Name: in vivo calcium imaging in c. elegans body wall muscles
Uploaded: 2019-10-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles at JoVE.com

著者らは、ZX1659のアレクサンダー・ゴッチョルク博士、ワーム株を含むRCaMPとチャネルロドプシン、slo-1(例えば142)ワーム株のホンギョン・キム博士、およびsca-1(tm5339)ワーム株の国家生物資源プロジェクトに感謝しています。

1. 顕微鏡セットアップ
<ol><li>蛍光機能を備えた複合顕微鏡を使用します。本研究では、励起用のLEDを装着した直立顕微鏡(材料の表)でデータを収集した。</li>
	<li>体壁筋の蛍光変化を適切に可視化するためには、高倍率の目的を使用します。<ol>
<li>解剖された調製物には、60x NA 1.0水浸漬目的(材料表)を使用してください。</li>
		<li>ナノビーズを用いる調製物には、60x...

<ol>
	<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca2++probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics.">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Activation+of+Channelrhodopsin-2+in+Excitable+Cells+of+Caenorhabditis+elegans+Triggers+Rapid+Behavioral+Responses.">Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses.</a> Current Biology. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li><li>Liewald, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+analysis+of+synaptic+function.">Optogenetic analysis of synaptic function.</a> Nature Methods. 5 (10), 895-902 (2008).</li><li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans.">Laser Microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biology. 107, 177-206 (2012).</li><li>Lewis, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+Receptor+Mutants+of+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans.">Cholinergic Receptor Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).</li><li>Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+levamisole+resistance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).</li><li>Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+GABA+and+two+acetylcholine+receptors+function+at+the+C.+elegans+neuromuscular+junction.">One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction.</a> Nature Neuroscience. 9, 791-798 (1999).</li><li>Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Imaging+of+Caenorhabditis+elegans+Using+Nanoparticle-Mediated+Immobilization.">Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization.</a> PLoS ONE. 8 (1), 1-6 (2013).</li><li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+control+of+microscopes+using+umanager.">Computer control of microscopes using umanager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. (Suppl 92), 1-17 (2010).</li><li>Richmond, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+and+Recording+from+The+C.+Elegans+Neuromuscular+Junction.">Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction.</a> Journal of Visualized Experiments. (24), 1-4 (2009).</li><li>Hoon Cho, J., Bandyopadhyay, J., Lee, J., Park, C. S., Ahnn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+isoforms+of+sarco/endoplasmic+reticulum+calcium+ATPase+(SERCA)+are+essential+in+Caenorhabditis+elegans.">Two isoforms of sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) are essential in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 261, 211-219 (2000).</li><li>Zwaal, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sarco-Endoplasmic+Reticulum+Ca2++ATPase+Is+Required+for+Development+and+Muscle+Function+in+Caenorhabditis+elegans.">The Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase Is Required for Development and Muscle Function in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (47), 43557-43563 (2001).</li><li>Stammers, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+sarco(endo)plasmic+reticulum+calcium-ATPases+(SERCA).">The regulation of sarco(endo)plasmic reticulum calcium-ATPases (SERCA).</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93, 1-12 (2015).</li><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Signaling.">Calcium Signaling.</a> Cell. 131, 1047-1058 (2007).</li><li>Hovnanian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serca+pumps+and+human+diseases.">Serca pumps and human diseases.</a> Calcium Signalling and Disease: Molecular Pathology of Calcium. , 337-363 (2007).</li><li>Periasamy, M., Kalyanasundaram, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SERCA+pump+isoforms:+Their+role+in+calcium+transport+and+disease.">SERCA pump isoforms: Their role in calcium transport and disease.</a> Muscle and Nerve. 35 (4), 430-442 (2007).</li><li>Gehlert, S., Bloch, W., Suhr, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-Dependent+Regulations+and+Signaling+in+Skeletal+Muscle:+From+Electro-Mechanical+Coupling+to+Adaptation.">Ca2+-Dependent Regulations and Signaling in Skeletal Muscle: From Electro-Mechanical Coupling to Adaptation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16, 1066-1095 (2015).</li><li>Martin, A. A., Richmond, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sarco(endo)plasmic+reticulum+calcium+ATPase+SCA-1+regulates+the+Caenorhabditis+elegans+nicotinic+acetylcholine+receptor+ACR-16.">The sarco(endo)plasmic reticulum calcium ATPase SCA-1 regulates the Caenorhabditis elegans nicotinic acetylcholine receptor ACR-16.</a> Cell Calcium. 72, 104-115 (2018).</li><li>Wang, Z., Saifee, O., Nonet, M. L., Salkoff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLO-1+Potassium+Channels+Control+Quantal+Content+of+Neurotransmitter+Release+at+the+C.+elegans+Neuromuscular+Junction.">SLO-1 Potassium Channels Control Quantal Content of Neurotransmitter Release at the C. elegans Neuromuscular Junction.</a> Neuron. 32, 867-881 (2001).</li><li>Abraham, L. S., Oh, H. J., Sancar, F., Richmond, J. E., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Alpha-Catulin+Homologue+Controls+Neuromuscular+Function+through+Localization+of+the+Dystrophin+Complex+and+BK+Channels+in+Caenorhabditis+elegans.">An Alpha-Catulin Homologue Controls Neuromuscular Function through Localization of the Dystrophin Complex and BK Channels in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 6 (8), 1-13 (2010).</li><li>Gourgou, E., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+induced+oxidative+stress+affects+ASH+neuronal+function+and+behavior+in+C.+elegans.">Chemically induced oxidative stress affects ASH neuronal function and behavior in C. elegans.</a> Scientific Reports. 6, 1-9 (2016).</li><li>Zahratka, J. A., Williams, P. D. E., Summers, P. J., Komuniecki, R. W., Bamber, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+differentially+modulates+Ca2++transients+and+depolarization+in+a+C.+elegans+nociceptor.">Serotonin differentially modulates Ca2+ transients and depolarization in a C. elegans nociceptor.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1041-1050 (2015).</li><li>Kerr, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+calcium+transients+in+neurons+and+pharyngeal+muscle+of+C.+elegans.">Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans.</a> Neuron. 26 (3), 583-594 (2000).</li><li>Nekimken, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pneumatic+stimulation+of+C.+elegans+mechanoreceptor+neurons+in+a+microfluidic+trap.">Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap.</a> Lab Chip. 17 (6), 1116-1127 (2017).</li><li>Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Neuronal+Calcium+Imaging+in+C.+elegans.">In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), 1-9 (2013).</li><li>Jospin, M., Jacquemond, V., Mariol, M. C., S&#233;galat, L., Allard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+L-type+voltage-dependent+Ca2+channel+EGL-19+controls+body+wall+muscle+function+in+Caenorhabditis+elegans.">The L-type voltage-dependent Ca2+channel EGL-19 controls body wall muscle function in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Cell Biology. 159 (2), 337-347 (2002).</li><li>Wabnig, S., Liewald, J. F., Yu, S., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+All-Optical+Analysis+of+Synaptic+Transmission+and+Synaptic+Vesicle+Recycling+in+Caenorhabditis+elegans.">High-Throughput All-Optical Analysis of Synaptic Transmission and Synaptic Vesicle Recycling in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. , 1-26 (2015).</li></ol>

GECはC.エレガンス神経生物学の強力なツールです。これまでの研究では、カルシウムイメージング技術を用いて、感覚反応や行動反応など、ニューロンと筋肉細胞の両方で多種多様な機能を調べ、様々な刺激方法を用いた。いくつかの研究は、感覚ASHニューロン22、23、または咽頭筋肉24でカルシウム波を誘導するために化学...

本論文では,光遺伝学的神経刺激を用いたC.エレガンス体壁筋の生体内カルシウムイメージングの方法を紹介する.遺伝的にコードされたカルシウム指標(GECI)を青色光で発現した筋肉を組み合わせ、神経脱分極を引き起こし、誘発されたシナプスカルシウム過渡を明確に観察するシステムを提供する。これは電気刺激の使用を避け、後のカルシウムダイナミクスに影響を与える変異体の非侵襲的な分析を可能にする。
GCaMPのような単一蛍光性GECは、そのN末端端部でミオシン軽鎖キナーゼのM13ドメインに融合した単一の蛍光タンパク質分子を使用し、C末端ではカルモジュリン(CaM)を使用する。カルシウム結合時に、カルシウムに対して高い親和性を有するCaMドメインは、蛍光強度1の増加につながる蛍光タンパク質のその後の立体構造変化を誘発する立体構造変化を受ける。GCaMP蛍光は488nmで励起され、473nmの同様の励起波長を有するチャネルロドプシンと組み合わせて使用することは不適当である。したがって、カルシウム測定値とチャネロドプシン刺激を組み合わせるには、GCaMPの緑色蛍光タンパク質を赤色蛍光タンパク質mRuby(RCaMP)に置き換える必要があります。RCaMPを発現した筋肉を用いて、チャネルロドプシンのコリン作動性運動ニューロン発現と組み合わせて、同じ動物内で光遺伝学と機能イメージングを同時に使用するワーム神経筋接合部(NMJ)での研究を可能にする2.
チャネルロドプシンの使用は、C.エレガンスの神経筋接合部を脱分極するための電気刺激の必要性をバイパスし、解剖製剤でのみ達成できるため、この技術を使用しやすく、より正確に行うことができる。特定の組織を標的にする場合。例えば、チャネルロドプシンは、以前にC.エレガンスで特定のニューロンを可逆的に活性化するために使用され、興奮性または阻害性ニューロン3、4の堅牢な活性化のいずれかにつながる。光刺激脱分極の使用はまた、直接電気刺激による神経損傷の問題を回避する。これは、持続および繰り返し刺激を含む多くの異なる刺激プロトコルが、経例カルシウムダイナミクス4に及ぼす影響を調べる機会を提供する。
C.エレガンスの透明な性質は蛍光イメージング機能分析にとって理想的である。しかし、NMJで興奮性アセチルコリンニューロンを刺激する場合、動物は即時の筋肉収縮4で応答することが期待され、離散的なカルシウム変化を視覚化する上でワームの固定化が重要である。伝統的に、薬理学的薬剤は、動物を麻痺させるために使用されてきました。使用されるそのような薬物の1つは、レバミソール、コリン作動性アセチルコリン受容体アゴニスト5、6、7である。レバミソールは興奮性筋受容体のサブタイプの持続的な活性化につながるので、この試薬は筋肉カルシウムダイナミクスの研究には不向きである。レバミソールの作用は、シナプス後脱分極、細胞体カルシウムの上昇、およびシナプス前刺激後の観察を遮断する。麻痺薬の使用を避けるために、我々はC.エレガンスを固定する2つの代替方法を検討した。動物を接着し、次いで体壁の筋肉を露出させるために開いて解剖した動物は、既存のC.エレガンスNMJ電気生理学法8と同様に、またはナノビーズを無傷の動物9を固定するために使用した。両方の手順は、安静時の再現可能な測定を可能にし、容易に定量化可能な筋肉カルシウム過渡を誘発した。
この論文の方法は、C.エレガンスにおける後体壁筋細胞における基サイトソー酸カルシウムレベルおよび過渡性のベースラインを測定するために使用することができる。2つの異なる固定化技術を用いたデータの例が示される。両方の技術は、電気刺激を使用せずに筋肉細胞を脱分極するために光遺伝学を利用します。これらの例は、ワームにおける後質カルシウム処理に影響を与える変異を評価する際にこの方法の実現可能性を示し、2つの固定化アプローチの長所と短所を指摘する。

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>all-trans retinal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2500</td>
			<td>Necessary for excitation of channel rhodopsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber LED</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RCaMP illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino UNO</td>
			<td>Mouser</td>
			<td>782-A000066</td>
			<td>Controls fluorescence illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue LED</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>channelrhodopsin illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BX51WI microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Fixed state compound microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current controlled low noise linear power supply</td>
			<td>Ametek</td>
			<td>Sorenson</td>
			<td>Controls LED intensity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro</td>
			<td>Wavemetrics</td>
			<td>Wavemetrics.com</td>
			<td>Graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>imagej.nih.gov</td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUMFLN 60x water NA 1.4</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Water immersion objective for dissected preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master-8 Stimulator</td>
			<td>A.M.P.I</td>
			<td></td>
			<td>Master timer for image acquisition and LED illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Manager</td>
			<td></td>
			<td>micro-manager.org</td>
			<td>Controls camera acquisition and LED excitiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Spreadsheet software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pco.edge 4.2 CMOS camera</td>
			<td>pco.</td>
			<td>4.2</td>
			<td>High-speed camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlanApo N 60x oil NA 1.4</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Oil immersion objective for nanobead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead microspheres</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>00876-15</td>
			<td>For worm immobilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>solid state switches</td>
			<td>Sensata Technologies</td>
			<td>Crydom CMX100D6</td>
			<td>Controls timing of LED illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 
			(h134R)::yfp,lin-15(+)}; 
			Pmyo3::RCaMP35]</td>
			<td>Richmond Lab</td>
			<td>SY1627</td>
			<td>Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 
			(h134R)::yfp,lin-15(+)}; 
			Pmyo3::RCaMP35]</td>
			<td>Richmond Lab</td>
			<td></td>
			<td>Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 
			(h134R)::yfp,lin-15(+)}; 
			Pmyo3::RCaMP35]</td>
			<td>Gottschalk Lab</td>
			<td>ZX1659</td>
			<td>Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging in c. elegans body wall muscles

モデル生物C.エレガンスは、生体内カルシウムイメージングを行うための優れたシステムを提供します。その透明なボディおよび遺伝的な操作性は遺伝的にコードされたカルシウムセンサーの標的化された発現を可能にする。このプロトコルは、標的細胞におけるカルシウムダイナミクス、特にワームの体壁筋の生体内イメージングに対するこれらのセンサの使用を概説する。シナプス前チャネルロドプシンの共発現を利用することにより、興奮性運動ニューロンからのアセチルコリン放出の刺激は、青色光パルスを用いて誘導され、細胞質カルシウムの筋肉脱分極および再現性の変化をもたらすレベル。2 つのワーム固定化手法は、さまざまなレベルの難易度で説明されています。これらの技術の比較は、両方のアプローチが神経筋接合部の生理学を維持し、カルシウム過渡の再現可能な定量を可能にすることを示しています。光遺伝学と機能性カルシウムイメージングを組み合わせることで、後代カルシウム取り扱いと恒常性の変化を様々な変異型の背景で評価することができます。提示されたデータは、固定化技術の両方を検証し、具体的には、C.エレガンスサルコ(endo)プラスミック網状カルシウムATPaseと体壁筋カルシウム調節におけるカルシウム活性化BKカリウムチャネルの役割を調べます。

この技術は、カルシウムの取り扱いや筋肉の脱分極に影響すると考えられている変異体の変化を評価した。ベースライン蛍光レベルおよび蛍光過渡を可視化し、筋肉内の細胞質カルシウムおよびカルシウム動態を休止して評価した。動物は、少なくとも3日間全トランス形直結で成長し、その後、チャネルロドプシンを活性化することが重要である(図2A...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles at JoVE.com

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

この方法は、光遺伝学と遺伝的にコード化されたカルシウムセンサーを画像ベースラインサイトソリックカルシウムレベルおよびモデル生物C.エレガンスの体壁筋肉における誘発カルシウム過渡の変化に組み合わせる方法を提供する。

C.エレガンス体壁筋肉における生体内カルシウムイメージング

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

このプロトコルは、C.Elegansを動員して体壁筋肉の生体内カルシウムイメージングを行う2つの方法を提供する。この方法は、カルシウムホメオスタシスおよびカルシウム処理に関連する質問、および遺伝的に難解な生物におけるアクセス可能なシナプスに関する質問に答えるのに役立ちます。この技術は、カルシウム恒常性の筋肉を調節するメカニズムをよりよく理解することができ、したがって、カルシウムサイクリングの誤調節を通じて励起収縮結合に影響を与える条件または分子経路を同定する上で重要である可能性がある。これらの方法は、神経生物学、発生生物学、細胞生物学などの研究分野に関する洞察を提供することができます。これらの技術は、様々な細胞タイプおよびC.elegans、他の関連線虫ならびにフィルサファット幼虫を研究するために適応することができる。この方法の視覚的なデモンストレーションは、実験者が解剖技術を理解し、適切に固定化された動物からのカルシウム過渡症を正確に評価できるように非常に重要です。蛍光イメージング用の顕微鏡を設置して開始します。カルシウムレベルの急激な変化を追跡するために、100ヘルツでフルフレームイメージングが可能な科学的CMOSカメラを使用してください。ImageJで実行されているマイクロマネージャーソフトウェアを使用して、カメラの取得とLED蛍光励起を制御します。外部のオープンソースマイクロコントローラボードに接続するオープンソースの電子プラットフォームプラグインを使用して、蛍光励起を制御する外部タイミングパルスを管理します。タイミングロジックを制御するには、製造元の指示に従ってソフトウェア内のマイクロマネージャ取得プロトコルをアクティブにします。2 つの LED を使用して、青色光でチャネル ロドプシンを刺激し、RCaMP の変化を記録します。470ナノメートルのピーク入場波長とバンドパスフィルタを持つam LEDでチャネルロドプシンを活性化し、594ナノメートルのピーク入場波長とバンドパスフィルタを備えたLEDでRCaMPを励起します。両方のLEDを同時に照らし、二色ビームコンバイナを使用して同じ光路に光を伝達します。原稿の方向に従ってTTL信号によって制御されるソリッドステートスイッチでLED照明のタイミングを制御し、現在制御された負荷ノイズリニア電源装置でLED強度を設定し、次にブルーライトシミュレーションプロトコルをシミュレータにプログラムします。この実験では、RCaMP蛍光のみを2秒間撮影した後にブルーライトシミュレーションをオンにし、50ミリ秒間隔の5ミリ秒の青色光パルスを2ミリ秒で使用してチャネルロドプシンを活性化します。解剖準備を使用する場合は、低光でC.elegans解剖を行う。原稿の指示に従って調製されたカルシウム細胞外溶液の1ミリモルで満たされたシリコーンコーティングカバースリップベースで解剖皿に動物を置きます。ワームの後側に沿って青い着色と液体局所皮膚接着剤を使用して動物を接着します。そしてガラスの針を使用して接着剤およびワームインターフェイスに沿って横のキューティクルの切開を行う。口のピペットを使用してワームキャビティから内臓を取り除き、動物のキューティクルフラップを接着して、画像撮影のために腹側内側の体壁の筋肉を露出させます。ナノビーズ調製物を使用する場合は、蒸留水を使用して5%アグラ溶液を最終体積100ミリリットルにする。パスツールピペットを使用して、溶融アグラ溶液をガラススライドに一滴置き、すぐに優しく圧力をかけて2番目のガラススライドを上に置き、アグラのパッドを作成します。上部スライドを取り外し、パッドの中央に約4マイクロリットルのポリスチレンナノビーズを取り外します。低照度でナノビーズ溶液に4〜6個のC.elegansを加え、動物が互いの上に横たらないようにし、慎重にカバースリップを上に置きます。イメージを作成する準備ができたら、準備したスライドまたは解剖皿を顕微鏡に置き、10倍の倍率と明るいフィールド照明を使用してワームを見つけて集中します。RCaMP蛍光励起の60倍の倍率に切り替えて、外陰部の前部および正しい声面にある心室の内側の身体壁の筋肉を識別する。次に、トグルを引き出してデータ取得ソフトウェア内のライブをクリックして、接眼眼機からカメラへの画像経路を変更します。データ取得ソフトウェアの ORI ボタンをクリックし、フォーカスしている筋肉の周りにボックスを作成します。刺激装置で、以前にプログラムされた青色光刺激経路をオンにし、イメージングソフトウェアの取得をクリックして画像をキャプチャします。C.elegansが全トランスレチナルで成長し、正常にレチナルを組み込み、チャネルロドプシンを活性化すると、カルシウム一過性を誘発することができる。動物が全トランスのレティナルにさらされない場合、筋肉カルシウム一過性は引き起こされません。このプロトコルは、sca-1遺伝子によってコードされるサルコプラスムレチクルムカルシウムポンプに影響を与える機能sca-1変異体の喪失を調査するために使用された。しかし、RCaMP蛍光のベースラインレベルの増加する解剖製剤は、対照と比較して突然変異体において観察され、突然変異が安静細胞質カルシウムの上昇レベルを必要とすることを示唆した。sca-1変異体のピークカルシウムレベルは、対照と比較して有意に減少した。しかし、上昇したピークタイムや半分の減衰時間には変化は見られなかった。重要なことに、同様の結果は、技術的に挑戦的でないナノビーズ調製物を使用して観察することができる。カルシウム活性化大きなカリウムチャネルを破壊する機能スロ突然変異体の喪失は、C.elegansにおけるカルシウム処理に間接的に影響を与える突然変異体を調査するために評価された。RCaMPのベースラインレベルを測定した場合、変異体はコントロールと比較して増加した蛍光を示した。カルシウム一過性の運動学を評価する際には、ピークカルシウムレベルに変化は見られなかった。しかし、slo-1(eg142)変異体はピーク時まで有意に上昇を示した。手順を完了するときに覚えておかねばならない最も重要なステップは、全トランスの残用で実験動物を準備することです。このステップがなければ、チャネルロドプシンは不活性になり、光誘発カルシウム過渡性が引き起こされるのを防ぎます。この手順に従って、カルシウム恒常性の変化が観察された機能への影響を評価するために、電気生理学および行動解析を行うことができる。ここで概説する固定化法を用いて、カルシウムダイナミクスのさらなる探査への道を開き、はるかに挑戦的でないビーズ固定化技術を使用して、光遺伝学的神経刺激および筋肉カルシウム過渡症の捕獲に応じて同等の結果を観察できることを実証する。

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

のpH依存性活性の検出<em&gt;エシェリヒア・コリ</em&gt;シャペロンHdeB<em&gt;インビトロ</em&gt;と<em&gt;インビボ</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Combining Raman Imaging and Multivariate Analysis to Visualize Lignin, Cellulose, and Hemicellulose in the Plant Cell Wall

ラマンイメージングと多変量解析を組み合わせて、植物細胞壁のリグニン、セルロース、およびヘミセルロースを視覚化する

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The ...

Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics

鶏の羽根や化粧品への応用からケラチンを加水分解物の準備

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

マンナン ペースを用いた植物細胞壁多糖の構造解析

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

タンパク質結晶の成長を使用して異なる寸法自動結晶化その場の動的光散乱と相まって

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

植物の鉄含有量を測定するための比色定量法

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

多量ホモ測定器と無料、フリー、オープン ソースの明るさ解析ソフトウェアを使用しての体外校正無料定量化

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

ミツバチから脳ホモジネート ホスホリパーゼ C 活性の検出

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

イン・ビボヒドロキシルラジカルプロテインフットプリントにおけるカエノハブディティス・エレガンスにおけるタンパク質相互作用の研究

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

蛍光生涯イメージングを用いたエージングC.エレガンスにおけるアミロイド構造の特徴

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...