Name: in vivo calcium imaging in c. elegans body wall muscles
Uploaded: 2019-10-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles at JoVE.com

Forfatterne takker Dr. Alexander Gottschalk for ZX1659, den RCaMP og channelrhodopsin inneholder ormen belastning, Dr. Hongkyun Kim for slo-1 (eg142) ormen belastning, og National Bioresource Project for SCA-1 (tm5339) ormen belastning.

1. oppsett av mikroskop
<ol><li>Bruk et sammensatt mikroskop med fluorescens egenskaper. For denne studien ble data samlet inn på et oppreist mikroskop (tabell av materialer) utstyrt med lysdioder for eksitasjon.</li>
	<li>For å riktig visualisere fluorescens endringer i kroppen vegg muskler, bruk en høy forstørrelse mål.<ol>
<li>For dissekert preparater, bruk en 60x NA 1,0-objektiv for nedsenkingi vann (tabell med materialer).</li>
		<li>For preparater som bruker nanobeads, bruk ...

<ol>
	<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca2++probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics.">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Activation+of+Channelrhodopsin-2+in+Excitable+Cells+of+Caenorhabditis+elegans+Triggers+Rapid+Behavioral+Responses.">Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses.</a> Current Biology. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li><li>Liewald, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+analysis+of+synaptic+function.">Optogenetic analysis of synaptic function.</a> Nature Methods. 5 (10), 895-902 (2008).</li><li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans.">Laser Microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biology. 107, 177-206 (2012).</li><li>Lewis, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+Receptor+Mutants+of+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans.">Cholinergic Receptor Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).</li><li>Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+levamisole+resistance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).</li><li>Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+GABA+and+two+acetylcholine+receptors+function+at+the+C.+elegans+neuromuscular+junction.">One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction.</a> Nature Neuroscience. 9, 791-798 (1999).</li><li>Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Imaging+of+Caenorhabditis+elegans+Using+Nanoparticle-Mediated+Immobilization.">Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization.</a> PLoS ONE. 8 (1), 1-6 (2013).</li><li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+control+of+microscopes+using+umanager.">Computer control of microscopes using umanager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. (Suppl 92), 1-17 (2010).</li><li>Richmond, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+and+Recording+from+The+C.+Elegans+Neuromuscular+Junction.">Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction.</a> Journal of Visualized Experiments. (24), 1-4 (2009).</li><li>Hoon Cho, J., Bandyopadhyay, J., Lee, J., Park, C. S., Ahnn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+isoforms+of+sarco/endoplasmic+reticulum+calcium+ATPase+(SERCA)+are+essential+in+Caenorhabditis+elegans.">Two isoforms of sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) are essential in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 261, 211-219 (2000).</li><li>Zwaal, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sarco-Endoplasmic+Reticulum+Ca2++ATPase+Is+Required+for+Development+and+Muscle+Function+in+Caenorhabditis+elegans.">The Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase Is Required for Development and Muscle Function in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (47), 43557-43563 (2001).</li><li>Stammers, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+sarco(endo)plasmic+reticulum+calcium-ATPases+(SERCA).">The regulation of sarco(endo)plasmic reticulum calcium-ATPases (SERCA).</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93, 1-12 (2015).</li><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Signaling.">Calcium Signaling.</a> Cell. 131, 1047-1058 (2007).</li><li>Hovnanian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serca+pumps+and+human+diseases.">Serca pumps and human diseases.</a> Calcium Signalling and Disease: Molecular Pathology of Calcium. , 337-363 (2007).</li><li>Periasamy, M., Kalyanasundaram, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SERCA+pump+isoforms:+Their+role+in+calcium+transport+and+disease.">SERCA pump isoforms: Their role in calcium transport and disease.</a> Muscle and Nerve. 35 (4), 430-442 (2007).</li><li>Gehlert, S., Bloch, W., Suhr, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-Dependent+Regulations+and+Signaling+in+Skeletal+Muscle:+From+Electro-Mechanical+Coupling+to+Adaptation.">Ca2+-Dependent Regulations and Signaling in Skeletal Muscle: From Electro-Mechanical Coupling to Adaptation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16, 1066-1095 (2015).</li><li>Martin, A. A., Richmond, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sarco(endo)plasmic+reticulum+calcium+ATPase+SCA-1+regulates+the+Caenorhabditis+elegans+nicotinic+acetylcholine+receptor+ACR-16.">The sarco(endo)plasmic reticulum calcium ATPase SCA-1 regulates the Caenorhabditis elegans nicotinic acetylcholine receptor ACR-16.</a> Cell Calcium. 72, 104-115 (2018).</li><li>Wang, Z., Saifee, O., Nonet, M. L., Salkoff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLO-1+Potassium+Channels+Control+Quantal+Content+of+Neurotransmitter+Release+at+the+C.+elegans+Neuromuscular+Junction.">SLO-1 Potassium Channels Control Quantal Content of Neurotransmitter Release at the C. elegans Neuromuscular Junction.</a> Neuron. 32, 867-881 (2001).</li><li>Abraham, L. S., Oh, H. J., Sancar, F., Richmond, J. E., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Alpha-Catulin+Homologue+Controls+Neuromuscular+Function+through+Localization+of+the+Dystrophin+Complex+and+BK+Channels+in+Caenorhabditis+elegans.">An Alpha-Catulin Homologue Controls Neuromuscular Function through Localization of the Dystrophin Complex and BK Channels in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 6 (8), 1-13 (2010).</li><li>Gourgou, E., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+induced+oxidative+stress+affects+ASH+neuronal+function+and+behavior+in+C.+elegans.">Chemically induced oxidative stress affects ASH neuronal function and behavior in C. elegans.</a> Scientific Reports. 6, 1-9 (2016).</li><li>Zahratka, J. A., Williams, P. D. E., Summers, P. J., Komuniecki, R. W., Bamber, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+differentially+modulates+Ca2++transients+and+depolarization+in+a+C.+elegans+nociceptor.">Serotonin differentially modulates Ca2+ transients and depolarization in a C. elegans nociceptor.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1041-1050 (2015).</li><li>Kerr, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+calcium+transients+in+neurons+and+pharyngeal+muscle+of+C.+elegans.">Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans.</a> Neuron. 26 (3), 583-594 (2000).</li><li>Nekimken, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pneumatic+stimulation+of+C.+elegans+mechanoreceptor+neurons+in+a+microfluidic+trap.">Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap.</a> Lab Chip. 17 (6), 1116-1127 (2017).</li><li>Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Neuronal+Calcium+Imaging+in+C.+elegans.">In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), 1-9 (2013).</li><li>Jospin, M., Jacquemond, V., Mariol, M. C., S&#233;galat, L., Allard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+L-type+voltage-dependent+Ca2+channel+EGL-19+controls+body+wall+muscle+function+in+Caenorhabditis+elegans.">The L-type voltage-dependent Ca2+channel EGL-19 controls body wall muscle function in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Cell Biology. 159 (2), 337-347 (2002).</li><li>Wabnig, S., Liewald, J. F., Yu, S., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+All-Optical+Analysis+of+Synaptic+Transmission+and+Synaptic+Vesicle+Recycling+in+Caenorhabditis+elegans.">High-Throughput All-Optical Analysis of Synaptic Transmission and Synaptic Vesicle Recycling in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. , 1-26 (2015).</li></ol>

GECIs er et kraftig verktøy i C. elegans nevrobiologi. Tidligere arbeid har benyttet kalsium Imaging teknikker for å undersøke en rekke funksjoner i både neurons og muskelceller, inkludert sensoriske og atferdsmessige responser, med varierte metoder for stimulering. Noen studier har brukt kjemiske stimuli for å utløse kalsium transienter i Sensorisk aske neurons22,23 eller for å indusere kalsium bølger i pharyngeal muskler24</su...

Dette papiret presenterer metoder for in vivo kalsium Imaging av C. elegans Body Wall musklene bruker optogenetic neuronal stimulering. Sammenkobling av en muskel uttrykt genetisk kodet kalsium indikator (GECI) med blått lys utløst neuronal depolarization og gir et system for å tydelig observere fremkalt postsynaptic kalsium transienter. Dette unngår bruk av elektrisk stimulering, slik at en ikke-invasiv analyse av mutanter påvirker postsynaptic kalsium dynamikk.
Single-fluoroforen GECIs, som GCaMP, bruker et enkelt fluorescerende protein molekyl smeltet til M13 domenet av myosin lys kjeden kinase på sin N-Terminal ende og calmodulin (CaM) på C-Terminus. Ved kalsium binding, gjennomgår CaM-domenet, som har en høy affinitet for kalsium, en conformational endring som fremkaller en påfølgende conformational endring i fluorescerende protein som fører til en økning i fluorescens intensitet1. GCaMP fluorescens er spent på 488 NM, noe som gjør det uegnet til å bli brukt i forbindelse med channelrhodopsin, som har en lignende eksitasjon bølgelengde på 473 NM. Således, for å par kalsium målinger med channelrhodopsin stimulering, det grønne fluorescerende proteinet av GCaMP må byttes ut med et rødt fluorescerende protein, mRuby (RCaMP). Bruke muskelen uttrykt RCaMP, i kombinasjon med kolinerge motoriske Nevron uttrykk for channelrhodopsin, tillater studier ved ormen nevromuskulær Junction (NMJ) med samtidig bruk av optogenetics og funksjonell Imaging innenfor samme dyr 2i det.
Bruken av channelrhodopsin omgår behovet for elektrisk stimulering for å depolarize den nevromuskulær kryss av C. elegans, som bare kan oppnås i dissekert preparater, og dermed gjør denne teknikken både enklere å ansette og mer presis Når du målretter mot spesifikke vev. For eksempel, channelrhodopsin har tidligere vært brukt i C. elegans å reverserbart aktivere spesifikke neurons, fører til enten robust aktivering av eksitatoriske eller hemmende neurons3,4. Bruken av lys-stimulert depolarization også omgår spørsmålet om neuronal Kader på grunn av direkte elektrisk stimulering. Dette gir en mulighet til å undersøke virkningene av mange ulike stimulering protokoller, inkludert vedvarende og gjentatt stimuleringer, på postsynaptic kalsium dynamikk4.
Den gjennomsiktige natur C. elegans gjør det ideelt for fluorescerende Imaging funksjonell analyse. Men når stimulere eksitatoriske acetylkolin neurons på NMJ, dyr er forventet å svare med en umiddelbar muskel sammentrekning4, noe som gjør immobilisering av ormer kritisk i visualisere diskrete kalsium endringer. Tradisjonelt har farmakologiske midler blitt brukt til å lamme dyrene. Et slikt legemiddel som brukes er levamisole, en kolinerge acetylkolin reseptor Agonistiske5,6,7. Siden levamisole fører til vedvarende aktivering av en under type av eksitatoriske muskel reseptorer, denne reagens er uegnet for studiet av muskel kalsium dynamikk. Handlingen av levamisole induserer postsynaptic depolarization, heve cytosolic kalsium, og okkluderer observasjoner etter presynaptiske nervestimulering. For å unngå bruk av lammende narkotika, undersøkte vi to alternative metoder for å nakkens C. elegans. Dyrene var enten limt ned og deretter dissekert åpne for å eksponere kroppen veggen musklene, lik den eksisterende C. elegans nmj elektrofysiologi metode8, eller nanobeads ble brukt til å nakkens intakt dyr9. Begge prosedyrene er tillatt for reproduserbar målinger av hvile og fremkalt muskel kalsium transienter som var lett målbare.
Metodene i dette papiret kan brukes til å måle Baseline cytosolic kalsium nivåer og transienter i postsynaptic kroppen veggen muskelceller i C. elegans. Eksempler på data som sysselsetter de to ulike immobilisering teknikkene er gitt. Begge teknikkene dra nytte av optogenetics å depolarize muskelceller uten bruk av elektrisk stimulering. Disse eksemplene viser muligheten for denne metoden i å evaluere mutasjoner som påvirker postsynaptic kalsium håndtering i ormer og påpeke fordeler og ulemper med de to immobilisering tilnærminger.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>all-trans retinal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2500</td>
			<td>Necessary for excitation of channel rhodopsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber LED</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RCaMP illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino UNO</td>
			<td>Mouser</td>
			<td>782-A000066</td>
			<td>Controls fluorescence illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue LED</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>channelrhodopsin illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BX51WI microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Fixed state compound microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current controlled low noise linear power supply</td>
			<td>Ametek</td>
			<td>Sorenson</td>
			<td>Controls LED intensity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro</td>
			<td>Wavemetrics</td>
			<td>Wavemetrics.com</td>
			<td>Graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>imagej.nih.gov</td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUMFLN 60x water NA 1.4</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Water immersion objective for dissected preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master-8 Stimulator</td>
			<td>A.M.P.I</td>
			<td></td>
			<td>Master timer for image acquisition and LED illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Manager</td>
			<td></td>
			<td>micro-manager.org</td>
			<td>Controls camera acquisition and LED excitiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Spreadsheet software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pco.edge 4.2 CMOS camera</td>
			<td>pco.</td>
			<td>4.2</td>
			<td>High-speed camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlanApo N 60x oil NA 1.4</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Oil immersion objective for nanobead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead microspheres</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>00876-15</td>
			<td>For worm immobilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>solid state switches</td>
			<td>Sensata Technologies</td>
			<td>Crydom CMX100D6</td>
			<td>Controls timing of LED illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 
			(h134R)::yfp,lin-15(+)}; 
			Pmyo3::RCaMP35]</td>
			<td>Richmond Lab</td>
			<td>SY1627</td>
			<td>Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 
			(h134R)::yfp,lin-15(+)}; 
			Pmyo3::RCaMP35]</td>
			<td>Richmond Lab</td>
			<td></td>
			<td>Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 
			(h134R)::yfp,lin-15(+)}; 
			Pmyo3::RCaMP35]</td>
			<td>Gottschalk Lab</td>
			<td>ZX1659</td>
			<td>Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging in c. elegans body wall muscles

Modellen organisme C. elegans gir et utmerket system for å utføre in vivo kalsium bildebehandling. Den gjennomsiktige kroppen og genetiske manipulability tillater målrettede uttrykk for genetisk kodede kalsium sensorer. Denne protokollen skisserer bruken av disse sensorene for in vivo Imaging av kalsium dynamikk i målrettede celler, spesielt kroppen veggen musklene i ormer. Ved å benytte co-uttrykk for presynaptiske nerve channelrhodopsin, stimulering av acetylkolin utgivelse fra eksitatoriske motor neurons kan bli indusert ved hjelp av blått lyspulser, resulterer i muskel depolarization og reproduserbar endringer i cytoplasmatiske kalsium Nivåer. To ormen immobilisering teknikker er diskutert med varierende vanskelighetsgrad. Sammenligning av disse teknikkene viser at begge tilnærminger bevare fysiologi av nevromuskulær krysset og la for reproduserbar kvantifisering av kalsium transienter. Ved sammenkobling av optogenetics og funksjonell kalsium avbildning kan endringer i postsynaptic kalsium håndtering og homeostase evalueres i en rekke mutant bakgrunner. Data presentert validerer både immobilisering teknikker og spesielt undersøker rollene til C. elegans sarco (Endo) plasmid Retikulære kalsium ATPase og kalsium-aktivert BK kalium kanal i kroppen veggen muskel kalsium regulering.

Denne teknikken evaluerte endringer i mutanter tenkt å påvirke kalsium håndtering eller muskel depolarization. Baseline fluorescens nivåer og fluorescerende transienter ble visualisere og hviler cytosolic kalsium og kalsium Kinetics i muskelen ble evaluert. Det er viktig at dyrene ble dyrket på all-trans retinal i minst tre dager for å sikre vellykket innlemmelse av retinal, og dermed aktivere channelrhodopsin (figur 2A). Hvis dyr ikke ...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles at JoVE.com

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

Denne metoden gir en måte å par optogenetics og genetisk kodet kalsium sensorer til bilde Baseline cytosolic kalsium nivåer og endringer i fremkalt kalsium transienter i kroppen veggen musklene i modellen organisme C. elegans.

Inne vivo kalsium tenkelig inne C. elegans kropp mur muskelen

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Denne protokollen gir to metoder for å mobilisere C.Elegans å utføre in vivo kalsium avbildning av kroppen vegg muskler. Denne metoden kan bidra til å svare på spørsmål knyttet til kalsium homeostase og kalsiumhåndtering, og en tilgjengelig synapse i genetisk tractable organisme. Denne teknikken kan gi en bedre forståelse av mekanismene som regulerer muskelkalsium homeostase, og kan derfor være viktig for å identifisere forhold eller molekylære veier som påvirker eksitasjonssammentrekningskobling gjennom feilregulering av kalsiumsykling.Disse metodene kan gi innsikt i forskningsområder, inkludert, men ikke begrenset også, nevrobiologi, utviklingsbiologi og cellebiologi. Disse teknikkene kan tilpasses for å studere en rekke celletyper og C.elegans, andre relaterte nematoder samt filsafat larver. Visuell demonstrasjon av denne metoden er kritisk slik at eksperimentereren kan forstå disseksjonsteknikken, og kunne nøyaktig vurdere kalsiumtransienter fra riktig immobiliserte dyr.Start med å sette opp mikroskopet for fluorescerende bildebehandling. Bruk et vitenskapelig CMOS-kamera som kan avbildning på 100 hertz for å spore raske endringer i kalsiumnivået. Kontroller kameraoppkjøp og LED fluorescerende eksitasjon med en micromanager-programvare som kjører i ImageJ.Bruk en åpen kildekode elektronisk plattform plug-in som kobles til en ekstern opensource mikrokontroller bord for å administrere eksterne timing pulser som styrer fluorescerende excitations. For å kontrollere timinglogikken, aktiver micromanager-oppkjøpsprotokollen i programvaren i henhold til produsentens instruksjoner. Bruk to lysdioder for å stimulere kanal rhodopsin med blått lys og registrere RCaMP endringer.Aktiver kanal rhodopsin med am LED med topp opptak bølgelengde på 470 nanometer og en bandpass filter, og opphisse RCaMP med en LED med en topp opptak bølgelengde på 594 nanometer og en bandpass filter. Co-belyse begge lysdioder og overføre lyset til samme optiske bane ved hjelp av en dichroic stråle kombiner. Kontroller tidspunktet for LED-belysningen med en solid state-brytere kontrollert av TTL-signaler i henhold til manuskriptretninger, og sett LED-intensiteten med dagens kontrollerte laststøy lineære strømforsyninger, og programmer deretter simuleringsprotokollen for blått lys til en simulator.I dette eksperimentet slå på blått lys simulering etter to sekunder med å fange RCaMP fluorescens bare og bruke et tog på fem, to millisekund blått lys pulser med 50 millisekund intervaller for å aktivere kanal rhodopsin. Hvis du bruker disseksjonspreparatet, utfør C.elegans disseksjon i svakt lys. Legg dyrene i disseksjonsfatet med silikonbelagt dekkslipsbase som er fylt med en ett millimol kalsium ekstracellulær løsning tilberedt i henhold til manuskriptretninger.Lim ned dyrene ved hjelp av det flytende aktuelle hudlimet med blå farge langs den dorsale siden av ormen. Og lag et lateralt snitt langs lim- og ormgrensesnittet ved hjelp av glassnåler. Bruk en munnpipette for å fjerne det indre viscera fra ormhulen, og lim deretter ned dyrets skjellageklaff for å avsløre ventrale mediale kroppsveggmuskler for avbildning.Hvis du bruker nano-perlepreparatet, lag en smeltet 5% Agra-løsning ved hjelp av destillert vann til et endelig volum på 100 milliliter. Bruk en Pasteur pipette til å plassere en dråpe smeltet-Agra-løsning på en glasssklie og plasser umiddelbart en ekstra glasssklie over toppen ved hjelp av forsiktig trykk for å skape en jevn Agras pute. Fjern det øverste lysbildet og på omtrent fire mikroliter av polystyren nanoperler til midten av puten.I svakt lys legger du til fire til seks C.elegans i nanoperlenes løsning, og pass på at dyrene ikke ligger oppå hverandre, og legg forsiktig en dekkslip på toppen. Når du er klar til å bilde, plasser den tilberedte lysbilde- eller disseksjonsfatet på mikroskopet og finn og fokuser på en orm ved hjelp av 10 ganger forstørrelse og svak lys feltbelysning. Bytt til 60 ganger forstørrelse i RCaMP fluorescerende eksitasjon for å identifisere en ventrum mediale kroppen vegg muskel som er fremre til vulva og i riktig vokal plan.Deretter endrer du bildebanen fra okularet til kameraet ved å trekke ut veksleknappen og klikke live i datainnsamlingsprogramvaren. Klikk ORI-knappen i datainnsamlingsprogramvaren, og opprett en boks rundt muskelen som fokuseres på. På stimulatoren slår du på den tidligere programmerte blå lysstimuleringsveien, og deretter klikker du på Acquire på bildebehandlingsprogramvaren for å fange bildet.Når C.elegans dyrkes på all-trans retinal, vellykket innlemme retinal og aktivere kanalen rhodopsin, en kalsium forbigående kan fremkales. Hvis dyr ikke utsettes for all-trans retinal ingen muskel kalsium forbigående utløses. Denne protokollen ble brukt til å undersøke tap av funksjon sca-1 mutanter, som påvirker sarcoplasmic reticulum kalsiumpumpe kodet av sca-1 genet.Men disseksjonsforberedelsen øker i baseline nivåer av RCaMP fluorescens ble observert i mutant sammenlignet med kontrollen, noe som tyder på at mutasjonen trenger de forhøyede nivåene av hvile cytoplasmatisk kalsium. Det var en signifikant reduksjon i topp kalsiumnivåer i sca-1 mutanter sammenlignet med kontrollen. Det ble imidlertid ikke sett noen endring i den økte rushtiden eller halvforfallstiden.Viktigere, lignende resultater kan observeres ved hjelp av mindre teknisk utfordrende nano-perle forberedelse. Tap av funksjon slo-mutanter, som forstyrrer kalsiumaktiverte store kaliumkanaler ble evaluert for å undersøke mutanter som indirekte påvirker kalsiumhåndtering i C.elegans. Når baseline nivåer av RCaMP ble målt mutantene viste økt fluorescens sammenlignet med kontrollene.Ved evaluering av kinetikken til kalsiumtransienten ble det ikke sett noen endringer i toppkalsiumnivåer. De slo-1 (f.eks142)mutanter, men viste en betydelig økt økning til rushtiden. Det viktigste trinnet å huske når du fullfører prosedyren er å klargjøre eksperimentelle dyr i all-trans retinal.Uten dette trinnet vil kanalen rhodopsin være inaktiv, og hindrer at lysinduserte kalsiumtransienter utløses. Etter denne prosedyren kan elektrofysiologi og atferdsanalyse gjøres for å evaluere den funksjonelle effekten av eventuelle observerte endringer i kalsium homeostase. Ved hjelp av immobiliseringsmetodene som er skissert her, baner vei for videre utforskning av kalsiumdynamikk og viser at sammenlignbare resultater kan observeres som svar på optogenetisk nevronal stimulering og fangst av muskelkalsiumtransienter ved hjelp av den langt mindre utfordrende perleimmobiliseringsteknikken.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Påvisning av pH-avhengig aktivitet av<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Anstand HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; og<em&gt; I Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Combining Raman Imaging and Multivariate Analysis to Visualize Lignin, Cellulose, and Hemicellulose in the Plant Cell Wall

Kombinere Raman Imaging og Multivariate Analysis for å visualisere Lignin, Cellulose og Hemicellulose i Plant Cell Wall

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The ...

Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics

Utarbeidelse av Keratin hydrolyse fra kylling fjær og dens anvendelse i kosmetikk

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Strukturelle karakteristikk av Mannan cellevegg polysakkarider i planter ved hjelp av TEMPO

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Voksende Protein krystaller med forskjellige dimensjoner bruke automatisert krystallisering kombinert med In Situ dynamisk lysspredning

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Kolorimetrisk metode for å måle jerninnhold i planter

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-fri In Vitro kvantifisering av Protein Homo-oligomerization med kommersielle instrumentering og gratis, åpen kildekode lysstyrke analyseprogramvare

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

Deteksjon av fosfolipase C aktivitet i hjernen Homogenate fra Honeybee

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for studiet av proteininteraksjoner i Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Karakterisering av amyloid strukturer i aldring C. Elegans ved hjelp av fluorescens levetid imaging

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...