Name: in vivo calcium imaging in c. elegans body wall muscles
Uploaded: 2019-10-20T12:30:00
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Les auteurs remercient le Dr Alexander Gottschalk pour ZX1659, le RCaMP et la channelrhodopsine contenant la souche de ver, le Dr Hongkyun Kim pour la souche de ver slo-1(eg142), et le National Bioresource Project pour la souche de ver sca-1(tm5339).

1. Configuration du microscope
<ol><li>Utilisez un microscope composé avec des capacités de fluorescence. Pour cette étude, les données ont été recueillies sur un microscope droit(Tableau des matériaux) équipé de LED pour l'excitation.</li>
	<li>Afin de visualiser correctement les changements de fluorescence dans les muscles de la paroi du corps, utilisez un objectif de grossissement élevé.<ol>
<li>Pour les préparations disséquées, utilisez un objectif d'immersion de l'eau 60x NA 1.0 (<st...

<ol>
	<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca2++probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics.">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Activation+of+Channelrhodopsin-2+in+Excitable+Cells+of+Caenorhabditis+elegans+Triggers+Rapid+Behavioral+Responses.">Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses.</a> Current Biology. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li><li>Liewald, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+analysis+of+synaptic+function.">Optogenetic analysis of synaptic function.</a> Nature Methods. 5 (10), 895-902 (2008).</li><li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans.">Laser Microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biology. 107, 177-206 (2012).</li><li>Lewis, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+Receptor+Mutants+of+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans.">Cholinergic Receptor Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).</li><li>Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+levamisole+resistance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).</li><li>Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+GABA+and+two+acetylcholine+receptors+function+at+the+C.+elegans+neuromuscular+junction.">One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction.</a> Nature Neuroscience. 9, 791-798 (1999).</li><li>Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Imaging+of+Caenorhabditis+elegans+Using+Nanoparticle-Mediated+Immobilization.">Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization.</a> PLoS ONE. 8 (1), 1-6 (2013).</li><li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+control+of+microscopes+using+umanager.">Computer control of microscopes using umanager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. (Suppl 92), 1-17 (2010).</li><li>Richmond, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+and+Recording+from+The+C.+Elegans+Neuromuscular+Junction.">Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction.</a> Journal of Visualized Experiments. (24), 1-4 (2009).</li><li>Hoon Cho, J., Bandyopadhyay, J., Lee, J., Park, C. S., Ahnn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+isoforms+of+sarco/endoplasmic+reticulum+calcium+ATPase+(SERCA)+are+essential+in+Caenorhabditis+elegans.">Two isoforms of sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) are essential in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 261, 211-219 (2000).</li><li>Zwaal, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sarco-Endoplasmic+Reticulum+Ca2++ATPase+Is+Required+for+Development+and+Muscle+Function+in+Caenorhabditis+elegans.">The Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase Is Required for Development and Muscle Function in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (47), 43557-43563 (2001).</li><li>Stammers, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+sarco(endo)plasmic+reticulum+calcium-ATPases+(SERCA).">The regulation of sarco(endo)plasmic reticulum calcium-ATPases (SERCA).</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93, 1-12 (2015).</li><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Signaling.">Calcium Signaling.</a> Cell. 131, 1047-1058 (2007).</li><li>Hovnanian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serca+pumps+and+human+diseases.">Serca pumps and human diseases.</a> Calcium Signalling and Disease: Molecular Pathology of Calcium. , 337-363 (2007).</li><li>Periasamy, M., Kalyanasundaram, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SERCA+pump+isoforms:+Their+role+in+calcium+transport+and+disease.">SERCA pump isoforms: Their role in calcium transport and disease.</a> Muscle and Nerve. 35 (4), 430-442 (2007).</li><li>Gehlert, S., Bloch, W., Suhr, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-Dependent+Regulations+and+Signaling+in+Skeletal+Muscle:+From+Electro-Mechanical+Coupling+to+Adaptation.">Ca2+-Dependent Regulations and Signaling in Skeletal Muscle: From Electro-Mechanical Coupling to Adaptation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16, 1066-1095 (2015).</li><li>Martin, A. A., Richmond, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sarco(endo)plasmic+reticulum+calcium+ATPase+SCA-1+regulates+the+Caenorhabditis+elegans+nicotinic+acetylcholine+receptor+ACR-16.">The sarco(endo)plasmic reticulum calcium ATPase SCA-1 regulates the Caenorhabditis elegans nicotinic acetylcholine receptor ACR-16.</a> Cell Calcium. 72, 104-115 (2018).</li><li>Wang, Z., Saifee, O., Nonet, M. L., Salkoff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLO-1+Potassium+Channels+Control+Quantal+Content+of+Neurotransmitter+Release+at+the+C.+elegans+Neuromuscular+Junction.">SLO-1 Potassium Channels Control Quantal Content of Neurotransmitter Release at the C. elegans Neuromuscular Junction.</a> Neuron. 32, 867-881 (2001).</li><li>Abraham, L. S., Oh, H. J., Sancar, F., Richmond, J. E., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Alpha-Catulin+Homologue+Controls+Neuromuscular+Function+through+Localization+of+the+Dystrophin+Complex+and+BK+Channels+in+Caenorhabditis+elegans.">An Alpha-Catulin Homologue Controls Neuromuscular Function through Localization of the Dystrophin Complex and BK Channels in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 6 (8), 1-13 (2010).</li><li>Gourgou, E., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+induced+oxidative+stress+affects+ASH+neuronal+function+and+behavior+in+C.+elegans.">Chemically induced oxidative stress affects ASH neuronal function and behavior in C. elegans.</a> Scientific Reports. 6, 1-9 (2016).</li><li>Zahratka, J. A., Williams, P. D. E., Summers, P. J., Komuniecki, R. W., Bamber, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+differentially+modulates+Ca2++transients+and+depolarization+in+a+C.+elegans+nociceptor.">Serotonin differentially modulates Ca2+ transients and depolarization in a C. elegans nociceptor.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1041-1050 (2015).</li><li>Kerr, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+calcium+transients+in+neurons+and+pharyngeal+muscle+of+C.+elegans.">Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans.</a> Neuron. 26 (3), 583-594 (2000).</li><li>Nekimken, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pneumatic+stimulation+of+C.+elegans+mechanoreceptor+neurons+in+a+microfluidic+trap.">Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap.</a> Lab Chip. 17 (6), 1116-1127 (2017).</li><li>Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Neuronal+Calcium+Imaging+in+C.+elegans.">In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), 1-9 (2013).</li><li>Jospin, M., Jacquemond, V., Mariol, M. C., S&#233;galat, L., Allard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+L-type+voltage-dependent+Ca2+channel+EGL-19+controls+body+wall+muscle+function+in+Caenorhabditis+elegans.">The L-type voltage-dependent Ca2+channel EGL-19 controls body wall muscle function in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Cell Biology. 159 (2), 337-347 (2002).</li><li>Wabnig, S., Liewald, J. F., Yu, S., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+All-Optical+Analysis+of+Synaptic+Transmission+and+Synaptic+Vesicle+Recycling+in+Caenorhabditis+elegans.">High-Throughput All-Optical Analysis of Synaptic Transmission and Synaptic Vesicle Recycling in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. , 1-26 (2015).</li></ol>

Les GECI sont un outil puissant en neurobiologie de C. elegans. Des travaux antérieurs ont utilisé des techniques d'imagerie calcique pour examiner une grande variété de fonctions dans les neurones et les cellules musculaires, y compris les réponses sensorielles et comportementales, avec des méthodes variées de stimulation. Certaines études ont utilisé des stimuli chimiques pour déclencher les transitoires de calcium dans les neurones sensoriels ASH22,<sup class="xref...

Cet article présente des méthodes pour l'imagerie in vivo de calcium des muscles de la paroi du corps de C. elegans utilisant la stimulation neuronale optogénétique. Associer un muscle exprimé génétiquement encodé indicateur de calcium (GECI) avec la lumière bleue déclenché dépolarisation neuronale et fournit un système pour observer clairement les transitoires de calcium postsynaptic évoqués. Cela évite l'utilisation de la stimulation électrique, permettant une analyse non invasive des mutants affectant la dynamique du calcium postsynaptique.
Les GECI à fluorophore unique, comme le GCaMP, utilisent une seule molécule de protéine fluorescente fusionnée au domaine M13 de la kinase de la chaîne lumineuse de myosine à son extrémité N-terminale et de la calmoduline (CaM) au terminus C. Lors de la liaison calcique, le domaine CaM, qui a une forte affinité pour le calcium, subit un changement conformationnel induisant un changement conformationnel ultérieur dans la protéine fluorescente conduisant à une augmentation de l'intensité de fluorescence1. La fluorescence GCaMP est excitée à 488 nm, ce qui le rend impropre à être utilisé en conjonction avec la canalrhodopsine, qui a une longueur d'onde d'excitation similaire de 473 nm. Ainsi, afin de coupler les mesures de calcium avec la stimulation de canalrhodopsine, la protéine fluorescente verte de GCaMP doit être remplacée par une protéine fluorescente rouge, mRuby (RCaMP). L'utilisation du muscle exprimé RCaMP, en combinaison avec l'expression cholinergique de neurone moteur de la canalrhodopsine, permet des études à la jonction neuromusculaire de ver (NMJ) avec l'utilisation simultanée de l'optogénétique et de l'imagerie fonctionnelle dans le même animal 2.
L'utilisation de la canalrhodopsine contourne la nécessité de la stimulation électrique pour dépolariser les jonctions neuromusculaires de C. elegans, qui ne peuvent être réalisées que dans les préparations disséquées, rendant ainsi cette technique à la fois plus facile à utiliser et plus précise en ciblant des tissus spécifiques. Par exemple, channelrhodopsin a été précédemment utilisé dans C. elegans pour activer de façon réversible des neurones spécifiques, conduisant à l'activation robuste des neurones excitateurs ou inhibiteurs3,4. L'utilisation de la dépolarisation stimulée par la lumière contourne également la question des dommages neuronaux dus à la stimulation électrique directe. Ceci fournit l'occasion d'examiner les effets de beaucoup de différents protocoles de stimulation, y compris les stimulations soutenues et répétées, sur la dynamique de calcium postsynaptic4.
La nature transparente de C. elegans le rend idéal pour l'analyse fonctionnelle de l'imagerie fluorescente. Cependant, en stimulant les neurones excitatifs d'acétylcholine au NMJ, les animaux sont censés répondre avec une contraction musculaire immédiate4,rendant l'immobilisation des vers critique en visualisant les changements discrets de calcium. Traditionnellement, les agents pharmacologiques ont été utilisés pour paralyser les animaux. Un tel médicament utilisé est le lévamisole, un agoniste récepteur de l'acétolcholine cholinergique5,6,7. Puisque le lévamisole conduit à l'activation persistante d'un sous-type de récepteurs musculaires excitatifs, ce réactif est impropre à l'étude de la dynamique du calcium musculaire. L'action du lévamisole induit la dépolarisation postsynaptique, élevant le calcium cytosolique, et occluding observations suivant la stimulation presynaptic. Pour éviter l'utilisation de médicaments paralysants, nous avons examiné deux méthodes alternatives pour immobiliser C. elegans. Les animaux ont été collés vers le bas et puis disséqués ouverts pour exposer les muscles de la paroi du corps, semblable à la méthode d'électrophysiologie C. elegans NMJ8, ou nanobeads ont été utilisés pour immobiliser les animaux intacts9. Les deux procédures ont permis les mesures reproductibles du repos et ont évoqué des transitoires de calcium de muscle qui étaient facilement quantifiables.
Les méthodes dans cet article peuvent être employées pour mesurer les niveaux cytosoliques de base de calcium et les transitoires dans les cellules de muscle de corps postsynaptic dans C. elegans. Des exemples de données utilisant les deux techniques d'immobilisation différentes sont donnés. Les deux techniques tirent parti de l'optogénétique pour dépolariser les cellules musculaires sans l'utilisation de stimulation électrique. Ces exemples démontrent la faisabilité de cette méthode dans l'évaluation des mutations qui affectent la manipulation du calcium postsynaptique dans les vers et soulignent les avantages et les inconvénients des deux approches d'immobilisation.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>all-trans retinal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2500</td>
			<td>Necessary for excitation of channel rhodopsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber LED</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RCaMP illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino UNO</td>
			<td>Mouser</td>
			<td>782-A000066</td>
			<td>Controls fluorescence illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue LED</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>channelrhodopsin illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BX51WI microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Fixed state compound microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current controlled low noise linear power supply</td>
			<td>Ametek</td>
			<td>Sorenson</td>
			<td>Controls LED intensity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro</td>
			<td>Wavemetrics</td>
			<td>Wavemetrics.com</td>
			<td>Graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>imagej.nih.gov</td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUMFLN 60x water NA 1.4</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Water immersion objective for dissected preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master-8 Stimulator</td>
			<td>A.M.P.I</td>
			<td></td>
			<td>Master timer for image acquisition and LED illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Manager</td>
			<td></td>
			<td>micro-manager.org</td>
			<td>Controls camera acquisition and LED excitiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Spreadsheet software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pco.edge 4.2 CMOS camera</td>
			<td>pco.</td>
			<td>4.2</td>
			<td>High-speed camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlanApo N 60x oil NA 1.4</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Oil immersion objective for nanobead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead microspheres</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>00876-15</td>
			<td>For worm immobilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>solid state switches</td>
			<td>Sensata Technologies</td>
			<td>Crydom CMX100D6</td>
			<td>Controls timing of LED illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 
			(h134R)::yfp,lin-15(+)}; 
			Pmyo3::RCaMP35]</td>
			<td>Richmond Lab</td>
			<td>SY1627</td>
			<td>Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 
			(h134R)::yfp,lin-15(+)}; 
			Pmyo3::RCaMP35]</td>
			<td>Richmond Lab</td>
			<td></td>
			<td>Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 
			(h134R)::yfp,lin-15(+)}; 
			Pmyo3::RCaMP35]</td>
			<td>Gottschalk Lab</td>
			<td>ZX1659</td>
			<td>Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging in c. elegans body wall muscles

L'organisme modèle C. elegans fournit un excellent système pour effectuer l'imagerie in vivo du calcium. Son corps transparent et sa manipulabilité génétique permettent l'expression ciblée de capteurs de calcium génétiquement codés. Ce protocole décrit l'utilisation de ces capteurs pour l'imagerie in vivo de la dynamique calcique dans les cellules ciblées, en particulier les muscles de la paroi du corps des vers. En utilisant la co-expression de la nérhodopsine presynaptique, la stimulation de la libération d'acétylcholine des neurones moteurs excitatifs peut être induite à l'aide d'impulsions de lumière bleue, ce qui entraîne une dépolarisation musculaire et des changements reproductibles dans le calcium cytoplasmique Niveaux. Deux techniques d'immobilisation de ver sont discutées avec des niveaux variables de difficulté. La comparaison de ces techniques démontre que les deux approches préservent la physiologie de la jonction neuromusculaire et permettent la quantification reproductible des transitoires de calcium. En jumelant l'optogénétique et l'imagerie fonctionnelle du calcium, les changements dans la manipulation du calcium postsynaptique et l'homéostasie peuvent être évalués dans une variété de milieux mutants. Les données présentées valident les deux techniques d'immobilisation et examinent spécifiquement les rôles du Sarco sarco (endo)plasmique de calcium ATPase de C. elegans et du canal de potassium DE BK calcium-activé dans la régulation de calcium de muscle de corps.

Cette technique a évalué les changements chez les mutants qui auraient une incidence sur la manipulation du calcium ou la dépolarisation musculaire. Les niveaux de fluorescence de ligne de base et les transitoires fluorescents ont été visualisés et les cinétiques cytosoliques de calcium et de calcium de repos dans le muscle ont été évaluées. Il est important que les animaux aient été cultivés sur la rétine tout-trans pendant au moins trois jours pour assurer l'incorporation...

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In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

Cette méthode fournit un moyen de coupler l'optogénétique et les capteurs de calcium génétiquement codés pour imager les niveaux cytosoliques de base de calcium et les changements dans les transitoires évoquées de calcium dans les muscles de la paroi du corps de l'organisme modèle C. elegans.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles In Vivo

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Ce protocole fournit deux méthodes pour mobiliser C.Elegans pour effectuer l’imagerie in vivo calcium des muscles de la paroi du corps. Cette méthode peut aider à répondre aux questions liées à l’homéostasie du calcium et la manipulation du calcium, et une synapse accessible dans l’organisme génétiquement rétractable. Cette technique peut fournir une meilleure compréhension des mécanismes régulant l’homéostasie du calcium musculaire, et peut, par conséquent, être important dans l’identification des conditions ou des voies moléculaires qui ont un impact sur le couplage de contraction d’excitation par la mauvaise régulation du cycle du calcium.Ces méthodes peuvent fournir un aperçu des domaines de recherche, y compris, mais pas limité aussi, la neurobiologie, la biologie du développement et la biologie cellulaire. Ces techniques pourraient être adaptées pour étudier une variété de types de cellules et de C.elegans, d’autres nématodes connexes ainsi que des larves de filsafat. La démonstration visuelle de cette méthode est critique afin que l’expérimentateur puisse comprendre la technique de dissection, et être en mesure d’évaluer avec précision les transitoires de calcium des animaux correctement immobilisés.Commencez par installer le microscope pour l’imagerie fluorescente. Utilisez une caméra scientifique CMOS capable d’imagerie full frame à 100 hertz afin de suivre les changements rapides des niveaux de calcium. Contrôlez l’acquisition de caméras et l’excitation fluorescente LED avec un logiciel de microbrasserie fonctionnant dans ImageJ.Utilisez un plug-in de plate-forme électronique opensource qui se connecte à une carte de microcontrôleur opensource externe pour gérer les impulsions de synchronisation externes qui contrôlent les excitations fluorescentes. Pour contrôler la logique de synchronisation, activez le protocole d’acquisition de microbrasserie dans le logiciel selon les instructions des fabricants. Utilisez deux LED pour stimuler la rhodopsine du canal avec la lumière bleue et enregistrer les changements RCaMP.Activez la rhodopsine de canal avec la LED d’am avec la longueur d’onde maximale d’admission de 470 nanomètres et un filtre de bandpass, et excitez RCaMP avec une LED avec une longueur d’onde maximale d’admission de 594 nanomètres et un filtre de bandpass. Co-illuminer les deux LED et transmettre la lumière à la même voie optique à l’aide d’un faisceau dichroïque combiner. Contrôler le moment de l’éclairage LED avec un interrupteur à l’état solide contrôlé par des signaux TTL selon les directions manuscrites, et définir l’intensité LED avec les alimentations électriques linéaires de bruit de charge contrôlée actuelle, puis programmer le protocole de simulation de la lumière bleue dans un simulateur.Dans cette expérience activer la simulation de la lumière bleue après deux secondes de capture de la fluorescence RCaMP seulement et utiliser un train de cinq, deux millisecondes impulsions de lumière bleue avec des intervalles de 50 millisecondes pour activer la rhodopsine canal. Si vous utilisez la préparation de dissection, effectuez la dissection de C.elegans en basse lumière. Placez les animaux dans le plat de dissection avec la base de coverslip recouverte de silicone qui est remplie d’un millimole de solution extracellulaire de calcium préparé selon les directives manuscrites.Collez les animaux à l’aide de l’adhésif liquide topique de la peau avec coloration bleue le long du côté dorsale du ver. Et faire une incision cuticule latérale le long de l’interface colle et ver à l’aide d’aiguilles en verre. Utilisez une pipette buccale pour dégager les viscères internes de la cavité du ver, puis collez le rabat cuticule de l’animal pour exposer les muscles ventrals médiaux de la paroi corporelle pour l’imagerie.Si vous utilisez la préparation nano-perle, faire une solution fondue 5%Agra en utilisant de l’eau distillée à un volume final de 100 millilitres. Utilisez une pipette Pasteur pour placer une goutte de solution en fusion-Agra sur une glissière en verre et placez immédiatement une deuxième glissière de verre sur le dessus en utilisant une pression douce pour créer un pad agra même. Retirer la lame supérieure et à environ quatre microlitres de nanobilles de polystyrène au milieu de la garniture.En basse lumière ajouter quatre à six C.elegans dans la solution nano-perles, en s’assurant que les animaux ne sont pas allongés les uns sur les autres, et placer soigneusement un coverslip sur le dessus. Lorsque vous êtes prêt à l’image, placez la diapositive préparée ou le plat de dissection sur le microscope et de trouver et de se concentrer sur un ver en utilisant 10 fois grossissement et faible éclairage du champ lumineux. Passez à 60 fois le grossissement dans l’excitation fluorescente RCaMP pour identifier un muscle médial ventrum mur du corps qui est antérieur à la vulve et dans le plan vocal correct.Ensuite, changez la voie d’image de l’oculaire à la caméra en tirant le basculement et en cliquant en direct dans le logiciel d’acquisition de données. Cliquez sur le bouton ORI dans le logiciel d’acquisition de données, et créez une boîte autour du muscle sur qui se concentre. Sur le stimulateur, allumez la voie de stimulation de la lumière bleue précédemment programmée, puis cliquez sur Acquérir sur le logiciel d’imagerie pour capturer l’image.Lorsque les C.elegans sont cultivés sur la rétine tout-trans, incorporant avec succès la rétine et activant la rhodopsine de canal, un transitoire de calcium peut être évoqué. Si les animaux ne sont pas exposés à la rétine tout-trans, aucun calcium musculaire transitoire n’est déclenché. Ce protocole a été utilisé pour étudier la perte de la fonction sca-1 mutants, qui ont un impact sur la pompe à calcium réticulum sarcoplasmique codé par le gène sca-1.Mais, les augmentations de préparation de dissection des niveaux de ligne de base de fluorescence de RCaMP ont été observées dans le mutant comparé au contrôle, suggérant que la mutation a besoin des niveaux élevés de calcium cytoplasmique de repos. Il y avait une diminution significative des niveaux de calcium de pointe dans les mutants de sca-1 par rapport au contrôle. Cependant, aucun changement n’a été observé dans l’heure de pointe augmentée ou la mi-temps de décomposition.Fait important, des résultats similaires peuvent être observés en utilisant la préparation de nano-perles moins difficile sur le plan technique. La perte de la fonction slo-mutants, qui perturbent le calcium activé de grands canaux de potassium ont été évalués afin d’étudier les mutants qui ont indirectement un impact sur la manipulation du calcium chez C.elegans. Lorsque les niveaux de base du RCaMP ont été mesurés, les mutants ont affiché une fluorescence accrue par rapport aux témoins.Lors de l’évaluation de la cinétique du calcium transitoire aucun changement dans les niveaux de calcium de pointe n’a été vu. Les mutants slo-1 (par exemple142) ont toutefois montré une augmentation significative à l’heure de pointe. L’étape la plus importante à retenir lors de l’achèvement de la procédure est de préparer des animaux expérimentaux dans la rétine tout-trans.Sans cette étape, la rhodopsine du canal sera inactive, empêchant les transitoires de calcium induits par la lumière d’être déclenchés. Après cette procédure, l’électrophysiologie et l’analyse comportementale peuvent être faites pour évaluer l’impact fonctionnel de tout changement observé dans l’homéostasie du calcium. En utilisant les méthodes d’immobilisation décrites ici, ouvre la voie à une exploration plus approfondie de la dynamique du calcium et démontre que des résultats comparables peuvent être observés en réponse à la stimulation neuronale optogénétique et la capture des transitoires de calcium musculaire en utilisant la technique beaucoup moins difficile d’immobilisation des perles.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Recherche

Biochimie

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