيات لدراسة مجموعة متنوعة من أنواع الخلايا وC.elegans، والنيماتودا ذات الصلة الأخرى وكذلك يرقات الفلزات. إن العرض المرئي لهذه الطريقة أمر بالغ الأهمية حتى يتمكن المجرب من فهم تقنية التشريح ، ويكون قادرًا على تقييم عابري الكالسيوم بدقة من الحيوانات التي تم شل حركتها بشكل صحيح.ابدأ بإعداد المجهر للتصوير الفلورسنت. استخدم كاميرا CMOS العلمية القادرة على تصوير الإطار الكامل في 100 هرتز من أجل تتبع التغيرات السريعة في مستويات الكالسيوم. السيطرة على اقتناء الكاميرا والإثارة LED الفلورسنت مع برنامج micromanager تعمل في ImageJ.استخدام منصة إلكترونية مفتوحة المصدر المكونات في الذي يتصل خارجي لوحة متحكم في مصادر مفتوحة لإدارة نبضات توقيت خارجي التي تتحكم في الإثارة الفلورسنت. للتحكم في منطق التوقيت، قم بتنشيط بروتوكول الاستحواذ على ميكرو ماجير في البرنامج وفقًا لتعليمات المصنعين. استخدام اثنين من المصابيح لتحفيز rhodopsin قناة مع الضوء الأزرق وتسجيل التغييرات RCaMP.تنشيط rhodopsin قناة مع صباحا LED مع الطول الموجي القبول الذروة من 470 نانومتر ومرشح bandpass، ويثير RCaMP مع الصمام مع الطول الموجي القبول ذروة من 594 نانومتر ومرشح شريط. شارك في إضاءة كل من المصابيح ونقل الضوء إلى نفس المسار البصري باستخدام الجمع بين شعاع dichroic. التحكم في توقيت إضاءة LED بواسطة مفاتيح الحالة الصلبة التي تتحكم فيها إشارات TTL وفقًا لاتجاهات المخطوطات، وقم بتعيين شدة LED مع إمدادات الطاقة الخطية الحالية لضجيج الحمولة، ثم قم ببرمجة بروتوكول محاكاة الضوء الأزرق في جهاز محاكاة.في هذه التجربة تشغيل محاكاة الضوء الأزرق بعد ثانيتين من التقاط الفلوري RCaMP فقط واستخدام قطار من خمسة، اثنين من نبضات الضوء الأزرق ميلي ثانية مع فترات 50 ميلي ثانية لتنشيط rhodopsin قناة. إذا كان استخدام إعداد التشريح، أداء تشريح C.elegans في ضوء منخفض. ضع الحيوانات في طبق التشريح مع قاعدة غطاء الأغطية المغلفة بالسيليكون التي تمتلئ بمليمول واحد من محلول الكالسيوم خارج الخلية المعد وفقًا لاتجاهات المخطوطات.الغراء أسفل الحيوانات باستخدام لاصقة الجلد الموضعي السائل مع التلوين الأزرق على طول الجانب الظهري من الدودة. وجعل شق بشرة جانبية على طول واجهة الغراء ودودة باستخدام الإبر الزجاجية. استخدام ماصة الفم لمسح الحشوة الداخلية من تجويف الدودة، ثم الغراء أسفل رفرف بشرة من الحيوان لفضح عضلات جدار الجسم البطني للتصوير.إذا كان استخدام إعداد حبة النانو، وجعل حل 5٪ أغرا المنصهر باستخدام الماء المقطر إلى حجم النهائي من 100 ملليلتر. استخدام ماصة باستور لوضع قطرة من حل المصهور أغرا على شريحة زجاجية وعلى الفور وضع شريحة زجاجية ثانية على الجزء العلوي باستخدام الضغط بلطف لإنشاء لوحة حتى أغرا. إزالة الشريحة العلوية وعلى ما يقرب من أربعة ميكرولترات من البوليسترين نانو الخرز إلى منتصف لوحة.في ضوء منخفض إضافة أربعة إلى ستة C.elegans في حل الخرز نانو، والتأكد من أن الحيوانات لا تكمن فوق بعضها البعض، ووضع بعناية coverslip على القمة. عندما تكون جاهزة للصورة، وضع الشريحة المعدة أو طبق تشريح على المجهر والعثور على والتركيز على دودة باستخدام 10 مرات التكبير والإضاءة حقل مشرق خافت. التبديل إلى 60 مرة التكبير في الإثارة الفلورية RCaMP لتحديد عضلات جدار الجسم فينتروم الوسيطة التي هي في الجزء الأمامي من الفرج وفي الطائرة الصوتية الصحيحة.ثم تغيير مسار الصورة من العدسة إلى الكاميرا عن طريق سحب التبديل والنقر على الهواء مباشرة داخل برنامج الحصول على البيانات. انقر فوق الزر ORI في برنامج الحصول على البيانات، ثم قم بإنشاء مربع حول العضلات التي يتم التركيز عليها. على المحفز، قم بالتبديل على مسار تحفيز الضوء الأزرق المبرمج مسبقًا، ثم انقر فوق الحصول على برنامج التصوير لالتقاط الصورة.عندما تزرع C.elegans على جميع عبر شبكية العين، ودمج بنجاح الشبكية وتفعيل rhodopsin قناة، يمكن استحضار عابر الكالسيوم. إذا لم تتعرض الحيوانات إلى شبكية العين عبر جميع يتم تشغيل أي العضلات والكالسيوم عابر. وقد استخدم هذا البروتوكول للتحقيق في فقدان وظيفة سخرة sca-1، والتي تؤثر على مضخة الكالسيوم الساركبلاسميك ترميز من قبل الجين sca-1.ولكن، لوحظت الزيادات في إعداد التشريح في مستويات خط الأساس من الفلورية RCaMP في المتحولة مقارنة بالسيطرة، مما يشير إلى أن الطفرة تحتاج إلى مستويات مرتفعة من الكالسيوم السيتوبلازمي يستريح. كان هناك انخفاض كبير في مستويات الذروة الكالسيوم في المسوخ sca-1 بالمقارنة مع عنصر التحكم. ومع ذلك، لم يظهر أي تغيير في وقت الذروة أو نصف وقت الاضمحلال.الأهم من ذلك، يمكن ملاحظة نتائج مماثلة باستخدام أقل تحديا من الناحية الفنية إعداد حبة النانو. تم تقييم فقدان وظيفة سلو المسوخ، التي تعطل قنوات البوتاسيوم الكبيرة تنشيط الكالسيوم من أجل التحقيق في المسوخ التي تؤثر بشكل غير مباشر على التعامل مع الكالسيوم في C.elegans. عندما تم قياس مستويات خط الأساس من RCaMP المسوخ عرض زيادة الفلوريس مقارنة بالضوابط.عند تقييم حركية من الكالسيوم عابر لم ينظر إلى أي تغييرات في مستويات ذروة الكالسيوم. ومع ذلك، أظهرت المسوخ slo-1 (eg142) زيادة كبيرة في الارتفاع إلى وقت الذروة. أهم خطوة يجب تذكرها عند إكمال الإجراء هي تجهيز الحيوانات التجريبية في شبكية العين عبر جميع.بدون هذه الخطوة سوف rhodopsin قناة تكون غير نشطة، ومنع العابرين الكالسيوم الناجم عن الضوء من أن يتم تشغيلها. بعد هذا الإجراء، يمكن إجراء الفيزيولوجيا الكهربائية والتحليل السلوكي لتقييم التأثير الوظيفي لأي تغيرات ملحوظة في التوازن بين الكالسيوم. باستخدام أساليب التثبيت المبينة هنا، يمهد الطريق لمزيد من الاستكشاف لديناميات الكالسيوم ويوضح أنه يمكن ملاحظة نتائج قابلة للمقارنة استجابة لتحفيز الخلايا العصبية optogenetic والتقاط عابرة العضلات الكالسيوم باستخدام تقنية شل حبة أقل تحديا بكثير.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

الكشف عن تعتمد على درجة الحموضة آخر من<em&gt; كولاي</em&gt; الوصيفة HdeB<em&gt; في المختبر</em&gt; و<em&gt; في فيفو</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Combining Raman Imaging and Multivariate Analysis to Visualize Lignin, Cellulose, and Hemicellulose in the Plant Cell Wall

الجمع بين رامان التصوير وتحليل متعدد المتغيرات لتصور اللجنين، السليلوز، وهيميسيلولوز في جدار الخلية النباتية

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The ...

Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics

إعداد هيدروليساتي الكيراتين من ريش الدجاج وتطبيقه في مستحضرات التجميل

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

توصيف الهيكلية من السكريات جدار الخلية المنان في النباتات باستخدام خطي

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

تنامي البلورات البروتينية مع أبعاد متميزة باستخدام الآلي تبلور مقرونا في الموقع الحيوي تشتت الضوء

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

أسلوب قياس ألوان لقياس محتوى الحديد في النباتات

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

خالية من المعايرة في المختبر الكمي للبروتين هومو-أوليجوميريزيشن باستخدام الأجهزة التجارية والحرة والمفتوحة المصدر برمجيات التحليل السطوع

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

الكشف عن نشاط ج فوسفوليباسي في هوموجيناتي المخ من نحل العسل

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

في فيفو هيدروكسيل الجذر البروتين البصمة لدراسة التفاعلات البروتين في Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

توصيف هياكل أميلويد في الشيخوخة C. Elegans باستخدام التصوير مدى الحياة فلورسينس

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...