Name: in vivo calcium imaging in c. elegans body wall muscles
Uploaded: 2019-10-20T12:30:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles at JoVE.com

Författarna tackar Dr Alexander Gottschalk för ZX1659, den RCaMP och channelrhodopsin innehåller masken stam, Dr Hongkyun Kim för SLO-1 (eg142) Worm stam, och den nationella Bioresource projektet för SCA-1 (tm5339) Worm stam.

1. inställning av Mikroskop
<ol><li>Använd ett sammansatt Mikroskop med fluorescensförmåga. För denna studie, data samlades in på ett upprätt Mikroskop (tabell över material) försedd med lysdioder för excitation.</li>
	<li>För att korrekt visualisera fluorescens förändringar i kroppen väggen muskler, använda en hög förstoring mål.<ol>
<li>För dissekerade preparat, Använd en 60x NA 1,0 vatten nedsänkning mål (tabell över material).</li>
		<li>För preparat med nan...

<ol>
	<li>Nakai, J., Ohkura, M., Imoto, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+high+signal-to-noise+Ca2++probe+composed+of+a+single+green+fluorescent+protein.">A high signal-to-noise Ca2+ probe composed of a single green fluorescent protein.</a> Nature Biotechnology. 19 (2), 137-141 (2001).</li><li>Akerboom, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetically+encoded+calcium+indicators+for+multi-color+neural+activity+imaging+and+combination+with+optogenetics.">Genetically encoded calcium indicators for multi-color neural activity imaging and combination with optogenetics.</a> Frontiers in Molecular Neuroscience. 6, 1-29 (2013).</li><li>Nagel, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+Activation+of+Channelrhodopsin-2+in+Excitable+Cells+of+Caenorhabditis+elegans+Triggers+Rapid+Behavioral+Responses.">Light Activation of Channelrhodopsin-2 in Excitable Cells of Caenorhabditis elegans Triggers Rapid Behavioral Responses.</a> Current Biology. 15 (24), 2279-2284 (2005).</li><li>Liewald, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optogenetic+analysis+of+synaptic+function.">Optogenetic analysis of synaptic function.</a> Nature Methods. 5 (10), 895-902 (2008).</li><li>Fang-Yen, C., Gabel, C. V., Samuel, A. D. T., Bargmann, C. I., Avery, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+Microsurgery+in+Caenorhabditis+elegans.">Laser Microsurgery in Caenorhabditis elegans.</a> Methods Cell Biology. 107, 177-206 (2012).</li><li>Lewis, J. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cholinergic+Receptor+Mutants+of+the+Nematode+Caenorhabditis+elegans.">Cholinergic Receptor Mutants of the Nematode Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Neuroscience. 7 (10), 3059-3071 (1987).</li><li>Lewis, J. A., Wu, C. H., Berg, H., Levine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+genetics+of+levamisole+resistance+in+the+nematode+Caenorhabditis+elegans.">The genetics of levamisole resistance in the nematode Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 95 (4), 905-928 (1980).</li><li>Richmond, J. E., Jorgensen, E. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=One+GABA+and+two+acetylcholine+receptors+function+at+the+C.+elegans+neuromuscular+junction.">One GABA and two acetylcholine receptors function at the C. elegans neuromuscular junction.</a> Nature Neuroscience. 9, 791-798 (1999).</li><li>Kim, E., Sun, L., Gabel, C. V., Fang-Yen, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long-Term+Imaging+of+Caenorhabditis+elegans+Using+Nanoparticle-Mediated+Immobilization.">Long-Term Imaging of Caenorhabditis elegans Using Nanoparticle-Mediated Immobilization.</a> PLoS ONE. 8 (1), 1-6 (2013).</li><li>Edelstein, A., Amodaj, N., Hoover, K., Vale, R., Stuurman, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Computer+control+of+microscopes+using+umanager.">Computer control of microscopes using umanager.</a> Current Protocols in Molecular Biology. (Suppl 92), 1-17 (2010).</li><li>Richmond, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dissecting+and+Recording+from+The+C.+Elegans+Neuromuscular+Junction.">Dissecting and Recording from The C. Elegans Neuromuscular Junction.</a> Journal of Visualized Experiments. (24), 1-4 (2009).</li><li>Hoon Cho, J., Bandyopadhyay, J., Lee, J., Park, C. S., Ahnn, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+isoforms+of+sarco/endoplasmic+reticulum+calcium+ATPase+(SERCA)+are+essential+in+Caenorhabditis+elegans.">Two isoforms of sarco/endoplasmic reticulum calcium ATPase (SERCA) are essential in Caenorhabditis elegans.</a> Gene. 261, 211-219 (2000).</li><li>Zwaal, R. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Sarco-Endoplasmic+Reticulum+Ca2++ATPase+Is+Required+for+Development+and+Muscle+Function+in+Caenorhabditis+elegans.">The Sarco-Endoplasmic Reticulum Ca2+ ATPase Is Required for Development and Muscle Function in Caenorhabditis elegans.</a> The Journal of Biological Chemistry. 276 (47), 43557-43563 (2001).</li><li>Stammers, A. N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+regulation+of+sarco(endo)plasmic+reticulum+calcium-ATPases+(SERCA).">The regulation of sarco(endo)plasmic reticulum calcium-ATPases (SERCA).</a> Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. 93, 1-12 (2015).</li><li>Clapham, D. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Calcium+Signaling.">Calcium Signaling.</a> Cell. 131, 1047-1058 (2007).</li><li>Hovnanian, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serca+pumps+and+human+diseases.">Serca pumps and human diseases.</a> Calcium Signalling and Disease: Molecular Pathology of Calcium. , 337-363 (2007).</li><li>Periasamy, M., Kalyanasundaram, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SERCA+pump+isoforms:+Their+role+in+calcium+transport+and+disease.">SERCA pump isoforms: Their role in calcium transport and disease.</a> Muscle and Nerve. 35 (4), 430-442 (2007).</li><li>Gehlert, S., Bloch, W., Suhr, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ca2+-Dependent+Regulations+and+Signaling+in+Skeletal+Muscle:+From+Electro-Mechanical+Coupling+to+Adaptation.">Ca2+-Dependent Regulations and Signaling in Skeletal Muscle: From Electro-Mechanical Coupling to Adaptation.</a> International Journal of Molecular Sciences. 16, 1066-1095 (2015).</li><li>Martin, A. A., Richmond, J. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+sarco(endo)plasmic+reticulum+calcium+ATPase+SCA-1+regulates+the+Caenorhabditis+elegans+nicotinic+acetylcholine+receptor+ACR-16.">The sarco(endo)plasmic reticulum calcium ATPase SCA-1 regulates the Caenorhabditis elegans nicotinic acetylcholine receptor ACR-16.</a> Cell Calcium. 72, 104-115 (2018).</li><li>Wang, Z., Saifee, O., Nonet, M. L., Salkoff, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SLO-1+Potassium+Channels+Control+Quantal+Content+of+Neurotransmitter+Release+at+the+C.+elegans+Neuromuscular+Junction.">SLO-1 Potassium Channels Control Quantal Content of Neurotransmitter Release at the C. elegans Neuromuscular Junction.</a> Neuron. 32, 867-881 (2001).</li><li>Abraham, L. S., Oh, H. J., Sancar, F., Richmond, J. E., Kim, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+Alpha-Catulin+Homologue+Controls+Neuromuscular+Function+through+Localization+of+the+Dystrophin+Complex+and+BK+Channels+in+Caenorhabditis+elegans.">An Alpha-Catulin Homologue Controls Neuromuscular Function through Localization of the Dystrophin Complex and BK Channels in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS Genetics. 6 (8), 1-13 (2010).</li><li>Gourgou, E., Chronis, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+induced+oxidative+stress+affects+ASH+neuronal+function+and+behavior+in+C.+elegans.">Chemically induced oxidative stress affects ASH neuronal function and behavior in C. elegans.</a> Scientific Reports. 6, 1-9 (2016).</li><li>Zahratka, J. A., Williams, P. D. E., Summers, P. J., Komuniecki, R. W., Bamber, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Serotonin+differentially+modulates+Ca2++transients+and+depolarization+in+a+C.+elegans+nociceptor.">Serotonin differentially modulates Ca2+ transients and depolarization in a C. elegans nociceptor.</a> Journal of Neurophysiology. 113 (4), 1041-1050 (2015).</li><li>Kerr, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optical+imaging+of+calcium+transients+in+neurons+and+pharyngeal+muscle+of+C.+elegans.">Optical imaging of calcium transients in neurons and pharyngeal muscle of C. elegans.</a> Neuron. 26 (3), 583-594 (2000).</li><li>Nekimken, A. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pneumatic+stimulation+of+C.+elegans+mechanoreceptor+neurons+in+a+microfluidic+trap.">Pneumatic stimulation of C. elegans mechanoreceptor neurons in a microfluidic trap.</a> Lab Chip. 17 (6), 1116-1127 (2017).</li><li>Chung, S. H., Sun, L., Gabel, C. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+Neuronal+Calcium+Imaging+in+C.+elegans.">In vivo Neuronal Calcium Imaging in C. elegans.</a> Journal of Visualized Experiments. (74), 1-9 (2013).</li><li>Jospin, M., Jacquemond, V., Mariol, M. C., S&#233;galat, L., Allard, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+L-type+voltage-dependent+Ca2+channel+EGL-19+controls+body+wall+muscle+function+in+Caenorhabditis+elegans.">The L-type voltage-dependent Ca2+channel EGL-19 controls body wall muscle function in Caenorhabditis elegans.</a> Journal of Cell Biology. 159 (2), 337-347 (2002).</li><li>Wabnig, S., Liewald, J. F., Yu, S., Gottschalk, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-Throughput+All-Optical+Analysis+of+Synaptic+Transmission+and+Synaptic+Vesicle+Recycling+in+Caenorhabditis+elegans.">High-Throughput All-Optical Analysis of Synaptic Transmission and Synaptic Vesicle Recycling in Caenorhabditis elegans.</a> PLoS ONE. , 1-26 (2015).</li></ol>

GECIs är ett kraftfullt verktyg i C. elegans neurobiologi. Tidigare arbete har utnyttjat kalcium avbildning tekniker för att undersöka en mängd olika funktioner i både nervceller och muskelceller, inklusive sensoriska och beteendemässiga svar, med olika metoder för stimulering. Vissa studier har använt kemiska stimuli för att utlösa kalcium transienter i sensoriska aska nervceller22,23 eller inducera kalcium vågor i faryngeal muskler<sup class...

Denna uppsats presenterar metoder för in vivo kalcium avbildning av C. elegans kropps vägg muskler med hjälp av optogenetisk neuronala stimulering. Para ihop en muskel uttryckt genetiskt kodade kalcium indikator (GECI) med blått ljus utlöses neuronala depolarisering och ger ett system för att tydligt Observera den framkallade postsynaptiska kalcium transienter. Detta undviker användning av elektrisk stimulering, vilket möjliggör en icke-invasiv analys av mutanter som påverkar postsynaptiska kalciumdynamiken.
Single-fluorophore GECIs, såsom GCaMP, använder en enda fluorescerande proteinmolekyl smält till M13 domän myosin ljus kedjans Kinas vid dess N-terminalen slutet och calmodulin (CaM) vid C-Terminus. Vid kalcium bindning genomgår CaM-domänen, som har en hög affinitet för kalcium, en konformationsförändring som inducerar en efterföljande konformationsförändring i det fluorescerande proteinet som leder till en ökning av fluorescensintensiteten1. Gcamp fluorescens är upphetsad på 488 nm, vilket gör det olämpligt att användas tillsammans med channelrhodopsin, som har en liknande excitation våglängd på 473 nm. Således, för att par kalcium mätningar med channelrhodopsin stimulering, den gröna fluorescerande protein av GCaMP måste ersättas med ett rött fluorescerande protein, mRuby (RCaMP). Med hjälp av muskeln uttryckte RCaMP, i kombination med den kolinerga motoriska neuron uttrycket av channelrhodopsin, tillstånd studier vid masken neuromuskulära korsningen (NMJ) med samtidig användning av optogenetik och funktionell avbildning inom samma djur 2.
Användningen av channelrhodopsin kringgår behovet av elektrisk stimulering för att depolarisera de neuromuskulära korsningar av C. elegans, som endast kan uppnås i dissekerade preparat, vilket gör denna teknik både lättare att anställa och mer exakt När du riktar in dig på specifika vävnader. Till exempel har channelrhodopsin tidigare använts i C. elegans för att reversibelt aktivera specifika nervceller, vilket leder till antingen robust aktivering av excitatoriska eller hämmande neuroner3,4. Användningen av ljusstimulerad depolarisering kringtar också frågan om neuronala skador på grund av den direkta elektriska stimulering. Detta ger en möjlighet att undersöka effekterna av många olika stimulans protokoll, inklusive ihållande och upprepade stimuleringar, på postsynaptisk kalcium dynamik4.
Den genomskinliga karaktären hos C. elegans gör den idealisk för den fluorescerande Imaging funktionella analysen. Emellertid, när stimulera excitatoriska acetylkolin neuroner vid NMJ, djur förväntas svara med en omedelbar muskelkontraktion4, att göra immobilisering av maskar kritisk i visualisera diskreta kalcium förändringar. Traditionellt har farmakologiska medel använts för att paralysera djuren. En sådan drog som används är levamisole, en kolinerg acetylkolinreceptoragonist5,6,7. Eftersom Levamisol leder till ihållande aktivering av en subtyp av excitatoriska muskel receptorer, denna reagens är olämplig för studiet av muskeln kalcium dynamik. Effekten av Levamisol inducerar postsynaptisk depolarisering, upplyser cytosoliska kalcium, och ockluderande observationer efter presynaptisk stimulering. För att undvika användning av paralyserande läkemedel undersökte vi två alternativa metoder för att immobilisera C. elegans. Djuren var antingen limmade ner och sedan dissekeras öppna för att exponera kroppen väggen muskler, liknande den befintliga C. elegans NMJ elektrofysiologi metod8, eller nanobeads användes för att immobilisera intakt djur9. Båda förfarandena tillåts för reproducerbara mätningar av vilande och framkallade muskel kalcium transienter som var lätt kvantifierbara.
Metoderna i detta papper kan användas för att mäta baslinjen cytosoliska kalciumnivåer och transienter i postsynaptiska kroppen väggen muskelceller i C. elegans. Exempel på data som sysselsätter de två olika immobiliseringsteknikerna ges. Båda teknikerna utnyttjar optogenetik för att depolarisera muskelcellerna utan användning av elektrisk stimulering. Dessa exempel visar genomförbarheten av denna metod för att utvärdera mutationer som påverkar postsynaptiska kalcium hantering i maskar och påpeka för-och nackdelar med de två immobilisering metoder.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>all-trans retinal</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>R2500</td>
			<td>Necessary for excitation of channel rhodopsin</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Amber LED</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>RCaMP illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arduino UNO</td>
			<td>Mouser</td>
			<td>782-A000066</td>
			<td>Controls fluorescence illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Blue LED</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>channelrhodopsin illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BX51WI microscope</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Fixed state compound microscope</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Current controlled low noise linear power supply</td>
			<td>Ametek</td>
			<td>Sorenson</td>
			<td>Controls LED intensity</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Igor Pro</td>
			<td>Wavemetrics</td>
			<td>Wavemetrics.com</td>
			<td>Graphing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>ImageJ</td>
			<td>NIH</td>
			<td>imagej.nih.gov</td>
			<td>Image processing software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>LUMFLN 60x water NA 1.4</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Water immersion objective for dissected preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Master-8 Stimulator</td>
			<td>A.M.P.I</td>
			<td></td>
			<td>Master timer for image acquisition and LED illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Micro-Manager</td>
			<td></td>
			<td>micro-manager.org</td>
			<td>Controls camera acquisition and LED excitiation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microsoft Excel</td>
			<td>Microsoft</td>
			<td></td>
			<td>Spreadsheet software</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>pco.edge 4.2 CMOS camera</td>
			<td>pco.</td>
			<td>4.2</td>
			<td>High-speed camera</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PlanApo N 60x oil NA 1.4</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td>Oil immersion objective for nanobead preparation</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Polybead microspheres</td>
			<td>Polysciences, Inc.</td>
			<td>00876-15</td>
			<td>For worm immobilization</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>solid state switches</td>
			<td>Sensata Technologies</td>
			<td>Crydom CMX100D6</td>
			<td>Controls timing of LED illumination</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic strain, sca-1(tm5339); [zxIs6{Punc17::chop-2 
			(h134R)::yfp,lin-15(+)}; 
			Pmyo3::RCaMP35]</td>
			<td>Richmond Lab</td>
			<td>SY1627</td>
			<td>Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with SERCA mutant allele</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgenic strain, slo-1 (eg142); [zxIs6{Punc17::chop-2 
			(h134R)::yfp,lin-15(+)}; 
			Pmyo3::RCaMP35]</td>
			<td>Richmond Lab</td>
			<td></td>
			<td>Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line with calcium-activated BK potassium channel mutant allele</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Transgeneic strain, [zxIs6{Punc17::chop-2 
			(h134R)::yfp,lin-15(+)}; 
			Pmyo3::RCaMP35]</td>
			<td>Gottschalk Lab</td>
			<td>ZX1659</td>
			<td>Excitatory neuronal channelrhodopsin and body wall muscle RCaMP expressing worm line</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo calcium imaging in c. elegans body wall muscles

Modellorganismen C. elegans ger ett utmärkt system för att utföra in vivo kalcium avbildning. Dess transparenta kropp och genetiska manipulabilitet möjliggör riktat uttryck för genetiskt kodade kalcium sensorer. Detta protokoll beskriver användningen av dessa sensorer för in vivo avbildning av kalciumdynamik i riktade celler, särskilt kroppen vägg musklerna i maskar. Genom att utnyttja Co-uttrycket av presynaptiska channelrhodopsin, stimulering av acetylkolin frisättning från excitatoriska motoriska nervceller kan induceras med hjälp av blått ljuspulser, vilket resulterar i muskel depolarisering och reproducerbara förändringar i cytoplasmiska kalcium Nivåer. Två mask immobilisering tekniker diskuteras med varierande svårighetsgrader. Jämförelse av dessa tekniker visar att båda metoderna bevara fysiologi den neuromuskulära korsningen och möjliggöra reproducerbara kvantifiering av kalcium transienter. Genom att para ihop optogenetik och funktionell kalcium avbildning kan förändringar i postsynaptisk kalcium hantering och homeostas utvärderas i olika mutantbakgrunder. Data som presenteras validerar både immobilisering tekniker och specifikt undersöker rollerna för C. elegans Sarco (endo) plasmatiska retikulär kalcium ATPas och kalcium-aktiverad BK kalium kanal i kroppen vägg muskel kalcium reglering.

Denna teknik utvärderade förändringar i mutanter tros påverka kalcium hantering eller muskel depolarisering. Baslinjefluorescensnivåer och fluorescerande transienter visualiserades och vilande cytosoliskt kalcium och kalciumkinetik i muskeln utvärderades. Det är viktigt att djuren odlades på all-trans retinal i minst tre dagar för att säkerställa en lyckad inkorporering av retinal, och därmed därefter Aktivera channelrhodopsin (figur 2A</...

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles at JoVE.com

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

Denna metod ger ett sätt att par optogenetik och genetiskt kodade kalcium sensorer till bild baslinje cytosoliska kalciumnivåer och förändringar i framkallade kalcium transienter i kroppen väggen musklerna i modellorganismen C. elegans.

In vivo kalcium avbildning i C. elegans kropps vägg muskler

The model organism C. elegans provides an excellent system to perform in vivo calcium imaging. Its transparent body and genetic manipulability allow for ...

Detta protokoll ger två metoder för att mobilisera C.elegans att utföra in vivo kalcium avbildning av kroppen vägg muskler. Denna metod kan hjälpa till att besvara frågor relaterade till kalciumhomeostas och kalciumhantering, och en tillgänglig synaps i genetiskt tractable organism. Denna teknik kan ge en bättre förståelse av de mekanismer som reglerar muskelkalcium homeostas, och kan därför vara viktigt att identifiera villkor eller molekylära vägar som påverkar excitation kontraktionskoppling genom felreglering av kalcium cykling.Dessa metoder kan ge insikt i forskningsområden inklusive, men inte begränsat alltför, neurobiologi, utvecklingsbiologi, och cellbiologi. Dessa tekniker skulle kunna anpassas för att studera en mängd olika celltyper och C.elegans, andra relaterade nematoder samt filsafatlarver. Visuell demonstration av denna metod är kritisk så att experimentören kan förstå dissektionstekniken, och kunna exakt bedöma kalciumtransienter från korrekt immobiliserade djur.Börja med att ställa upp mikroskopet för fluorescerande avbildning. Använd en vetenskaplig CMOS-kamera som kan ta fram full frame imaging vid 100 hertz för att kunna spåra snabba förändringar i kalciumnivåerna. Styr kamera förvärv och LED lysrörsupplysning med en micromanager programvara som körs i ImageJ.Använd en opensource elektronisk plattform plug-in som ansluter till en extern opensource mikrokontroller ombord för att hantera den externa timing pulser som styr fluorescerande exciteringar. För att styra timing logik, aktivera micromanager förvärv protokollet i programvaran enligt tillverkare instruktioner. Använd två lysdioder för att stimulera kanal rhodopsin med blått ljus och spela in RCaMP förändringar.Aktivera kanal rhodopsin med am LED med topp admission våglängd av 470 nanometer och en bandpass filter, och excitera RCaMP med en LED med en topp entré våglängd av 594 nanometer och ett bandpass filter. Co-illuminate både lysdioder och överföra ljuset till samma optiska bana med hjälp av en dichroic beam combiner. Styr tidpunkten för LED-belysningen med ett fast tillståndsbrytare som styrs av TTL-signaler enligt manuskriptriktningar, och ställ in LED-intensiteten med den aktuella kontrollerade belastningsbruslinärströmningen, programmera sedan in det blåljussimuleringsprotokollet i en simulator.I detta experiment slå på blåljus simuleringen efter två sekunder att fånga RCaMP fluorescens bara och använda ett tåg på fem, två millisekkunder blått ljus pulser med 50 millisekkunder intervall för att aktivera kanal rhodopsin. Om du använder dissektionsberedningen, utför C.elegans-dissektion i svagt ljus. Placera djuren i dissektionsfatet med den silikonbelagda täckbasen som är fylld med en millimol av kalcium extracellulär lösning beredd enligt manuskriptriktningar.Lim ner djuren med hjälp av flytande aktuella hudlim med blå färgning längs dorsala sidan av masken. Och gör ett lateralt nagelbandssnitt längs lim- och maskgränssnittet med hjälp av glasnålar. Använd en munpipett för att rensa den inre inälvorna från maskhålan, lim sedan ner nagelbandsluckan hos djuret för att exponera den ventrala mediala kroppsväggen muskler för bildbehandling.Om du använder nano-pärla beredning, gör en smält 5%Agra lösning med hjälp av destillerat vatten till en slutlig volym av 100 milliliter. Använd en Pasteurpipett för att placera en droppe smält-Agra-lösning på en glasrutschbana och placera omedelbart en andra glasrutschbana över toppen med försiktigt tryck för att skapa en jämn Agras dyna. Ta bort den övre bilden och vid cirka fyra mikroliter av polystyren nano-pärlor till mitten av dynan.I svagt ljus tillsätt fyra till sex C.elegans i nano-pärlor lösning, se till att djuren inte lägger ovanpå varandra, och försiktigt placera en täckskydd ovanpå. När du är klar att avbilda, placera den förberedda diabilds- eller dissektionsskålen på mikroskopet och hitta och fokusera på en mask med hjälp av 10 gångers förstoring och dim bright field illumination. Byt till 60 gånger förstoring i RCaMP fluorescerande excitation för att identifiera en ventrum mediala kroppen väggen muskel som är främre till vulva och i rätt sång plan.Ändra sedan bilden vägen från okularet till kameran genom att dra ut växla och klicka live inom datainsamling programvara. Klicka på ORI-knappen i datainsamlingsprogramvaran, och skapa en ruta runt muskeln som fokuseras på. På stimulator, slå på den tidigare programmerade blå ljus stimulering väg, klicka sedan Förvärva på bildhanteringsprogram för att fånga bilden.När C.elegans odlas på all-trans retinal, framgångsrikt införliva retinal och aktivera kanalen rhodopsin, en kalcium övergående kan framkallas. Om djur inte utsätts för all-trans retinal ingen muskel kalcium övergående utlöses. Detta protokoll användes för att undersöka förlust av funktionen SCA-1 mutanter, som påverkar sarcoplasmic reticulum kalcium pumpen kodas av sca-1 genen.Men dissekering beredningen ökar i baslinjen nivåer av RCaMP fluorescens observerades i mutant jämfört med kontrollen, vilket tyder på att mutationen behöver de förhöjda nivåerna av vilande cytoplasmatisk kalcium. Det fanns en betydande minskning av topp kalcium nivåer i sca-1 mutanter jämfört med kontrollen. Emellertid sågs ingen ändring i den uppstämda maximala tiden eller den halva förfallatiden.Viktigt, liknande resultat kan observeras med hjälp av mindre tekniskt utmanande nano-pärla förberedelse. Förlust av funktion slo-mutanter, som stör kalcium aktiverade stora kaliumkanaler utvärderades för att undersöka mutanter som indirekt påverkar kalcium hantering i C.elegans. När baslinjenivåerna av RCaMP mättes mutanterna visas ökad fluorescens jämfört med kontrollerna.När man utvärderar kinetiken av kalcium övergående inga förändringar i topp kalciumnivåer sågs. Den slo-1(eg142) mutanter, dock uppvisade en betydligt ökad stiga till topp tid. Det viktigaste steget att komma ihåg när du slutför proceduren är att redo försöksdjur i all-trans retinal.Utan detta steg kanalen rhodopsin kommer att vara inaktiv, förhindra ljus inducerad kalcium transienter utlöses. Efter detta förfarande, elektrofysiologi och beteendeanalys kan göras för att utvärdera den funktionella inverkan av eventuella observerade förändringar i kalcium homeostas. Med hjälp av immobilisering metoder som beskrivs här, banar väg för ytterligare utforskning av kalcium dynamik och visar att jämförbara resultat kan observeras som svar på optogenetiska neuronal stimulering och fångst av muskel kalcium transienter med hjälp av betydligt mindre utmanande pärla immobilisering teknik.

Research

JoVE Journal

Biochemistry

In Vivo Calcium Imaging in C. elegans Body Wall Muscles

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detection of the pH-dependent Activity of Escherichia coli Chaperone HdeB In Vitro and In Vivo

Detektering av den pH-beroende aktivitet för<em&gt; Escherichia coli</em&gt; Chaperone HdeB<em&gt; In Vitro</em&gt; och<em&gt; In Vivo</em

Bacteria are frequently exposed to environmental changes, such as alterations in pH, temperature, redox status, light exposure or mechanical force. Many ...

Combining Raman Imaging and Multivariate Analysis to Visualize Lignin, Cellulose, and Hemicellulose in the Plant Cell Wall

Kombinera Raman Imaging och Multivariate Analysis för att visualisera Lignin, Cellulosa och Hemicellulosa i växtcellsväggen

The application of Raman imaging to plant biomass is increasing because it can offer spatial and compositional information on aqueous solutions. The ...

Preparation of Keratin Hydrolysate from Chicken Feathers and Its Application in Cosmetics

Beredning av Keratin hydrolysat från kyckling fjädrar och dess tillämpning i kosmetika

Keratin hydrolysates (KHs) are established standard components in hair cosmetics. Understanding the moisturizing effects of KH is advantageous for ...

Structural Characterization of Mannan Cell Wall Polysaccharides in Plants Using PACE

Strukturell karaktärisering av Mannan cellväggen polysackarider i anläggningar som använder takt

Plant cell wall polysaccharides are notoriously difficult to analyze, and most methods require expensive equipment, skilled operators, and large amounts ...

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Growing Protein Crystals with Distinct Dimensions Using Automated Crystallization Coupled with In Situ Dynamic Light Scattering

Växande proteinkristaller med olika dimensioner med automatiserad kristallisering tillsammans med In Situ det dynamiska ljusspridning

The automated crystallization device is a patented technique1 especially developed for monitoring protein crystallization experiments with the aim to ...

A Colorimetric Method for Measuring Iron Content in Plants

En kolorimetrisk metod för att mäta järnhalten i växter

Iron, one of the most important micronutrients in living organisms, is involved in basic processes, such as respiration and photosynthesis. Iron content ...

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Calibration-free In Vitro Quantification of Protein Homo-oligomerization Using Commercial Instrumentation and Free, Open Source Brightness Analysis Software

Kalibrering-gratis In Vitro kvantifiering av Protein Homo-oligomerisering använder kommersiella instrumentering och fri, öppen källkod ljusstyrka analys programvara

Number and brightness is a calibration-free fluorescence fluctuation spectroscopy (FFS) technique for detecting protein homo-oligomerization. It can be ...

Detection of Phospholipase C Activity in the Brain Homogenate from the Honeybee

Påvisande av fosfolipas C aktivitet i hjärnan Homogenatet från honungsbiet

The honeybee is a model organism for evaluating complex behaviors and higher brain function, such as learning, memory, and division of labor. The mushroom ...

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans

In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans In Vivo Hydroxyl Radical Protein Footprinting for the Study of Protein Interactions in Caenorhabditis elegans In Vi

Fast oxidation of proteins (FPOP) is a hydroxyl radical protein footprinting (HRPF) method used to study protein structure, protein-ligand interactions, ...

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Characterization of Amyloid Structures in Aging C. Elegans Using Fluorescence Lifetime Imaging

Karakterisering av amyloidstrukturer i åldrande C. Elegans med fluorescenslivslängd imaging

Amyloid fibrils are associated with a number of neurodegenerative diseases such as Huntington&#39;s, Parkinson&#39;s, or Alzheimer&#39;s disease. These ...