Name: in vivo calcium imaging in c. elegans body wall muscles
Uploaded: 2019-10-20T12:30:00
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Gli autori ringraziano il Dr. Alexander Gottschalk per la SX1659, la RCaMP e la channelrhodopsin contenente ceppo di verme, dr. Hongkyun Kim per il ceppo di vermi slo-1(eg142) e il National Bioresource Project per il ceppo di vermi sca-1(tm5339).

1. Configurazione del microscopio
<ol><li>Utilizzare un microscopio composto con capacità di fluorescenza. Per questo studio, sono stati raccolti dati su un microscopio verticale (Tabella dei materiali) dotato di LED per l'eccitazione.</li>
	<li>Al fine di visualizzare correttamente i cambiamenti di fluorescenza nei muscoli della parete del corpo, utilizzare un obiettivo di ingrandimento elevato.<ol>
<li>Per i preparati sezionati, utilizzare un obiettivo di immersione in acqua 60x NA 1.0 (Tabe...

<ol>
	<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca2++probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics.">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Activation+of+Channelrhodopsin-2+in+Excitable+Cells+of+Caenorhabditis+elegans+Triggers+Rapid+Behavioral+Responses.">Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses.</a> Current Biology. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li><li>Liewald, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+analysis+of+synaptic+function.">Optogenetic analysis of synaptic function.</a> Nature Methods. 5 (10), 895-902 (2008).</li><li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans.">Laser Microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biology. 107, 177-206 (2012).</li><li>Lewis, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+Receptor+Mutants+of+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans.">Cholinergic Receptor Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).</li><li>Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+levamisole+resistance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).</li><li>Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+GABA+and+two+acetylcholine+receptors+function+at+the+C.+elegans+neuromuscular+junction.">One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction.</a> Nature Neuroscience. 9, 791-798 (1999).</li><li>Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Imaging+of+Caenorhabditis+elegans+Using+Nanoparticle-Mediated+Immobilization.">Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization.</a> PLoS ONE. 8 (1), 1-6 (2013).</li><li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+control+of+microscopes+using+umanager.">Computer control of microscopes using umanager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. (Suppl 92), 1-17 (2010).</li><li>Richmond, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+and+Recording+from+The+C.+Elegans+Neuromuscular+Junction.">Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction.</a> Journal of Visualized Experiments. (24), 1-4 (2009).</li><li>Hoon Cho, J., Bandyopadhyay, J., Lee, J., Park, C. S., Ahnn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+isoforms+of+sarco/endoplasmic+reticulum+calcium+ATPase+(SERCA)+are+essential+in+Caenorhabditis+elegans.">Two isoforms of sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) are essential in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 261, 211-219 (2000).</li><li>Zwaal, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sarco-Endoplasmic+Reticulum+Ca2++ATPase+Is+Required+for+Development+and+Muscle+Function+in+Caenorhabditis+elegans.">The Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase Is Required for Development and Muscle Function in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (47), 43557-43563 (2001).</li><li>Stammers, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+sarco(endo)plasmic+reticulum+calcium-ATPases+(SERCA).">The regulation of sarco(endo)plasmic reticulum calcium-ATPases (SERCA).</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93, 1-12 (2015).</li><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Signaling.">Calcium Signaling.</a> Cell. 131, 1047-1058 (2007).</li><li>Hovnanian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serca+pumps+and+human+diseases.">Serca pumps and human diseases.</a> Calcium Signalling and Disease: Molecular Pathology of Calcium. , 337-363 (2007).</li><li>Periasamy, M., Kalyanasundaram, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SERCA+pump+isoforms:+Their+role+in+calcium+transport+and+disease.">SERCA pump isoforms: Their role in calcium transport and disease.</a> Muscle and Nerve. 35 (4), 430-442 (2007).</li><li>Gehlert, S., Bloch, W., Suhr, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-Dependent+Regulations+and+Signaling+in+Skeletal+Muscle:+From+Electro-Mechanical+Coupling+to+Adaptation.">Ca2+-Dependent Regulations and Signaling in Skeletal Muscle: From Electro-Mechanical Coupling to Adaptation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16, 1066-1095 (2015).</li><li>Martin, A. A., Richmond, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sarco(endo)plasmic+reticulum+calcium+ATPase+SCA-1+regulates+the+Caenorhabditis+elegans+nicotinic+acetylcholine+receptor+ACR-16.">The sarco(endo)plasmic reticulum calcium ATPase SCA-1 regulates the Caenorhabditis elegans nicotinic acetylcholine receptor ACR-16.</a> Cell Calcium. 72, 104-115 (2018).</li><li>Wang, Z., Saifee, O., Nonet, M. L., Salkoff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLO-1+Potassium+Channels+Control+Quantal+Content+of+Neurotransmitter+Release+at+the+C.+elegans+Neuromuscular+Junction.">SLO-1 Potassium Channels Control Quantal Content of Neurotransmitter Release at the C. elegans Neuromuscular Junction.</a> Neuron. 32, 867-881 (2001).</li><li>Abraham, L. S., Oh, H. J., Sancar, F., Richmond, J. E., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Alpha-Catulin+Homologue+Controls+Neuromuscular+Function+through+Localization+of+the+Dystrophin+Complex+and+BK+Channels+in+Caenorhabditis+elegans.">An Alpha-Catulin Homologue Controls Neuromuscular Function through Localization of the Dystrophin Complex and BK Channels in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 6 (8), 1-13 (2010).</li><li>Gourgou, E., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+induced+oxidative+stress+affects+ASH+neuronal+function+and+behavior+in+C.+elegans.">Chemically induced oxidative stress affects ASH neuronal function and behavior in C. elegans.</a> Scientific Reports. 6, 1-9 (2016).</li><li>Zahratka, J. A., Williams, P. D. E., Summers, P. J., Komuniecki, R. W., Bamber, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+differentially+modulates+Ca2++transients+and+depolarization+in+a+C.+elegans+nociceptor.">Serotonin differentially modulates Ca2+ transients and depolarization in a C. elegans nociceptor.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1041-1050 (2015).</li><li>Kerr, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+calcium+transients+in+neurons+and+pharyngeal+muscle+of+C.+elegans.">Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans.</a> Neuron. 26 (3), 583-594 (2000).</li><li>Nekimken, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pneumatic+stimulation+of+C.+elegans+mechanoreceptor+neurons+in+a+microfluidic+trap.">Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap.</a> Lab Chip. 17 (6), 1116-1127 (2017).</li><li>Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Neuronal+Calcium+Imaging+in+C.+elegans.">In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), 1-9 (2013).</li><li>Jospin, M., Jacquemond, V., Mariol, M. C., S&#233;galat, L., Allard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+L-type+voltage-dependent+Ca2+channel+EGL-19+controls+body+wall+muscle+function+in+Caenorhabditis+elegans.">The L-type voltage-dependent Ca2+channel EGL-19 controls body wall muscle function in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Cell Biology. 159 (2), 337-347 (2002).</li><li>Wabnig, S., Liewald, J. F., Yu, S., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+All-Optical+Analysis+of+Synaptic+Transmission+and+Synaptic+Vesicle+Recycling+in+Caenorhabditis+elegans.">High-Throughput All-Optical Analysis of Synaptic Transmission and Synaptic Vesicle Recycling in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. , 1-26 (2015).</li></ol>

I GECI sono un potente strumento nella neurobiologia di C. elegans. Il lavoro precedente ha utilizzato tecniche di imaging del calcio per esaminare un'ampia varietà di funzioni sia nei neuroni che nelle cellule muscolari, comprese le risposte sensoriali e comportamentali, con vari metodi di stimolazione. Alcuni studi hanno utilizzato stimoli chimici per innescare transitori di calcio nei neuroni sensoriali ASH22,23 o per indurre le onde di calcio nei mu...

Questo articolo presenta metodi per l'imaging del calcio in vivo dei muscoli della parete corporea di C. elegans utilizzando la stimolazione neuronale optogenetica. L'associazione di un muscolo ha espresso indicatore di calcio geneticamente codificato (GECI) con la depolarizzazione neuronale innescata dalla luce blu e fornisce un sistema per osservare chiaramente i transitori di calcio postsinaptico evocati. Questo evita l'uso della stimolazione elettrica, consentendo un'analisi non invasiva dei mutanti che influenzano la dinamica post-sinaptica del calcio.
I GECI a singolo fluoroforo, come GCaMP, utilizzano una singola molecola proteica fluorescente fusa nel dominio M13 della catena luminosa miosina chinasi all'estremità terminale N e al calmodulin (CaM) al C-terminus. Al momento del legame del calcio, il dominio CaM, che ha un'alta affinità per il calcio, subisce un cambiamento conformazionale che induce un successivo cambiamento conformazionale nella proteina fluorescente che porta ad un aumento dell'intensità fluorescenza1. La fluorescenza GCaMP è eccitata a 488 nm, rendendola inadatta per essere utilizzata in combinazione con la channelrhodopsin, che ha una lunghezza d'onda di eccitazione simile di 473 nm. Pertanto, al fine di accoppiare le misurazioni del calcio con la stimolazione della channelrhodopsin, la proteina fluorescente verde di GCaMP deve essere sostituita con una proteina fluorescente rossa, mRuby (RCaMP). Utilizzando il muscolo espresso RCaMP, in combinazione con l'espressione del neurone motorio colinergico della channelrhodopsin, permette studi presso la giunzione neuromuscolare del verme (NMJ) con l'uso simultaneo di optogenetica e imaging funzionale all'interno dello stesso animale 2.
L'uso della channelrhodopsin bypassa la necessità che la stimolazione elettrica depolarizzi le giunzioni neuromuscolari di C. elegans, che possono essere raggiunte solo in preparati sezionati, rendendo così questa tecnica più facile da impiegare e più precisa quando si prendono di mira tessuti specifici. Ad esempio, la channelrhodopsin è stata precedentemente utilizzata in C. elegans per attivare in modo reversibilizzato neuroni specifici, portando all'attivazione robusta di neuroni eccitatori o inibitori3,4. L'uso della depolarizzazione stimolata dalla luce elude anche il problema dei danni neuronali dovuti alla stimolazione elettrica diretta. Questo offre l'opportunità di esaminare gli effetti di molti protocolli di stimolazione diversi, tra cui stimolazioni sostenute e ripetute, sulla dinamica post-sinaptica del calcio4.
La natura trasparente di C. elegans lo rende ideale per l'analisi funzionale dell'imaging fluorescente. Tuttavia, quando si stimolano i neuroni eccitatori di acetilcolina al NMJ, gli animali sono tenuti a rispondere con una contrazione muscolare immediata4, rendendo l'immobilizzazione dei vermi critici nella visualizzazione dei cambiamenti discreti di calcio. Tradizionalmente, gli agenti farmacologici sono stati utilizzati per paralizzare gli animali. Uno di questi farmaci utilizzati è levamisole, un agonista recettore acetilcolina colinergico5,6,7. Poiché levamisole porta all'attivazione persistente di un sottotipo di recettori muscolari eccitatori, questo reagente non è adatto per lo studio della dinamica del calcio muscolare. L'azione di levamisole induce depolarizzazione post-sinaptica, elevando il calcio citosolico, e osservazioni occlude a seguito di stimolazione pressinaptica. Per evitare l'uso di farmaci paralizzanti, abbiamo esaminato due metodi alternativi per immobilizzare C. elegans. Gli animali sono stati incollati e poi sezionati aperti per esporre i muscoli della parete del corpo, simile al metodo elettrofisiologia C. elegans NMJesistente 8, o nanosfere sono state utilizzate per immobilizzare gli animali intatti9. Entrambe le procedure hanno permesso le misurazioni riproducibili dei transitori di calcio muscolare a riposo ed evocate che erano facilmente quantificabili.
I metodi in questo documento possono essere utilizzati per misurare i livelli di calcio citosolico di base e transitori nelle cellule muscolari post-sinaptiche della parete del corpo in C. elegans. Vengono forniti esempi di dati che utilizzano le due diverse tecniche di immobilizzazione. Entrambe le tecniche sfruttano l'optogenetica per depolarizzare le cellule muscolari senza l'uso di stimolazione elettrica. Questi esempi dimostrano la fattibilità di questo metodo nella valutazione delle mutazioni che influenzano la manipolazione post-sinaptica del calcio nei vermi e sottolineano i pro e i contro dei due approcci di immobilizzazione.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>all-trans retinal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2500</td>
			<td>Necessary for excitation of channel rhodopsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber LED</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RCaMP illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino UNO</td>
			<td>Mouser</td>
			<td>782-A000066</td>
			<td>Controls fluorescence illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue LED</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>channelrhodopsin illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BX51WI microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Fixed state compound microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current controlled low noise linear power supply</td>
			<td>Ametek</td>
			<td>Sorenson</td>
			<td>Controls LED intensity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro</td>
			<td>Wavemetrics</td>
			<td>Wavemetrics.com</td>
			<td>Graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>imagej.nih.gov</td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUMFLN 60x water NA 1.4</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Water immersion objective for dissected preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master-8 Stimulator</td>
			<td>A.M.P.I</td>
			<td></td>
			<td>Master timer for image acquisition and LED illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Manager</td>
			<td></td>
			<td>micro-manager.org</td>
			<td>Controls camera acquisition and LED excitiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Spreadsheet software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pco.edge 4.2 CMOS camera</td>
			<td>pco.</td>
			<td>4.2</td>
			<td>High-speed camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlanApo N 60x oil NA 1.4</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Oil immersion objective for nanobead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead microspheres</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>00876-15</td>
			<td>For worm immobilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>solid state switches</td>
			<td>Sensata Technologies</td>
			<td>Crydom CMX100D6</td>
			<td>Controls timing of LED illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 
			(h134R)::yfp,lin-15(+)}; 
			Pmyo3::RCaMP35]</td>
			<td>Richmond Lab</td>
			<td>SY1627</td>
			<td>Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 
			(h134R)::yfp,lin-15(+)}; 
			Pmyo3::RCaMP35]</td>
			<td>Richmond Lab</td>
			<td></td>
			<td>Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 
			(h134R)::yfp,lin-15(+)}; 
			Pmyo3::RCaMP35]</td>
			<td>Gottschalk Lab</td>
			<td>ZX1659</td>
			<td>Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging in c. elegans body wall muscles

L'organismo modello C. elegans fornisce un ottimo sistema per eseguire l'imaging in vivo del calcio. Il suo corpo trasparente e la sua manipolabilità genetica consentono l'espressione mirata di sensori di calcio geneticamente codificati. Questo protocollo delinea l'uso di questi sensori per l'imaging in vivo della dinamica del calcio nelle cellule mirate, in particolare i muscoli della parete corporea dei vermi. Utilizzando la co-espressione della channelrhodopsin presintica, la stimolazione del rilascio dell'acetilcolina dai motoneuroni eccitatori può essere indotta utilizzando impulsi di luce blu, con conseguente depolarizzazione muscolare e cambiamenti riproducibili nel calcio citoplastico Livelli. Due tecniche di immobilizzazione dei vermi sono discusse con diversi livelli di difficoltà. Il confronto di queste tecniche dimostra che entrambi gli approcci preservano la fisiologia della giunzione neuromuscolare e consentono la quantificazione riproducibile dei transitori di calcio. Associando l'optogenetica e l'imaging funzionale del calcio, i cambiamenti nella manipolazione post-sinaptica del calcio e nell'omeostasi possono essere valutati in una varietà di background mutanti. I dati presentati convalidano entrambe le tecniche di immobilizzazione ed esaminano specificamente i ruoli del c. elegans sarco(endo)plasmic reticular calcium ATPase e il canale di potassio BK attivato dal calcio nella regolazione del calcio muscolare della parete corporea.

Questa tecnica ha valutato i cambiamenti nei mutanti che si ritiene influenzino la manipolazione del calcio o la depolarizzazione muscolare. Sono stati visualizzati i livelli di fluorescenza di base e i transitori fluorescenti e sono stati valutati il calcio citosolico a riposo e la cinetica di calcio all'interno del muscolo. È importante che gli animali siano stati coltivati su una retina tutta trans per almeno tre giorni per garantire la corretta incorporazione della retina, attivando ...

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In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

Questo metodo fornisce un modo per coppie di optogenetica e sensori di calcio geneticamente codificati per l'immagine dei livelli di calcio citosolico di base e cambiamenti nei transitori di calcio evocati nei muscoli della parete del corpo dell'organismo modello C. elegans.

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Muscoli della parete del corpo

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Questo protocollo fornisce due metodi per mobilitare i C.Elegans per eseguire l'imaging in vivo del calcio dei muscoli delle pareti del corpo. Questo metodo può aiutare a rispondere alle domande relative all'omeostasi del calcio e alla manipolazione del calcio e a una sinapsi accessibile nell'organismo geneticamente trattabile. Questa tecnica può fornire una migliore comprensione dei meccanismi che regolano l'omeostasi del calcio muscolare e può, quindi, essere importante nell'identificazione di condizioni o percorsi molecolari che hanno un impatto sull'accoppiamento della contrazione dell'eccitazione attraverso l'errata regolamentazione del ciclo del calcio.Questi metodi possono fornire informazioni sulle aree di ricerca tra cui, ma non solo, la neurobiologia, la biologia dello sviluppo e la biologia cellulare. Queste tecniche potrebbero essere adattate per studiare una varietà di tipi di cellule e C.elegans, altri nematodi correlati e larve di filsafat. La dimostrazione visiva di questo metodo è fondamentale in modo che lo sperimentatore possa comprendere la tecnica di dissezione ed essere in grado di valutare con precisione i transitori di calcio da animali correttamente immobilizzati.Inizia impostando il microscopio per l'imaging fluorescente. Utilizzare una telecamera CMOS scientifica in grado di eseguire l'imaging full frame a 100 hertz per tenere traccia dei rapidi cambiamenti nei livelli di calcio. Controlla l'acquisizione della telecamera e l'eccitazione fluorescente a LED con un software micromanager in esecuzione in ImageJ.Utilizzare un plug-in di piattaforma elettronica opensource che si collega a una scheda microcontroller opensource esterna per gestire gli impulsi di temporizzazione esterni che controllano le eccitazioni fluorescenti. Per controllare la logica di temporizzazione, attivare il protocollo di acquisizione del micromanager nel software secondo le istruzioni dei produttori. Utilizzare due LED per stimolare la rodopsina del canale con luce blu e registrare i cambiamenti RCaMP.Attivare la rodopsina del canale con LED am con la lunghezza d'onda di ammissione di picco di 470 nanometri e un filtro passa banda, ed eccitare RCaMP con un LED con una lunghezza d'onda di ammissione di picco di 594 nanometri e un filtro passa banda. Co-illuminare entrambi i LED e trasmettere la luce allo stesso percorso ottico utilizzando un combinatore di fascio dicroico. Controllare la temporizzazione dell'illuminazione a LED con interruttori a stato solido controllati da segnali TTL in base alle direzioni del manoscritto e impostare l'intensità del LED con gli alimentatori lineari a rumore di carico controllato di corrente, quindi programmare il protocollo di simulazione della luce blu in un simulatore.In questo esperimento attivare la simulazione della luce blu dopo due secondi di acquisizione della sola fluorescenza RCaMP e utilizzare un treno di cinque impulsi di luce blu di due millisecondi con intervalli di 50 millisecondi per attivare la rodopsina del canale. Se si utilizza la preparazione della dissezione, eseguire la dissezione C.elegans in condizioni di scarsa illuminazione. Mettere gli animali nella piastra di dissezione con la base di coverlip rivestita in silicone che viene riempita con un millimolo di soluzione extracellulare di calcio preparato secondo le indicazioni manoscritte.Incollare gli animali utilizzando l'adesivo liquido per la pelle topica con colorazione blu lungo il lato dorsale del verme. E fare un'incisione della cuticola laterale lungo l'interfaccia colla e verme usando aghi di vetro. Utilizzare una pipetta per la bocca per cancellare i visceri interni dalla cavità del verme, quindi incollare il lembo della cuticola dell'animale per esporre i muscoli della parete corporea mediale ventrale per l'imaging.Se si utilizza la preparazione di nano-perline, fare una soluzione fusa 5%Agra utilizzando acqua distillata ad un volume finale di 100 millilitri. Utilizzare una pipetta Pasteur per posizionare una goccia di soluzione fusa-Agra su uno scivolo di vetro e posizionare immediatamente un secondo scivolo di vetro sopra la parte superiore utilizzando delicatamente la pressione per creare un tampone Agra uniforme. Rimuovere lo scivolo superiore e a circa quattro microlitri di nano-perline di polistirolo al centro del pad.In condizioni di scarsa illuminazione aggiungere da quattro a sei C.elegans nella soluzione di nano-perline, assicurandosi che gli animali non giacevano uno sopra l'altro, e posizionare con cura un coverslip sopra. Quando sei pronto per l'immagine, posiziona la diapositiva preparata o la piastra di dissezione al microscopio e trova e concentrati su un verme usando l'ingrandimento 10 volte e l'illuminazione del campo luminoso fioca. Passare a 60 volte l'ingrandimento nell'eccitazione fluorescente RCaMP per identificare un muscolo ventrum mediale della parete corporea anteriore alla vulva e nel piano vocale corretto.Quindi modificare il percorso dell'immagine dall'oculare alla fotocamera estraendo l'interruttore e facendo clic dal vivo all'interno del software di acquisizione dati. Fare clic sul pulsante ORI nel software di acquisizione dati e creare una casella intorno al muscolo su cui si sta concentrando. Sullo stimolatore, attivare il percorso di stimolazione della luce blu precedentemente programmato, quindi fare clic su Acquisisci sul software di imaging per acquisire l'immagine.Quando i C.elegans vengono coltivati su retina completamente trans, incorporando con successo la retina e attivando la rodopsina del canale, può essere evocato un transitorio di calcio. Se gli animali non sono esposti alla retina tutta trans, non viene attivato alcun transitorio muscolare di calcio. Questo protocollo è stato utilizzato per studiare la perdita di mutanti sca-1 funzione, che hanno un impatto sulla pompa di calcio del reticolo sarcoplasmatico codificata dal gene sca-1.Ma, la preparazione della dissezione aumenta nei livelli di base della fluorescenza RCaMP sono stati osservati nel mutante rispetto al controllo, suggerendo che la mutazione ha bisogno degli elevati livelli di calcio citoplasmatico a riposo. C'è stata una significativa diminuzione dei livelli massimi di calcio nei mutanti sca-1 rispetto al controllo. Tuttavia, non si è visto alcun cambiamento nel tempo di picco ascesa o nel tempo di mezzo decadimento.È importante sottolineare che risultati simili possono essere osservati utilizzando la preparazione meno tecnicamente impegnativa delle nano-perline. La perdita di slo-mutanti a funzione, che interrompono i grandi canali di potassio attivati dal calcio, è stata valutata al fine di indagare i mutanti che hanno un impatto indiretto sulla manipolazione del calcio nei C.elegans. Quando sono stati misurati i livelli di base di RCaMP, i mutanti hanno mostrato una maggiore fluorescenza rispetto ai controlli.Quando si valuta la cinetica del transitorio di calcio non sono stati osservati cambiamenti nei livelli di picco del calcio. I mutanti slo-1(ad esempio142), tuttavia, mostrarono un aumento significativamente aumentato del tempo di picco. Il passo più importante da ricordare quando si completa la procedura è quello di preparare animali da esperimento in retina tutta trans.Senza questo passaggio la rodopsina del canale sarà inattiva, impedendo l'attivazione di transitori di calcio indotti dalla luce. Seguendo questa procedura, l'elettrofisiologia e l'analisi comportamentale possono essere fatte per valutare l'impatto funzionale di eventuali cambiamenti osservati nell'omeostasi del calcio. Utilizzando i metodi di immobilizzazione qui delineati, apre la strada a ulteriori esplorazioni della dinamica del calcio e dimostra che risultati comparabili possono essere osservati in risposta alla stimolazione neuronale optogenetica e alla cattura di transitori di calcio muscolare utilizzando la tecnica di immobilizzazione delle perline molto meno impegnativa.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

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Ricerca

Biochimica

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