Name: in vivo calcium imaging in c. elegans body wall muscles
Uploaded: 2019-10-20T12:30:00
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저자는 ZX1659에 대한 박사 알렉산더 고트샬크, RCaMP 및 웜 균주를 포함하는 channelrhodopsin, 슬로-1 (eg142) 웜 균주에 대한 김홍균 박사, 그리고 sca-1 (tm5339) 웜 균주에 대한 국가 생물 자원 프로젝트에 감사드립니다.

1. 현미경 설치
<ol><li>형광 기능이있는 화합물 현미경을 사용합니다. 이 연구를 위해, 데이터는 여기를 위한 LED가 장착된 직립 현미경(재료표)에수집되었습니다.</li>
	<li>신체 벽 근육의 형광 변화를 적절하게 시각화하려면 높은 배율 목표를 사용하십시오.<ol>
<li>해부 제제의 경우, 60x NA 1.0 수분 침지목표(재료 표)를사용하십시오.</li>
		<li>나노 비드를 사용하는 제제의 경?...

<ol>
	<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca2++probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics.">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Activation+of+Channelrhodopsin-2+in+Excitable+Cells+of+Caenorhabditis+elegans+Triggers+Rapid+Behavioral+Responses.">Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses.</a> Current Biology. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li><li>Liewald, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+analysis+of+synaptic+function.">Optogenetic analysis of synaptic function.</a> Nature Methods. 5 (10), 895-902 (2008).</li><li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans.">Laser Microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biology. 107, 177-206 (2012).</li><li>Lewis, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+Receptor+Mutants+of+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans.">Cholinergic Receptor Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).</li><li>Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+levamisole+resistance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).</li><li>Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+GABA+and+two+acetylcholine+receptors+function+at+the+C.+elegans+neuromuscular+junction.">One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction.</a> Nature Neuroscience. 9, 791-798 (1999).</li><li>Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Imaging+of+Caenorhabditis+elegans+Using+Nanoparticle-Mediated+Immobilization.">Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization.</a> PLoS ONE. 8 (1), 1-6 (2013).</li><li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+control+of+microscopes+using+umanager.">Computer control of microscopes using umanager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. (Suppl 92), 1-17 (2010).</li><li>Richmond, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+and+Recording+from+The+C.+Elegans+Neuromuscular+Junction.">Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction.</a> Journal of Visualized Experiments. (24), 1-4 (2009).</li><li>Hoon Cho, J., Bandyopadhyay, J., Lee, J., Park, C. S., Ahnn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+isoforms+of+sarco/endoplasmic+reticulum+calcium+ATPase+(SERCA)+are+essential+in+Caenorhabditis+elegans.">Two isoforms of sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) are essential in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 261, 211-219 (2000).</li><li>Zwaal, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sarco-Endoplasmic+Reticulum+Ca2++ATPase+Is+Required+for+Development+and+Muscle+Function+in+Caenorhabditis+elegans.">The Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase Is Required for Development and Muscle Function in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (47), 43557-43563 (2001).</li><li>Stammers, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+sarco(endo)plasmic+reticulum+calcium-ATPases+(SERCA).">The regulation of sarco(endo)plasmic reticulum calcium-ATPases (SERCA).</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93, 1-12 (2015).</li><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Signaling.">Calcium Signaling.</a> Cell. 131, 1047-1058 (2007).</li><li>Hovnanian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serca+pumps+and+human+diseases.">Serca pumps and human diseases.</a> Calcium Signalling and Disease: Molecular Pathology of Calcium. , 337-363 (2007).</li><li>Periasamy, M., Kalyanasundaram, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SERCA+pump+isoforms:+Their+role+in+calcium+transport+and+disease.">SERCA pump isoforms: Their role in calcium transport and disease.</a> Muscle and Nerve. 35 (4), 430-442 (2007).</li><li>Gehlert, S., Bloch, W., Suhr, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-Dependent+Regulations+and+Signaling+in+Skeletal+Muscle:+From+Electro-Mechanical+Coupling+to+Adaptation.">Ca2+-Dependent Regulations and Signaling in Skeletal Muscle: From Electro-Mechanical Coupling to Adaptation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16, 1066-1095 (2015).</li><li>Martin, A. A., Richmond, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sarco(endo)plasmic+reticulum+calcium+ATPase+SCA-1+regulates+the+Caenorhabditis+elegans+nicotinic+acetylcholine+receptor+ACR-16.">The sarco(endo)plasmic reticulum calcium ATPase SCA-1 regulates the Caenorhabditis elegans nicotinic acetylcholine receptor ACR-16.</a> Cell Calcium. 72, 104-115 (2018).</li><li>Wang, Z., Saifee, O., Nonet, M. L., Salkoff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLO-1+Potassium+Channels+Control+Quantal+Content+of+Neurotransmitter+Release+at+the+C.+elegans+Neuromuscular+Junction.">SLO-1 Potassium Channels Control Quantal Content of Neurotransmitter Release at the C. elegans Neuromuscular Junction.</a> Neuron. 32, 867-881 (2001).</li><li>Abraham, L. S., Oh, H. J., Sancar, F., Richmond, J. E., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Alpha-Catulin+Homologue+Controls+Neuromuscular+Function+through+Localization+of+the+Dystrophin+Complex+and+BK+Channels+in+Caenorhabditis+elegans.">An Alpha-Catulin Homologue Controls Neuromuscular Function through Localization of the Dystrophin Complex and BK Channels in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 6 (8), 1-13 (2010).</li><li>Gourgou, E., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+induced+oxidative+stress+affects+ASH+neuronal+function+and+behavior+in+C.+elegans.">Chemically induced oxidative stress affects ASH neuronal function and behavior in C. elegans.</a> Scientific Reports. 6, 1-9 (2016).</li><li>Zahratka, J. A., Williams, P. D. E., Summers, P. J., Komuniecki, R. W., Bamber, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+differentially+modulates+Ca2++transients+and+depolarization+in+a+C.+elegans+nociceptor.">Serotonin differentially modulates Ca2+ transients and depolarization in a C. elegans nociceptor.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1041-1050 (2015).</li><li>Kerr, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+calcium+transients+in+neurons+and+pharyngeal+muscle+of+C.+elegans.">Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans.</a> Neuron. 26 (3), 583-594 (2000).</li><li>Nekimken, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pneumatic+stimulation+of+C.+elegans+mechanoreceptor+neurons+in+a+microfluidic+trap.">Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap.</a> Lab Chip. 17 (6), 1116-1127 (2017).</li><li>Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Neuronal+Calcium+Imaging+in+C.+elegans.">In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), 1-9 (2013).</li><li>Jospin, M., Jacquemond, V., Mariol, M. C., S&#233;galat, L., Allard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+L-type+voltage-dependent+Ca2+channel+EGL-19+controls+body+wall+muscle+function+in+Caenorhabditis+elegans.">The L-type voltage-dependent Ca2+channel EGL-19 controls body wall muscle function in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Cell Biology. 159 (2), 337-347 (2002).</li><li>Wabnig, S., Liewald, J. F., Yu, S., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+All-Optical+Analysis+of+Synaptic+Transmission+and+Synaptic+Vesicle+Recycling+in+Caenorhabditis+elegans.">High-Throughput All-Optical Analysis of Synaptic Transmission and Synaptic Vesicle Recycling in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. , 1-26 (2015).</li></ol>

GEC는 C. elegans 신경생물학에 있는 강력한 공구입니다. 이전 연구는 다양한 자극 방법으로 감각 및 행동 반응을 포함한 뉴런과 근육 세포 모두에서 다양한 기능을 검사하기 위해 칼슘 이미징 기술을 활용했습니다. 일부 연구는 감각 ASH뉴런22,23에서 칼슘 과도를 유발하거나 인두 근육에서 칼슘 파를 유도하기 위해 화학 자극을 사용했다<sup class="xref"...

이 논문은 광유전적 신경 자극을 사용하여 C. elegans 신체 벽 근육의 생체 내 칼슘 이미징 방법을 제시합니다. 유전적으로 발현된 근육과 청색광이 발동된 신경탈분극을 결합하고 자극된 후발성 칼슘 과도를 명확하게 관찰하는 시스템을 제공한다. 이것은 전기 자극의 사용을 피하고, 후나해 칼슘 역학에 영향을 미치는 돌연변이의 비침습적 분석을 허용합니다.
GCaMP와 같은 단일 형광포골 GECIs는 C-말단에서 의 N 말단 및 칼모둘린(CaM)에서 미오신 경변 키나아제의 M13 도메인에 융합된 단일 형광 단백질 분자를 사용합니다. 칼슘 결합시, 칼슘에 대한 높은 친화력을 가지는 CaM 도메인은 형광 강도 의 증가로 이어지는 형광 단백질의 후속 형태 변화를 유도하는 형태 변화를 겪습니다1. GCaMP 형광은 488 nm에서 흥분하여 473 nm의 유사한 여기 파장을 가진 채널로도셉신과 함께 사용하는 것이 부적절합니다. 따라서, 채널로도신 자극과 칼슘 측정을 결합하기 위해서는 GCaMP의 녹색 형광 단백질을 적색 형광 단백질, mRuby(RCaMP)로 대체할 필요가 있다. 채널로도프신의 해 운동 뉴런 발현과 함께, 표현된 근육 RCaMP를 사용하여, 동일한 동물 내의 광유전학 및 기능적 이미징을 동시에 사용하는 웜 신경 근육 접합부(NMJ)에서의 연구를 허용합니다. 2.
channelrhodopsin의 사용은 C. elegans의신경 근육 접합을 탈분극하기 위하여 전기 자극을 위한 필요를 우회합니다, 따라서 이 기술을 채택하기 쉽고 더 정밀하게 만드는 해부한 준비에서만 달성될 수 있습니다 특정 조직을 대상으로 할 때. 예를 들어, channelrhodopsin는 이전에 C. 예쁜꼬마선충에서 특정 뉴런을 가역적으로 활성화시키는 데 사용되어 왔으며, 흥분제 또는 억제 뉴런의 강력한 활성화로 이어지며3,4. 빛 자극 된 탈분극의 사용은 또한 직접적인 전기 자극으로 인한 신경 손상의 문제를 우회합니다. 이것은 후성 칼슘 역학에 지속적이고 반복적인 자극을 포함하여 많은 다른 자극 프로토콜의 효력을 검토할 기회를 제공합니다4.
C. elegans의 투명한 성질은 형광 화상 진찰 기능 분석을 위해 이상적이습니다. 그러나, NMJ에서 흥분성의 아세틸 콜린 뉴런을 자극 할 때, 동물은 즉각적인 근육 수축으로 반응 할 것으로 예상된다4,이산 칼슘 변화를 시각화에 중요한 벌레의 고정을 만들기. 전통적으로, 약리학 에이전트는 동물을 마비하는 데 사용되어 왔다. 이러한 약물 중 하나는 레바미솔, 해 아세틸 콜린 수용체 작용제5,6,7. 레바미솔은 흥분성 근육 수용체의 아류형의 지속적인 활성화를 유도하기 때문에,이 시약은 근육 칼슘 역학의 연구에 적합하지 않습니다. levamisole의 작용은 세포질 칼슘을 상승시키고, 시냅스 전 자극 에 따른 관찰을 폐색, 후발성 탈분극을 유도합니다. 마비 약물의 사용을 피하기 위해, 우리는 C. 예쁜 꼬마를고정하는 두 가지 대체 방법을 검사했습니다. 동물은 접착한 다음 해부하여 체벽 근육을 노출시켰으며, 기존의 C. elegans NMJ 전기생리학 방법8,또는 나노비드는 손상되지 않은 동물을 고정시키기 위해 사용하였다9. 두 절차 모두 쉽게 정량화 할 수 있었다 휴식과 연상 근육 칼슘 과도의 재현 측정을 허용했다.
이 논문의 방법은 C. elegans의후층 성 신체 벽 근육 세포에서 기준선 세포질 칼슘 수준 과도를 측정하는 데 사용할 수 있습니다. 두 가지 서로 다른 고정 기술을 사용하는 데이터의 예가 제공됩니다. 두 기술은 전기 자극을 사용하지 않고 근육 세포를 탈분극하기 위해 광유전학을 활용합니다. 이 예는 벌레에 있는 후발성 칼슘 취급에 영향을 미치는 돌연변이를 평가하고 2개의 고정화 접근의 장단점을 지적하는 이 방법의 타당성을 보여줍니다.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>all-trans retinal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2500</td>
			<td>Necessary for excitation of channel rhodopsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber LED</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RCaMP illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino UNO</td>
			<td>Mouser</td>
			<td>782-A000066</td>
			<td>Controls fluorescence illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue LED</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>channelrhodopsin illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BX51WI microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Fixed state compound microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current controlled low noise linear power supply</td>
			<td>Ametek</td>
			<td>Sorenson</td>
			<td>Controls LED intensity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro</td>
			<td>Wavemetrics</td>
			<td>Wavemetrics.com</td>
			<td>Graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>imagej.nih.gov</td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUMFLN 60x water NA 1.4</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Water immersion objective for dissected preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master-8 Stimulator</td>
			<td>A.M.P.I</td>
			<td></td>
			<td>Master timer for image acquisition and LED illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Manager</td>
			<td></td>
			<td>micro-manager.org</td>
			<td>Controls camera acquisition and LED excitiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Spreadsheet software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pco.edge 4.2 CMOS camera</td>
			<td>pco.</td>
			<td>4.2</td>
			<td>High-speed camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlanApo N 60x oil NA 1.4</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Oil immersion objective for nanobead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead microspheres</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>00876-15</td>
			<td>For worm immobilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>solid state switches</td>
			<td>Sensata Technologies</td>
			<td>Crydom CMX100D6</td>
			<td>Controls timing of LED illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 
			(h134R)::yfp,lin-15(+)}; 
			Pmyo3::RCaMP35]</td>
			<td>Richmond Lab</td>
			<td>SY1627</td>
			<td>Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 
			(h134R)::yfp,lin-15(+)}; 
			Pmyo3::RCaMP35]</td>
			<td>Richmond Lab</td>
			<td></td>
			<td>Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 
			(h134R)::yfp,lin-15(+)}; 
			Pmyo3::RCaMP35]</td>
			<td>Gottschalk Lab</td>
			<td>ZX1659</td>
			<td>Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging in c. elegans body wall muscles

모델 유기체 C. 예쁜꼬마선충은 생체 내 칼슘 이미징을 수행하는 우수한 시스템을 제공한다. 그것의 투명한 바디 및 유전 적 변형성은 유전으로 인코딩된 칼슘 센서의 표적으로 한 표현을 허용합니다. 이 프로토콜은 표적 세포, 특히 벌레의 신체 벽 근육에서 칼슘 역학의 생체 내 이미징을 위해 이러한 센서의 사용을 설명합니다. 시냅스 전 채널로도셉신의 공동 발현을 활용함으로써, 흥분성 운동 뉴런으로부터 아세틸콜린 방출의 자극은 청색광 펄스를 사용하여 유도될 수 있으며, 그 결과 근육 탈분극및 세포질 칼슘의 재현 가능한 변화 수준. 두 가지 웜 고정 기술은 다양한 난이도에 대해 논의합니다. 이러한 기술의 비교는 두 접근법모두 신경 근육 접합의 생리학을 보존하고 칼슘 과도의 재현 가능한 정량화를 허용한다는 것을 보여줍니다. 광유전학과 기능성 칼슘 이미징을 페어링함으로써, 후성 칼슘 취급 및 항상성의 변화는 다양한 돌연변이 배경에서 평가될 수 있다. 제시된 데이터는 고정 화 기술을 모두 검증하고 특히 C. elegans 사르코 (endo)플라스성 망상 칼슘 ATPase 및 신체 벽 근육 칼슘 조절에서 칼슘 활성화 BK 칼륨 채널의 역할을 검사합니다.

이 기술은 칼슘 취급 또는 근육 탈분극에 영향을 미칠 것으로 생각되는 돌연변이의 변화를 평가했습니다. 기준선 형광 수준 및 형광 과도를 가시화하고 근육 내의 세포질 칼슘 및 칼슘 역학을 쉬게 하였다. 동물들이 망막의 성공적인 혼입을 보장하기 위해 적어도 3일 동안 모든 트랜스 망막에서 성장하여, 이어서 채널로도종신을 활성화시키는 것이중요하?...

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In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

이 방법은 모델 유기체 C. elegans의신체 벽 근육에서 발동 된 칼슘 과도 의 변화와 이미지 기준선 세포질 칼슘 수준에 광유전학 및 유전적으로 코딩 된 칼슘 센서를 결합하는 방법을 제공합니다.

C. 예쁜꼬마선충의 생체내 칼슘 이미징

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

이 프로토콜은 C.Elegans를 동원하여 신체 벽 근육의 생체 내 칼슘 이미징을 수행하는 두 가지 방법을 제공합니다. 이 방법은 칼슘 항상성 및 칼슘 취급과 관련된 질문에 대답하는 데 도움이 될 수 있으며 유전적 인 유분 성 유기체에서 접근 할 수있는 시냅스입니다. 이 기술은 근육 칼슘 항상성을 조절하는 메커니즘의 더 나은 이해를 제공 할 수 있으며, 따라서 칼슘 사이클링의 오조절을 통해 흥분 수축 커플링에 영향을 미치는 조건이나 분자 경로를 식별하는 데 중요 할 수 있습니다.이러한 방법은 신경생물학, 발달 생물학 및 세포 생물학을 포함하되 이에 국한되지 않는 연구 분야에 대한 통찰력을 제공할 수 있습니다. 이 기술은 다양한 세포 모형 및 C.elegans, 그밖 관련 선충 뿐만 아니라 오물 지방 애벌레를 공부하기 위하여 적응될 수 있었습니다. 이 방법의 시각적 데모는 실험자가 해부 기술을 이해하고 제대로 고정 된 동물로부터 칼슘 과도를 정확하게 평가 할 수 있도록 중요합니다.형광 화상 진찰을 위한 현미경을 설치하여 시작합니다. 칼슘 수준의 급격한 변화를 추적하기 위해 100 헤르츠에서 풀 프레임 이미징이 가능한 과학 CMOS 카메라를 사용하십시오. ImageJ에서 실행되는 마이크로 매니저 소프트웨어로 카메라 수집 및 LED 형광 내분 등을 제어합니다.외부 오픈소스 마이크로 컨트롤러 보드에 연결되는 오픈소스 전자 플랫폼 플러그인을 사용하여 형광 내문을 제어하는 외부 타이밍 펄스를 관리합니다. 타이밍 논리를 제어하려면 제조업체 지침에 따라 소프트웨어의 마이크로관리자 획득 프로토콜을 활성화합니다. 두 개의 LED를 사용하여 청색광으로 채널 진도신을 자극하고 RCaMP 변경 사항을 기록합니다.470나노미터의 피크 입장 파장과 밴드패스 필터로 am LED로 채널 진도신을 활성화하고, 594나노미터의 피크 입장 파장과 밴드패스 필터로 LED로 RCaMP를 자극한다. LED를 모두 공동 조명하고 디크로이크 빔 결합기를 사용하여 동일한 광학 경로로 빛을 전달합니다. 원고 방향에 따라 TTL 신호에 의해 제어되는 솔리드 스테이트 스위치로 LED 조명의 타이밍을 제어하고 전류 제어 부하 노이즈 선형 전원 공급 장치로 LED 강도를 설정한 다음 블루라이트 시뮬레이션 프로토콜을 시뮬레이터로 프로그래밍합니다.이 실험에서는 RCaMP 형광만을 캡처한 후 2초 후에 청색광 시뮬레이션을 켜고 50밀리초 간격으로 5밀리초 의 블루 라이트 펄스를 사용하여 채널 로도신을 활성화합니다. 해부 준비를 사용하는 경우 저조도에서 C.elegans 해부를 수행합니다. 원고 의 지시에 따라 준비 된 칼슘 세포 외 용액의 1 밀리몰로 채워진 실리콘 코팅 커버 슬립 베이스와 해부 접시에 동물을 배치합니다.벌레의 등쪽을 따라 파란색 색칠과 액체 국소 피부 접착제를 사용하여 동물을 접착제. 그리고 유리 바늘을 사용하여 접착제와 웜 인터페이스를 따라 측면 큐티클 절개를합니다. 입 파이펫을 사용하여 웜 캐비티에서 내부 내장을 제거한 다음 동물의 큐티클 플랩을 아래로 접착제하여 이미징을 위해 복부 내측 내측 신체 벽 근육을 노출시하십시오.나노 비드 제제를 사용하는 경우 증류수를 사용하여 100 밀리리터의 최종 부피에 용융 된 5 % 아그라 용액을 만듭니다. 파스퇴르 파이펫을 사용하여 용융 아그라 용액한 한 방울을 유리 슬라이드에 놓고 부드럽게 압력을 사용하여 두 번째 유리 슬라이드를 상단에 놓고 아그라의 패드를 만듭니다. 상단 슬라이드와 패드 의 중간에 폴리스티렌 나노 구슬의 약 4 마이크로 리터에서 제거합니다.저조도에서 나노 비즈 솔루션에 4~6개의 C.elegans를 추가하여 동물이 서로 위에 놓이지 않도록 하고 조심스럽게 표지슬립을 위에 놓습니다. 이미지 할 준비가되면, 현미경에 준비 된 슬라이드 또는 해부 접시를 배치하고 찾아 10 배율과 희미한 밝은 필드 조명을 사용하여 벌레에 초점을 맞춥니다. RCaMP 형광 내분 내분에서 60배 배율로 전환하여 외음부와 올바른 보컬 평면에 전방인 벤트럼 내측 체벽 근육을 식별합니다.그런 다음 토글을 꺼내 데이터 수집 소프트웨어 내에서 라이브를 클릭하여 접피스에서 카메라로 이미지 경로를 변경합니다. 데이터 수집 소프트웨어의 ORI 버튼을 클릭하고 초점을 맞추고 있는 근육 주위에 상자를 만듭니다. 자극기에서 이전에 프로그래밍된 청색 광 자극 경로를 켜고 이미징 소프트웨어 획득을 클릭하여 이미지를 캡처합니다.C.elegans가 모든 트랜스 망막에서 재배되면 망막을 성공적으로 통합하고 채널 rhodopsin을 활성화하면 칼슘 과도를 불러 불러 올릴 수 있습니다. 동물이 모든 트랜스 망막에 노출되지 않으면 근육 칼슘 과도가 트리거되지 않습니다. 이 프로토콜은 sca-1 유전자에 의해 인코딩된 석관 망상 칼슘 펌프에 영향을 미치는 기능 sca-1 돌연변이의 손실을 조사하는 데 사용되었다.그러나, RCaMP 형광의 기준선 수준에서 해부 준비 증가는 대조군과 비교하여 돌연변이에서 관찰되었으며, 이는 돌연변이가 휴식 세포질 칼슘의 높은 수준을 필요로 한다는 것을 시사한다. 대조군과 비교하여 sca-1 돌연변이체에서 피크 칼슘 수치가 현저하게 감소했습니다. 그러나 상승된 피크 시간 이나 반 부패 시간에는 변화가 없었습니다.중요한 것은, 기술적으로 덜 도전적인 나노 비드 제제를 사용하여 유사한 결과를 관찰할 수 있다. 기능 슬로 돌연변이의 손실, 이는 칼슘 활성화 큰 칼륨 채널을 방해 C.elegans에서 칼슘 취급에 간접적으로 영향을 미치는 돌연변이를 조사하기 위해 평가되었다. RCaMP의 기준선 수준을 측정했을 때 돌연변이체는 대조군에 비해 형광이 증가하여 표시되었다.칼슘의 운동학을 평가할 때, 칼슘 수치가 급격하게 변하지 않았다. 그러나 슬로-1(eg142) 돌연변이체는 피크 타임으로 크게 증가했습니다. 절차를 완료 할 때 기억해야 할 가장 중요한 단계는 모든 트랜스 망막에서 실험 동물을 준비하는 것입니다.이 단계없이 채널 rhodopsin은 비활성 될 것입니다, 발동되는 빛 유도 칼슘 과도를 방지. 이 절차에 따라, 전기 생리학 및 행동 분석은 칼슘 항상성에 있는 어떤 관찰된 변경의 기능적인 충격을 평가하기 위하여 행해질 수 있습니다. 여기에 설명된 고정 방법을 사용하여 칼슘 역학을 추가로 탐사할 수 있는 길을 열어주며, 훨씬 덜 도전적인 비드 고정 기술을 사용하여 광유전학 신경 자극및 근육 칼슘 과도의 캡처에 대응하여 유사한 결과를 관찰할 수 있음을 보여줍니다.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

의 pH에 ​​의존 활동의 검출<em&gt; 대장균</em&gt; 보호자 HdeB<em&gt; 체외</em&gt; 및<em&gt; 생체</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

연구

생화학

Combining Raman Imaging and Multivariate Analysis to Visualize Lignin, Cellulose, and Hemicellulose in the Plant Cell Wall

라만 이미징과 다변량 분석을 결합하여 식물 세포벽에서 리그닌, 셀룰로오스 및 헤미 셀룰로스를 시각화합니다.

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The ...

Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics

각 질의 닭 깃털 및 화장품에의 응용에서의 준비

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

속도 사용 하 여 식물에 Mannan 세포 벽 다 당 류 구조 특성

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

사용 하 여 다른 크기와 성장 단백질 결정 자동화 현장에서 동적 산란과 함께 결정 화

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

식물에 철 분 함량을 측정 하는 색도계 방법

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

생체 외에서 교정 무료 단백질 호모-oligomerization 상업 계측 및 무료, 오픈 소스 밝기 분석 소프트웨어를 사용 하 여의 정량화

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

꿀벌에서 두뇌 Homogenate에서 Phospholipase C 활동의 탐지

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

체노하브디염 예쁜꼬마선충의 단백질 상호작용 연구를 위한 생체내 하이드록실 라디칼 단백질 발자국

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

형광 일생 화상 진찰을 사용하여 노화 C. Elegans에 있는 아밀로이드 구조물의 특성화

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...