Name: in vivo calcium imaging in c. elegans body wall muscles
Uploaded: 2019-10-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles at JoVE.com

Авторы благодарят д-ра Александра Готтшалька за «X1659», RCaMP и channelrhodopsin, содержащий штамм червей, доктора Hongkyun Кима за штамм червей slo-1 (eg142) и Национальный проект биоресурсов для штамма червя sca-1 (tm5339).

1. Установка микроскопа
<ol><li>Используйте сложный микроскоп с возможностями флуоресценции. Для этого исследования были собраны данные по вертикальному микроскопу(Таблица материалов),оснащенному светодиодами для возбуждения.</li>
	<li>Для того, чтобы правильно визуализировать из...

<ol>
	<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca2++probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics.">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Activation+of+Channelrhodopsin-2+in+Excitable+Cells+of+Caenorhabditis+elegans+Triggers+Rapid+Behavioral+Responses.">Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses.</a> Current Biology. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li><li>Liewald, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+analysis+of+synaptic+function.">Optogenetic analysis of synaptic function.</a> Nature Methods. 5 (10), 895-902 (2008).</li><li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans.">Laser Microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biology. 107, 177-206 (2012).</li><li>Lewis, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+Receptor+Mutants+of+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans.">Cholinergic Receptor Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).</li><li>Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+levamisole+resistance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).</li><li>Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+GABA+and+two+acetylcholine+receptors+function+at+the+C.+elegans+neuromuscular+junction.">One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction.</a> Nature Neuroscience. 9, 791-798 (1999).</li><li>Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Imaging+of+Caenorhabditis+elegans+Using+Nanoparticle-Mediated+Immobilization.">Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization.</a> PLoS ONE. 8 (1), 1-6 (2013).</li><li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+control+of+microscopes+using+umanager.">Computer control of microscopes using umanager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. (Suppl 92), 1-17 (2010).</li><li>Richmond, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+and+Recording+from+The+C.+Elegans+Neuromuscular+Junction.">Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction.</a> Journal of Visualized Experiments. (24), 1-4 (2009).</li><li>Hoon Cho, J., Bandyopadhyay, J., Lee, J., Park, C. S., Ahnn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+isoforms+of+sarco/endoplasmic+reticulum+calcium+ATPase+(SERCA)+are+essential+in+Caenorhabditis+elegans.">Two isoforms of sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) are essential in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 261, 211-219 (2000).</li><li>Zwaal, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sarco-Endoplasmic+Reticulum+Ca2++ATPase+Is+Required+for+Development+and+Muscle+Function+in+Caenorhabditis+elegans.">The Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase Is Required for Development and Muscle Function in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (47), 43557-43563 (2001).</li><li>Stammers, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+sarco(endo)plasmic+reticulum+calcium-ATPases+(SERCA).">The regulation of sarco(endo)plasmic reticulum calcium-ATPases (SERCA).</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93, 1-12 (2015).</li><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Signaling.">Calcium Signaling.</a> Cell. 131, 1047-1058 (2007).</li><li>Hovnanian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serca+pumps+and+human+diseases.">Serca pumps and human diseases.</a> Calcium Signalling and Disease: Molecular Pathology of Calcium. , 337-363 (2007).</li><li>Periasamy, M., Kalyanasundaram, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SERCA+pump+isoforms:+Their+role+in+calcium+transport+and+disease.">SERCA pump isoforms: Their role in calcium transport and disease.</a> Muscle and Nerve. 35 (4), 430-442 (2007).</li><li>Gehlert, S., Bloch, W., Suhr, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-Dependent+Regulations+and+Signaling+in+Skeletal+Muscle:+From+Electro-Mechanical+Coupling+to+Adaptation.">Ca2+-Dependent Regulations and Signaling in Skeletal Muscle: From Electro-Mechanical Coupling to Adaptation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16, 1066-1095 (2015).</li><li>Martin, A. A., Richmond, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sarco(endo)plasmic+reticulum+calcium+ATPase+SCA-1+regulates+the+Caenorhabditis+elegans+nicotinic+acetylcholine+receptor+ACR-16.">The sarco(endo)plasmic reticulum calcium ATPase SCA-1 regulates the Caenorhabditis elegans nicotinic acetylcholine receptor ACR-16.</a> Cell Calcium. 72, 104-115 (2018).</li><li>Wang, Z., Saifee, O., Nonet, M. L., Salkoff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLO-1+Potassium+Channels+Control+Quantal+Content+of+Neurotransmitter+Release+at+the+C.+elegans+Neuromuscular+Junction.">SLO-1 Potassium Channels Control Quantal Content of Neurotransmitter Release at the C. elegans Neuromuscular Junction.</a> Neuron. 32, 867-881 (2001).</li><li>Abraham, L. S., Oh, H. J., Sancar, F., Richmond, J. E., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Alpha-Catulin+Homologue+Controls+Neuromuscular+Function+through+Localization+of+the+Dystrophin+Complex+and+BK+Channels+in+Caenorhabditis+elegans.">An Alpha-Catulin Homologue Controls Neuromuscular Function through Localization of the Dystrophin Complex and BK Channels in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 6 (8), 1-13 (2010).</li><li>Gourgou, E., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+induced+oxidative+stress+affects+ASH+neuronal+function+and+behavior+in+C.+elegans.">Chemically induced oxidative stress affects ASH neuronal function and behavior in C. elegans.</a> Scientific Reports. 6, 1-9 (2016).</li><li>Zahratka, J. A., Williams, P. D. E., Summers, P. J., Komuniecki, R. W., Bamber, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+differentially+modulates+Ca2++transients+and+depolarization+in+a+C.+elegans+nociceptor.">Serotonin differentially modulates Ca2+ transients and depolarization in a C. elegans nociceptor.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1041-1050 (2015).</li><li>Kerr, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+calcium+transients+in+neurons+and+pharyngeal+muscle+of+C.+elegans.">Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans.</a> Neuron. 26 (3), 583-594 (2000).</li><li>Nekimken, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pneumatic+stimulation+of+C.+elegans+mechanoreceptor+neurons+in+a+microfluidic+trap.">Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap.</a> Lab Chip. 17 (6), 1116-1127 (2017).</li><li>Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Neuronal+Calcium+Imaging+in+C.+elegans.">In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), 1-9 (2013).</li><li>Jospin, M., Jacquemond, V., Mariol, M. C., S&#233;galat, L., Allard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+L-type+voltage-dependent+Ca2+channel+EGL-19+controls+body+wall+muscle+function+in+Caenorhabditis+elegans.">The L-type voltage-dependent Ca2+channel EGL-19 controls body wall muscle function in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Cell Biology. 159 (2), 337-347 (2002).</li><li>Wabnig, S., Liewald, J. F., Yu, S., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+All-Optical+Analysis+of+Synaptic+Transmission+and+Synaptic+Vesicle+Recycling+in+Caenorhabditis+elegans.">High-Throughput All-Optical Analysis of Synaptic Transmission and Synaptic Vesicle Recycling in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. , 1-26 (2015).</li></ol>

GECIs являются мощным инструментом в C. elegans нейробиологии. Предыдущая работа использовала методы визуализации кальция для изучения широкого спектра функций в нейронах и мышечных клетках, включая сенсорные и поведенческие реакции, с различными методами стимуляции. Некоторые исслед?...

В этой статье представлены методы для in vivo изображения кальция C. elegans мышцстены тела с использованием оптогенетической стимуляции нейронов. Сопряжение мышцы, выраженной генетически закодированным индикатором кальция (GECI) с синим светом, спровоцировав нейрональную деполяризацию и обеспечивает систему для четкого наблюдения вызываемых постсинаптических переходных кальций. Это позволяет избежать использования электрической стимуляции, что позволяет неинвазивный анализ мутантов, влияющих на динамику постсинаптического кальция.
Однофторофорные ГКИ, такие как GCaMP, используют одну флуоресцентную молекулу белка, сливную с доменом M13 миозиновой легкой цепи киназы в конце N-терминала и стодулина (CAM) в C-терминине. После связывания кальция, домен CaM, который имеет высокое сродство к кальцию, подвергается конформационным изменениям, вызывая последующее конформационное изменение флуоресцентного белка, что приводит к увеличению интенсивности флуоресценции1. GCaMP флуоресценция возбужденных на 488 нм, что делает его непригодным для использования в сочетании с channelrhodopsin, который имеет аналогичную длину волн возбуждения 473 нм. Таким образом, для того, чтобы соединить измерения кальция со стимуляцией channelrhodopsin, зеленый флуоресцентный белок GCAMP должен быть заменен красным флуоресцентным белком, мруби (RCaMP). Использование мышцы выразилRCaMP, в сочетании с холинергической двигательной нейронной экспрессии channelrhodopsin, позволяет исследования на червя нервно-мышечного соединения (NMJ) с одновременным использованием оптогенетики и функциональной визуализации в рамках одного и того же животного 2.
Использование channelrhodopsin обходит необходимость электрической стимуляции для деполяризации нервно-мышечных соединений C. elegans, которые могут быть достигнуты только в расчлененных препаратов, что делает этот метод как легче использовать и более точным при ориентации на конкретные ткани. Например, channelrhodopsin ранее был использован в C. elegans для обратимой активации конкретных нейронов, что приводит либо к надежной активации возбуждательных или ингибирующих нейронов3,4. Использование светостимулируемой деполяризации также обходит вопрос о повреждении нейронов из-за прямой электрической стимуляции. Это дает возможность изучить влияние многих различных протоколов стимуляции, в том числе устойчивых и повторяющихся стимуляций, на постсинаптической динамике кальция4.
Прозрачный характер C. elegans делает его идеальным для флуоресцентного изображения функционального анализа. Однако, при стимулировании возбуждающих ацетилхолина нейронов на NMJ, животные, как ожидается, реагировать с немедленной сокращения мышц4, что делает иммобилизацию червей решающее значение в визуализации дискретных изменений кальция. Традиционно, фармакологические агенты были использованы, чтобы парализовать животных. Одним из таких препаратов используется левамизол, холинергический ацетилхолин рецептор агониста5,6,7. Так как левамизол приводит к постоянной активации подтипа возбуждающих мышечных рецепторов, этот реагент не подходит для изучения динамики мышечного кальция. Действие левамизола вызывает постинаптическую деполяризацию, повышение цитозолического кальция и окклюзионные наблюдения после пресинаптической стимуляции. Чтобы избежать применения парализующих препаратов, мы рассмотрели два альтернативных метода обездвиживания C. elegans. Звери были либо склеены, а затем расчленены открытыми, чтобы разоблачить мышцы стенки тела, похожие на существующие C. elegans NMJ электрофизиологии метод8, или нанобусы были использованы для обездвиживания нетронутых животных9. Обе процедуры позволили для воспроизводимых измерений отдыха и вызвали мышечного кальция переходных, которые были легко поддаются количественной оценке.
Методы в этой работе могут быть использованы для измерения базовых уровней цитосолика кальция и переходных в постсинаптических клеток мышц стенки тела в C. elegans. Приводятся примеры данных, использующих два различных метода иммобилизации. Оба метода воспользоваться оптогенетики деполяризации мышечных клеток без использования электрической стимуляции. Эти примеры демонстрируют осуществимость этого метода при оценке мутаций, которые влияют на постсинаптическую обработку кальция у червей, и указывают на плюсы и минусы двух иммобилизационных подходов.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>all-trans retinal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2500</td>
			<td>Necessary for excitation of channel rhodopsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber LED</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RCaMP illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino UNO</td>
			<td>Mouser</td>
			<td>782-A000066</td>
			<td>Controls fluorescence illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue LED</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>channelrhodopsin illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BX51WI microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Fixed state compound microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current controlled low noise linear power supply</td>
			<td>Ametek</td>
			<td>Sorenson</td>
			<td>Controls LED intensity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro</td>
			<td>Wavemetrics</td>
			<td>Wavemetrics.com</td>
			<td>Graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>imagej.nih.gov</td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUMFLN 60x water NA 1.4</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Water immersion objective for dissected preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master-8 Stimulator</td>
			<td>A.M.P.I</td>
			<td></td>
			<td>Master timer for image acquisition and LED illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Manager</td>
			<td></td>
			<td>micro-manager.org</td>
			<td>Controls camera acquisition and LED excitiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Spreadsheet software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pco.edge 4.2 CMOS camera</td>
			<td>pco.</td>
			<td>4.2</td>
			<td>High-speed camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlanApo N 60x oil NA 1.4</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Oil immersion objective for nanobead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead microspheres</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>00876-15</td>
			<td>For worm immobilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>solid state switches</td>
			<td>Sensata Technologies</td>
			<td>Crydom CMX100D6</td>
			<td>Controls timing of LED illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 
			(h134R)::yfp,lin-15(+)}; 
			Pmyo3::RCaMP35]</td>
			<td>Richmond Lab</td>
			<td>SY1627</td>
			<td>Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 
			(h134R)::yfp,lin-15(+)}; 
			Pmyo3::RCaMP35]</td>
			<td>Richmond Lab</td>
			<td></td>
			<td>Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 
			(h134R)::yfp,lin-15(+)}; 
			Pmyo3::RCaMP35]</td>
			<td>Gottschalk Lab</td>
			<td>ZX1659</td>
			<td>Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging in c. elegans body wall muscles

Модель организма C. elegans обеспечивает отличную систему для выполнения виво-изображения кальция. Его прозрачное тело и генетическая манипулируемость позволяют целенаправленно выражать генетически закодированные датчики кальция. Этот протокол описывает использование этих датчиков для in vivo изображения динамики кальция в целевых клетках, в частности, мышцы стенки тела червей. Используя совместное выражение пресинаптического каналародопсина, стимуляция ацетилхолина от возбуждающих моторных нейронов может быть индуцирована с помощью импульсов синего света, что приводит к деполяризации мышц и воспроизводимым изменениям цитоплазмического кальция Уровней. Два червя иммобилизации методы обсуждаются с различными уровнями сложности. Сравнение этих методов показывает, что оба подхода сохраняют физиологию нервно-мышечного соединения и позволяют воспроизводимую количественную оценку переходных кальция. При сопряжении оптогенетики и функциональной визуализации кальция, изменения в постсинаптической обработки кальция и гомеостаза могут быть оценены в различных мутантных фонов. Представленные данные подтверждают как методы иммобилизации, так и конкретно рассматривают сяосматривает роли C. elegans sarco (endo)plasmic reticular calcium ATPase и кальциевый канал BK калия в регуляции кальция мышцы стенки тела.

Этот метод оценивал изменения в мутантах, как полагают, влияют на обработку кальция или деполяризацию мышц. Базовые уровни флуоресценции и флуоресцентные переходные были визуализированы и отдыхациозного кальция и кинетики кальция в мышцах были оценены. Важно, чтобы ?...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles at JoVE.com

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

Этот метод обеспечивает способ для пары оптогенетики и генетически закодированных датчиков кальция для изображения базовых уровней цитосолика кальция и изменения в вызванных переходных кальция в мышцах стенки тела модельного организма C. elegans.

В Vivo Кальций Imaging в C. elegans мышцы стены тела

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Этот протокол предоставляет два метода для мобилизации C.Elegans для выполнения in vivo кальция изображения мышц стенки тела. Этот метод может помочь ответить на вопросы, связанные с гомеостазом кальция и обработки кальция, а также доступный синапс в генетически урочищеном организме. Этот метод может обеспечить лучшее понимание механизмов, регулирующих гомеостаз кальция мышц, и может, следовательно, иметь важное значение в определении условий или молекулярных путей, которые влияют на возбуждение сокращения связи через неправильное регулирование кальция велосипеде.Эти методы могут дать представление о таких областях исследований, как нейробиология, биология развития и клеточная биология. Эти методы могут быть адаптированы для изучения различных типов клеток и C.elegans, других связанных нематод, а также личинок филсафата. Визуальная демонстрация этого метода имеет решающее значение, так что экспериментатор может понять технику вскрытия, и быть в состоянии точно оценить кальция переходных от правильно обездвиженные животные.Начните с настройки микроскопа для флуоресцентных изображений. Используйте научную камеру CMOS, способную к полной визуализации кадра на 100 герц для того, чтобы отслеживать быстрые изменения уровня кальция. Приобретение камеры управления и светодиодное флуоресцентное возбуждение с микроменеджерным программным обеспечением, работающим в ImageJ.Используйте плагин электронной платформы с открытым исходным кодом, который подключается к внешней доске микроконтроллеров с открытым исходным кодом для управления внешними импульсами синхронизации, которые контролируют флуоресцентные возбуждения. Чтобы контролировать логику синхронизации, активируйте протокол приобретения микроменеджеров в программном обеспечении в соответствии с инструкциями производителей. Используйте два светодиода, чтобы стимулировать родопсин канала с синим светом и записывать изменения RCaMP.Активировать родопсин канала с am LED с пиковой длиной волны приема 470 нанометров и фильтром полосы, и возбудить RCaMP со светодиодом с пиковой длиной волны приема 594 нанометров и фильтром полосы. Совместное освещение обоих светодиодов и передать свет на той же оптической дорожке с помощью дихроического пучка комбайна. Управление сроками светодиодной подсветки с твердотельные переключатели, контролируемые сигналами TTL в соответствии с рукописными направлениями, и установить интенсивность светодиодов с текущей контролируемой нагрузки шума линейных источников питания, а затем запрограммировать синий протокол моделирования света в симулятор.В этом эксперименте включите моделирование синего света после двух секунд захвата RCaMP флуоресценции только и использовать поезд из пяти, двух миллисекунд синий свет импульсов с интервалом 50 миллисекунд для активации родопсин канала. При использовании препарата вскрытия, выполнить C.elegans вскрытия при слабом освещении. Поместите животных в рассечение блюдо с силиконовым покрытием крышки базы, которая наполнена одной миллимоле кальция внеклеточного раствора, подготовленного в соответствии с рукописными указаниями.Клей вниз животных с помощью жидкой актуальной кожи клей с голубой окраской вдоль спинной стороны червя. И сделать боковой разрез кутикулы вдоль клея и червя интерфейс с помощью стеклянных игл. Используйте рот пипетки, чтобы очистить внутренние внутренности от полости червя, а затем склеить кутикулы лоскут животного подвергать брюшной медиальной мышцы стенки тела для визуализации.При использовании нано-шарик подготовки, сделать расплавленный 5%Agra раствор с использованием дистиллированной воды до конечного объема 100 миллилитров. Используйте пипетку Pasteur, чтобы поместить каплю раствора расплавленной Агры на стеклянную горку и сразу же поместить второй стеклянный слайд поверх, используя мягкое давление, чтобы создать даже площадку Agra. Удалите верхнюю горку и примерно на четыре микролитера полистирола нано-бусины к середине колодки.При слабом освещении добавьте четыре-шесть C.elegans в раствор нано-бусины, убедившись, что животные не лежат друг на друге, и осторожно поместите крышку сверху. Когда вы будете готовы к изображению, поместите подготовленный слайд или рассечение блюдо на микроскоп и найти и сосредоточиться на червя, используя 10 раз увеличение и тусклый яркое освещение поля. Переключитесь на 60-е увеличение в флуоресцентном возбуждении RCaMP, чтобы определить медиальной мышцы стенки тела желудочка, которая является передней к вульве и в правильной вокальной плоскости.Затем измените путь изображения от окуляра к камере, вытащив переключатель и нажав в прямом эфире в программном обеспечении для получения данных. Нажмите кнопку ORI в программном обеспечении для сбора данных и создайте коробку вокруг мышцы, на которую основное внимание уделяется. На стимуляторе включите ранее запрограммированный путь стимуляции синего света, а затем нажмите Acquire на программное обеспечение для визуализации, чтобы захватить изображение.Когда C.elegans выращиваются на все-транс сетчатки, успешно включения сетчатки и активации канала родопсин, кальций переходный может быть вызвано. Если животные не подвергаются воздействию все-транс сетчатки нет мышечного кальция переходных срабатывает. Этот протокол был использован для исследования потери функции sca-1 мутантов, которые влияют на саркоплазмический насос кальция reticulum, кодируемый геном sca-1.Но, препарат вскрытия увеличивается в базовых уровнях флуоресценции RCaMP наблюдались у мутанта по сравнению с контролем, предполагая, что мутация нуждается в повышенных уровнях покоя цитоплазмического кальция. Было значительное снижение пиковых уровней кальция в мутантах sca-1 по сравнению с контролем. Тем не менее, никаких изменений не было замечено в поднял пиковое время или половину времени распада.Важно отметить, что аналогичные результаты можно наблюдать с помощью менее технически сложной подготовки нано-шарик. Потеря функции slo-мутантов, которые нарушают кальций активированных больших калийных каналов были оценены для того, чтобы исследовать мутантов, которые косвенно влияют на обработку кальция в C.elegans. При измерении базовых уровней RCaMP мутанты демонстрировали повышенную флуоресценцию по сравнению с управлением.При оценке кинетики переходного кальция не было замечено никаких изменений в пиковых уровнях кальция. Slo-1 (eg142) мутанты, однако, продемонстрировали значительно увеличенный подъем до пикового времени. Самый важный шаг, чтобы помнить при завершении процедуры, чтобы подготовить экспериментальных животных в все-транс сетчатки.Без этого шага родопсин канала будет неактивным, предотвращая свет индуцированных переходных кальция от срабатывания. После этой процедуры, электрофизиология и поведенческий анализ может быть сделано для оценки функционального воздействия любых наблюдаемых изменений в гомеостаз кальция. Используя методы иммобилизации, изложенные здесь, прокладывает путь для дальнейшего исследования динамики кальция и демонстрирует, что сопоставимые результаты могут наблюдаться в ответ на оптогенетической стимуляции нейронов и захвата мышечного кальция переходных с использованием гораздо менее сложной техники иммобилизации бисера.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Обнаружение рН-зависимой активности<em&gt; Кишечная палочка</em&gt; Сопровождающий HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; и<em&gt; В Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Combining Raman Imaging and Multivariate Analysis to Visualize Lignin, Cellulose, and Hemicellulose in the Plant Cell Wall

Объединение рамановских изображений и многофакторного анализа для визуализации лигнина, целлюлозы и гемицеллюлозы в стенке клетки растения

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The ...

Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics

Подготовка гидролизат кератина от куриные перья и его применение в косметике

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Структурные характеристики Маннан полисахаридов клеточной стенки в растений с использованием ПАСЕ

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Растущий белок кристаллы с отдельных измерений с помощью автоматизированных кристаллизации, в сочетании с в Situ Динамическое рассеяние света

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

Колориметрический метод измерения содержания железа в растениях

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Калибровка бесплатно в Vitro количественная оценка белка гомо олигомеризации с использованием коммерческих приборов и свободным, открытым исходным кодом программное обеспечение для анализа яркости

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

Определение активности фосфолипазы C в мозг огневки от пчелы

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

В Vivo Hydroxyl радикальный белок следдля изучения взаимодействия белков в Caenorhabditis elegans

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Характеристика амилоидных структур в старении C. Elegans использованием флуоресценции пожизненной визуализации

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...