Name: in vivo calcium imaging in c. elegans body wall muscles
Uploaded: 2019-10-20T12:30:00
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Os autores agradecem ao Dr. Alexander Gottschalk por ZX1659, o RCaMP e o channelrhodopsin que contêm a tensão do sem-fim, Dr. Hongkyun Kim para a tensão do sem-fim de SLO-1 (eg142) , e o projeto nacional do Bioresource para a tensão do sem-fim SCA-1 (tm5339) .

1. configuração do microscópio
<ol><li>Use um microscópio composto com capacidades da fluorescência. Para este estudo, os dados foram coletados em um microscópio vertical (tabela de materiais) equipado com LEDs para excitação.</li>
	<li>A fim de visualizar corretamente as alterações de fluorescência nos músculos da parede do corpo, use um objetivo de alta ampliação.<ol>
<li>Para preparações dissecadas, use um objetivo de imersão de água 60x NA 1,0 (tabela de materiais...

<ol>
	<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca2++probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics.">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Activation+of+Channelrhodopsin-2+in+Excitable+Cells+of+Caenorhabditis+elegans+Triggers+Rapid+Behavioral+Responses.">Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses.</a> Current Biology. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li><li>Liewald, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+analysis+of+synaptic+function.">Optogenetic analysis of synaptic function.</a> Nature Methods. 5 (10), 895-902 (2008).</li><li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans.">Laser Microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biology. 107, 177-206 (2012).</li><li>Lewis, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+Receptor+Mutants+of+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans.">Cholinergic Receptor Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).</li><li>Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+levamisole+resistance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).</li><li>Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+GABA+and+two+acetylcholine+receptors+function+at+the+C.+elegans+neuromuscular+junction.">One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction.</a> Nature Neuroscience. 9, 791-798 (1999).</li><li>Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Imaging+of+Caenorhabditis+elegans+Using+Nanoparticle-Mediated+Immobilization.">Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization.</a> PLoS ONE. 8 (1), 1-6 (2013).</li><li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+control+of+microscopes+using+umanager.">Computer control of microscopes using umanager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. (Suppl 92), 1-17 (2010).</li><li>Richmond, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+and+Recording+from+The+C.+Elegans+Neuromuscular+Junction.">Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction.</a> Journal of Visualized Experiments. (24), 1-4 (2009).</li><li>Hoon Cho, J., Bandyopadhyay, J., Lee, J., Park, C. S., Ahnn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+isoforms+of+sarco/endoplasmic+reticulum+calcium+ATPase+(SERCA)+are+essential+in+Caenorhabditis+elegans.">Two isoforms of sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) are essential in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 261, 211-219 (2000).</li><li>Zwaal, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sarco-Endoplasmic+Reticulum+Ca2++ATPase+Is+Required+for+Development+and+Muscle+Function+in+Caenorhabditis+elegans.">The Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase Is Required for Development and Muscle Function in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (47), 43557-43563 (2001).</li><li>Stammers, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+sarco(endo)plasmic+reticulum+calcium-ATPases+(SERCA).">The regulation of sarco(endo)plasmic reticulum calcium-ATPases (SERCA).</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93, 1-12 (2015).</li><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Signaling.">Calcium Signaling.</a> Cell. 131, 1047-1058 (2007).</li><li>Hovnanian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serca+pumps+and+human+diseases.">Serca pumps and human diseases.</a> Calcium Signalling and Disease: Molecular Pathology of Calcium. , 337-363 (2007).</li><li>Periasamy, M., Kalyanasundaram, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SERCA+pump+isoforms:+Their+role+in+calcium+transport+and+disease.">SERCA pump isoforms: Their role in calcium transport and disease.</a> Muscle and Nerve. 35 (4), 430-442 (2007).</li><li>Gehlert, S., Bloch, W., Suhr, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-Dependent+Regulations+and+Signaling+in+Skeletal+Muscle:+From+Electro-Mechanical+Coupling+to+Adaptation.">Ca2+-Dependent Regulations and Signaling in Skeletal Muscle: From Electro-Mechanical Coupling to Adaptation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16, 1066-1095 (2015).</li><li>Martin, A. A., Richmond, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sarco(endo)plasmic+reticulum+calcium+ATPase+SCA-1+regulates+the+Caenorhabditis+elegans+nicotinic+acetylcholine+receptor+ACR-16.">The sarco(endo)plasmic reticulum calcium ATPase SCA-1 regulates the Caenorhabditis elegans nicotinic acetylcholine receptor ACR-16.</a> Cell Calcium. 72, 104-115 (2018).</li><li>Wang, Z., Saifee, O., Nonet, M. L., Salkoff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLO-1+Potassium+Channels+Control+Quantal+Content+of+Neurotransmitter+Release+at+the+C.+elegans+Neuromuscular+Junction.">SLO-1 Potassium Channels Control Quantal Content of Neurotransmitter Release at the C. elegans Neuromuscular Junction.</a> Neuron. 32, 867-881 (2001).</li><li>Abraham, L. S., Oh, H. J., Sancar, F., Richmond, J. E., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Alpha-Catulin+Homologue+Controls+Neuromuscular+Function+through+Localization+of+the+Dystrophin+Complex+and+BK+Channels+in+Caenorhabditis+elegans.">An Alpha-Catulin Homologue Controls Neuromuscular Function through Localization of the Dystrophin Complex and BK Channels in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 6 (8), 1-13 (2010).</li><li>Gourgou, E., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+induced+oxidative+stress+affects+ASH+neuronal+function+and+behavior+in+C.+elegans.">Chemically induced oxidative stress affects ASH neuronal function and behavior in C. elegans.</a> Scientific Reports. 6, 1-9 (2016).</li><li>Zahratka, J. A., Williams, P. D. E., Summers, P. J., Komuniecki, R. W., Bamber, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+differentially+modulates+Ca2++transients+and+depolarization+in+a+C.+elegans+nociceptor.">Serotonin differentially modulates Ca2+ transients and depolarization in a C. elegans nociceptor.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1041-1050 (2015).</li><li>Kerr, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+calcium+transients+in+neurons+and+pharyngeal+muscle+of+C.+elegans.">Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans.</a> Neuron. 26 (3), 583-594 (2000).</li><li>Nekimken, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pneumatic+stimulation+of+C.+elegans+mechanoreceptor+neurons+in+a+microfluidic+trap.">Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap.</a> Lab Chip. 17 (6), 1116-1127 (2017).</li><li>Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Neuronal+Calcium+Imaging+in+C.+elegans.">In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), 1-9 (2013).</li><li>Jospin, M., Jacquemond, V., Mariol, M. C., S&#233;galat, L., Allard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+L-type+voltage-dependent+Ca2+channel+EGL-19+controls+body+wall+muscle+function+in+Caenorhabditis+elegans.">The L-type voltage-dependent Ca2+channel EGL-19 controls body wall muscle function in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Cell Biology. 159 (2), 337-347 (2002).</li><li>Wabnig, S., Liewald, J. F., Yu, S., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+All-Optical+Analysis+of+Synaptic+Transmission+and+Synaptic+Vesicle+Recycling+in+Caenorhabditis+elegans.">High-Throughput All-Optical Analysis of Synaptic Transmission and Synaptic Vesicle Recycling in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. , 1-26 (2015).</li></ol>

GECIs são uma ferramenta poderosa em C. elegans neurobiologia. O trabalho anterior utilizou técnicas de imagem de cálcio para examinar uma ampla variedade de funções em ambos os neurônios e células musculares, incluindo respostas sensoriais e comportamentais, com variados métodos de estimulação. Alguns estudos utilizaram estímulos químicos para desencadear transientes de cálcio em neurônios de cinzas sensoriais22,23 ou para induzir ondas de...

Este papel apresenta métodos para a imagem latente in vivo do cálcio de C. elegans músculos da parede do corpo usando a estimulação neuronal optogenética. Emparelhar um indicador de cálcio geneticamente codificado expresso (GECI) com luz azul desencadeou a despolarização neuronal e fornece um sistema para observar claramente os transientes pós-sinápticos evocados de cálcio. Isso evita o uso de estimulação elétrica, permitindo uma análise não invasiva de mutantes que afetam a dinâmica pós-sináptica do cálcio.
O GECIS do único-fluorophore, tal como gcamp, usa uma única molécula fluorescente da proteína fundida ao domínio M13 da quinase da corrente clara do miosina em seu fim do N-terminal e no calmodulina (CaM) no C-Terminus. Em cima do emperramento do cálcio, o domínio do CaM, que tem uma afinidade elevada para o cálcio, sofre uma mudança conformacional que induz uma mudança conformacional subseqüente na proteína fluorescente que conduz a um aumento na intensidade1da fluorescência. GCaMP fluorescência está animado em 488 nm, tornando-se inadequado para ser usado em conjunto com channelrhodopsin, que tem um comprimento de onda de excitação semelhante de 473 nm. Assim, a fim de par de medições de cálcio com a estimulação da channelrhodopsina, a proteína verde fluorescente do GCaMP precisa ser substituída por uma proteína vermelha fluorescente, mRuby (RCaMP). Usando o músculo expressado rcamp, em combinação com a expressão colinérgicos do neurônio do motor do channelrhodopsin, permite estudos na junção neuromuscular do sem-fim (nmj) com uso simultâneo do optogenetics e da imagem latente funcional dentro do mesmo animal o 2.
O uso de channelrhodopsin ignora a necessidade de a estimulação elétrica despolarizar as junções neuromusculares de C. elegans, que só pode ser alcançada em preparações dissecadas, tornando esta técnica mais fácil de empregar e mais precisa ao segmentar tecidos específicos. Por exemplo, channelrhodopsin tem sido usado anteriormente em C. elegans para ativar os neurônios específicos de formareversível, levandoa uma ativação robusta de neurônios excitatórios ou inibidoresde inibição3,4. O uso da despolarização luz-estimulada igualmente contorna a edição de dano neuronal devido à estimulação elétrica direta. Isto fornece uma oportunidade de examinar os efeitos de muitos protocolos diferentes da estimulação, incluindo estimulações sustentadas e repetidas, na dinâmica pós-sináptica do cálcio4.
A natureza transparente de C. elegans torna-o ideal para a análise funcional de imagens fluorescentes. No entanto, ao estimular os neurônios excitatórios de acetilcolina na NMJ, espera-se que os animais respondam com uma contração muscular imediata4, tornando a imobilização dos vermes críticos na visualização de alterações discretas de cálcio. Tradicionalmente, os agentes farmacológicos têm sido usados para paralisar os animais. Uma tal droga usada é Levamisole, um agonista do receptor de acetilcolina colinérgico5,6,7. Desde que levamisol conduz à ativação persistente de um SubType de receptores excitatórios do músculo, este reagente é inadequado para o estudo da dinâmica do cálcio do músculo. A ação de levamisol induz a despolarização pós-sináptica, elevando o cálcio citosólico, e obstruindo observações depois da estimulação pré-sináptica. Para evitar o uso de drogas paralisantes, examinamos dois métodos alternativos para imobilizar C. elegans. Os animais foram colados para baixo e, em seguida, dissecado aberto para expor os músculos da parede do corpo, semelhante ao existente C. elegans nmj método de eletrofisiologia8, ou nanobeads foram utilizados para imobilizar animais intactos9. Ambos os procedimentos permitiram as medidas reprodutíveis dos transientes do cálcio do descanso e do músculo evocado que eram facilmente quantifiable.
Os métodos deste trabalho podem ser utilizados para medir os níveis de cálcio citosólico basal e transientes em células musculares da parede do corpo pós-sináptica em C. elegans. Exemplos de dados empregando as duas técnicas de imobilização diferentes são dadas. Ambas as técnicas aproveitam a optogenética para despolarizar as células musculares sem o uso de estimulação elétrica. Estes exemplos demonstram a viabilidade deste método em avaliar as mutações que afetam o tratamento pós-sináptica do cálcio nos sem-fins e apontam os prós e os contras das duas aproximações da imobilização.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>all-trans retinal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2500</td>
			<td>Necessary for excitation of channel rhodopsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber LED</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RCaMP illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino UNO</td>
			<td>Mouser</td>
			<td>782-A000066</td>
			<td>Controls fluorescence illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue LED</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>channelrhodopsin illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BX51WI microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Fixed state compound microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current controlled low noise linear power supply</td>
			<td>Ametek</td>
			<td>Sorenson</td>
			<td>Controls LED intensity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro</td>
			<td>Wavemetrics</td>
			<td>Wavemetrics.com</td>
			<td>Graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>imagej.nih.gov</td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUMFLN 60x water NA 1.4</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Water immersion objective for dissected preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master-8 Stimulator</td>
			<td>A.M.P.I</td>
			<td></td>
			<td>Master timer for image acquisition and LED illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Manager</td>
			<td></td>
			<td>micro-manager.org</td>
			<td>Controls camera acquisition and LED excitiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Spreadsheet software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pco.edge 4.2 CMOS camera</td>
			<td>pco.</td>
			<td>4.2</td>
			<td>High-speed camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlanApo N 60x oil NA 1.4</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Oil immersion objective for nanobead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead microspheres</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>00876-15</td>
			<td>For worm immobilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>solid state switches</td>
			<td>Sensata Technologies</td>
			<td>Crydom CMX100D6</td>
			<td>Controls timing of LED illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 
			(h134R)::yfp,lin-15(+)}; 
			Pmyo3::RCaMP35]</td>
			<td>Richmond Lab</td>
			<td>SY1627</td>
			<td>Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 
			(h134R)::yfp,lin-15(+)}; 
			Pmyo3::RCaMP35]</td>
			<td>Richmond Lab</td>
			<td></td>
			<td>Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 
			(h134R)::yfp,lin-15(+)}; 
			Pmyo3::RCaMP35]</td>
			<td>Gottschalk Lab</td>
			<td>ZX1659</td>
			<td>Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging in c. elegans body wall muscles

O organismo modelo C. elegans fornece um sistema excelente para executar a imagem latente in vivo do cálcio. Seu corpo transparente e manipulabilidade genética permitem a expressão direcionada de sensores de cálcio geneticamente codificados. Este protocolo esboça o uso destes sensores para a imagem latente in vivo da dinâmica do cálcio em pilhas alvejadas, especificamente os músculos da parede do corpo dos sem-fins. Ao utilizar a coexpressão de channelrhodopsina pré-sináptica, a estimulação da liberação de acetilcolina de neurônios motores excitatórios pode ser induzida usando pulsos de luz azul, resultando em despolarização muscular e alterações reprodutíveis no cálcio citoplasmático Níveis. Duas técnicas de imobilização de vermes são discutidas com diferentes níveis de dificuldade. A comparação dessas técnicas demonstra que ambas as abordagens preservam a fisiologia da junção neuromuscular e permitem a quantificação reprodutível dos transientes de cálcio. Emparelhando a optogenética e a imagem latente funcional do cálcio, as mudanças na manipulação e na homeostase pós-sináptica do cálcio podem ser avaliadas em uma variedade de fundos do mutante. Os dados apresentados valiam ambas as técnicas da imobilização e examinam especificamente os papéis do C. elegans Sarco (endo) o ATPase reticular Plasmic do cálcio e o canal cálcio-ativado do potássio de BK na regulação do cálcio do músculo da parede do corpo.

Essa técnica avaliou alterações nos mutantes que se achavam afetar o manuseio do cálcio ou a despolarização muscular. Os níveis de fluorescência basal e os transientes fluorescentes foram visualizados e a cinética de cálcio e cálcio citosólico em repouso no músculo foi avaliada. É importante que os animais foram cultivados em todos-trans retiniana por pelo menos três dias para garantir a incorporação bem-sucedida da retina, ativando assim subsequentemente a channelrhodops...

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In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

Este método fornece uma maneira de acoplar optogenetics e de sensores genetically codificados do cálcio aos níveis citosónicos da imagem basal do cálcio e às mudanças em transientes evocados do cálcio nos músculos da parede do corpo do modelo C. elegansdo organismo.

In vivo Calcium Imaging em C. elegans corpo parede músculos

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Este protocolo fornece dois métodos para mobilizar C.Elegans para realizar imagens in vivo de cálcio dos músculos da parede corporal. Este método pode ajudar a responder perguntas relacionadas à homeostase de cálcio e manuseio de cálcio, e uma sinapse acessível em organismo geneticamente tratável. Essa técnica pode proporcionar uma melhor compreensão dos mecanismos que regulam a homeostase do cálcio muscular e, portanto, pode ser importante na identificação de condições ou vias moleculares que impactam o acoplamento da excitação através da desregulamentação do ciclismo de cálcio.Esses métodos podem fornecer insights sobre áreas de pesquisa, incluindo, mas não limitado também, neurobiologia, biologia do desenvolvimento e biologia celular. Essas técnicas poderiam ser adaptadas para estudar uma variedade de tipos de células e C.elegans, outros nematoides relacionados, bem como larvas de filsafat. A demonstração visual deste método é fundamental para que o experimentador possa entender a técnica de dissecção e ser capaz de avaliar com precisão os transitórios de cálcio de animais devidamente imobilizados.Comece configurando o microscópio para imagens fluorescentes. Use uma câmera CMOS científica capaz de imagens completas em 100 hertz, a fim de rastrear mudanças rápidas nos níveis de cálcio. Controle aquisição de câmera e excitação fluorescente led com um software microgerente em execução no ImageJ.Use um plug-in eletrônico de plataforma de código aberto que se conecta a uma placa de microcontrolador de fonte aberta externa para gerenciar os pulsos de tempo externos que controlam excitações fluorescentes. Para controlar a lógica de tempo, ative o protocolo de aquisição de microgerente no software de acordo com as instruções dos fabricantes. Use dois LEDs para estimular a rodopsina do canal com luz azul e registrar as alterações de RCaMP.Ative a rodopsina do canal com LED am com o comprimento de onda de entrada máxima de 470 nanômetros e um filtro de bandpass, e excite o RCaMP com um LED com um comprimento de onda de entrada máxima de 594 nanômetros e um filtro de bandpass. Co-ilumine ambos os LEDs e transmita a luz para o mesmo caminho óptico usando um combinador de feixedicróico. Controle o tempo da iluminação LED com um estado sólido de interruptores controlados por sinais TTL de acordo com as instruções do manuscrito e defina a intensidade do LED com as fontes de alimentação lineares de ruído de carga controladas atuais e programe o protocolo de simulação de luz azul em um simulador.Neste experimento, ligue a simulação de luz azul após dois segundos de captura apenas da fluorescência RCaMP e use um trem de cinco, dois pulsos de luz azul milissegundos com intervalos de 50 milissegundos para ativar a rhodopsina do canal. Se estiver usando a preparação de dissecção, realize a dissecação de C.elegans com pouca luz. Coloque os animais no prato de dissecção com a base de cobertura revestida de silicone que é preenchida com um milimole de solução extracelular de cálcio preparada de acordo com as instruções do manuscrito.Cole os animais usando o adesivo de pele tópica líquida com coloração azul ao longo do lado dorsal do verme. E faça uma incisão lateral de cutícula ao longo da cola e interface de verme usando agulhas de vidro. Use uma pipeta bucal para limpar as vísceras internas da cavidade do verme, em seguida, cole a retalho cutícula do animal para expor os músculos da parede do corpo medial ventral para a imagem.Se usar a preparação de nano-contas, faça uma solução derretida de 5% Agra usando água destilada para um volume final de 100 mililitros. Use uma pipeta Pasteur para colocar uma gota de solução de Agra derretida em um slide de vidro e coloque imediatamente um segundo deslizamento de vidro sobre a parte superior usando suavemente pressão para criar uma almofada de Agra uniforme. Remova o slide superior e em aproximadamente quatro microliters de nano-contas de poliestireno para o meio da almofada.Em baixa luz adicione quatro a seis C.elegans na solução nano-contas, certificando-se de que os animais não se deitam em cima uns dos outros, e cuidadosamente coloquem um deslizamento em cima. Quando estiver pronto para a imagem, coloque o slide preparado ou a placa de dissecção no microscópio e encontre e concentre-se em um worm usando 10 vezes a ampliação e a iluminação de campo brilhante fraca. Mude para 60 vezes a ampliação na excitação fluorescente RCaMP para identificar um músculo da parede medial do ventrum que é anterior à vulva e no plano vocal correto.Em seguida, altere o caminho da imagem da ocular para a câmera, puxando o alternador e clicando ao vivo dentro do software de aquisição de dados. Clique no botão ORI no software de aquisição de dados e crie uma caixa em torno do músculo que está sendo focado. No estimulador, ligue a via de estimulação da luz azul previamente programada e clique em Adquirir no software de imagem para capturar a imagem.Quando os C.elegans são cultivados em retina totalmente trans, incorporando com sucesso a retina e ativando a rodopsina do canal, um transitório de cálcio pode ser evocado. Se os animais não forem expostos à retina totalmente trans, nenhum passageiro de cálcio muscular é acionado. Este protocolo foi usado para investigar a perda de funções de mutantes sca-1, que impactam a bomba de cálcio órticulo sarcoplasmático codificada pelo gene sca-1.Mas, a preparação da dissecção aumenta nos níveis de linha de base da fluorescência de RCaMP foram observados no mutante em comparação com o controle, sugerindo que a mutação precisa dos níveis elevados de cálcio citoplasmica de repouso. Houve uma diminuição significativa nos níveis de pico de cálcio nos mutantes de esca-1 em comparação com o controle. No entanto, nenhuma mudança foi vista no horário de pico aumentado ou no tempo de decadência da metade.É importante ressaltar que resultados semelhantes podem ser observados usando a preparação de nano-contas menos tecnicamente desafiadora. A perda de funções de slo-mutantes, que interrompem os grandes canais de potássio ativados de cálcio foram avaliados a fim de investigar mutantes que indiretamente afetam o manuseio de cálcio em C.elegans. Quando os níveis de linha de base de RCaMP foram medidos, os mutantes apresentaram aumento da fluorescência em comparação com os controles.Ao avaliar a cinética do cálcio não foram observadas alterações nos níveis de pico de cálcio. Os mutantes slo-1(eg142), no entanto, apresentaram um aumento significativo para o horário de pico. O passo mais importante a ser lembrado ao completar o procedimento é preparar animais experimentais em retina totalmente trans.Sem esta etapa, a rodopsina do canal estará inativa, impedindo que transitórios de cálcio induzidos pela luz sejam acionados. Após este procedimento, a eletrofisiologia e a análise comportamental podem ser feitas para avaliar o impacto funcional de quaisquer alterações observadas na homeostase do cálcio. Utilizando os métodos de imobilização aqui descritos, abre caminho para uma maior exploração da dinâmica do cálcio e demonstra que resultados comparáveis podem ser observados em resposta à estimulação neuronal optogenética e captura de transintes de cálcio muscular usando a técnica de imobilização de contas muito menos desafiadora.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detecção da actividade de dependente do pH<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; e<em&gt; In Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Bioquímica

Combining Raman Imaging and Multivariate Analysis to Visualize Lignin, Cellulose, and Hemicellulose in the Plant Cell Wall

Combinando imagem Raman e análise multivariada para visualizar Lignina, celulose e hemicelulose no muro celular da planta

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The ...

Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics

Preparação de hidrolisado de queratina de penas de galinha e sua aplicação em cosméticos

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Caracterização estrutural de polissacarídeos de parede celular Medeiros em plantas usando a ritmo

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Crescimento de cristais de proteína com dimensões distintas usando automatizado cristalização juntamente com In Situ Difusão dinâmica da luz

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Um método colorimétrico para medir o teor de ferro nas plantas

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

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Livre de calibração em Vitro quantificação da proteína Homo-oligomerização usando instrumentação comercial e livre, Open Source Software de análise de brilho

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

Deteção da fosfolipase C atividade no cérebro Homogenate da abelha

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting para o Estudo de Interações Proteicas em Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Caracterização de estruturas amilóides em Envelhecimento C. Elegans usando imagem de fluorescência ao longo da vida

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...