Name: using nanoplasmon-enhanced scattering and low-magnification microscope imaging to quantify tumor-derived exosomes
Uploaded: 2019-05-24T13:00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Nanoplasmon-Enhanced Scattering and Low-Magnification Microscope Imaging to Quantify Tumor-Derived Exosomes at JoVE.com

Het werk werd voornamelijk ondersteund door onderzoek financiering die door NIH (U01CA214254, R01HD090927, R01AI122932, R01AI113725 en R21Al126361-01), Arizona biomedisch onderzoekcommissie (ABRC) Young Investigator Award.

1. voorbereiding van nanodeeltjes sondes
Opmerking: deze test maakt gebruik van gefunctioneerde goud nanorods (AuNRs; 25 nm diameter x 71 nm lengte) die zijn polyvalent vervoegd met neutravidin polymeren (AV) en hebben een oppervlakte Plasmon resonantie piek die een rode (641 nm piek) verstrooiing signaal produceert op DFM Verlichting.
<ol><li>Was 40 µ L van AuNR-AV (2,56 x 1011 deeltjes) drie keer met 200 µ l PBS (pH 7,0) door centrifugeren en aspiratie (8.500 x g bij 4 °c gedurende 10 minuten), gevolgd door een definitieve centrifuge en aspiratie stap waarna de AuNR-AV-pellet is geschorst in 40 µ L PBS.</li>
	<li>Meng deze AuNR-AV suspensie met 10 µ L biotinylated antilichaam (0,5 mg/mL) specifiek voor een antigeen op het oppervlak van de exosoom subtype van belang en 150 µ L van PBS en meng bij 4 ° c voor 2 h met behulp van een mixer om neutravidin-Biotine binding om de voltooiing te bereiken.</li>
	<li>Was het resulterende antilichaam-geconjugeerde AuNRs (AuNR-IgG) drie keer door centrifugeren en aspiratie (6.500 x g bij 4 °c 10 minuten), en dan opschorten hen in 200 µ l PBS en bewaar hen bij 4 °c tot gebruik. Opmerking: steriele techniek en korte opslagtijden moeten worden gebruikt om verontreiniging en degradatie van de AuNR-IgG te voorkomen. Het is best om antilichaam-geconjugeerde AuNRs binnen 24 uren van hun vervoeging te gebruiken.</li>
</ol>2. voorbereiding van EV Capture dia's
<ol><li>Verdun geselecteerde exosoom Vang antilichamen aan 0,025 mg/mL in PBS en voeg 1 µ L/put van deze verdunning op een multi-well proteïne A/G dia toe, en dan Incubeer deze dia bij 37 °C voor 1 h in een bevochtigde kamer om vangst antilichamen te toestaan verbindend aan proteïne A/G immobiled op de dia.</li>
	<li>Aspireren putten om ongebonden antilichamen te verwijderen, en was putten drie keer door de toevoeging en de aspiratie van 1 µ L/well van PBS, laadt dan elk goed met 1 µ L van blokkerende buffer (Zie lijst van materialen) en Incubeer de dia voor 2 h bij 37 °c in een bevochtigde kamer aan b Vergrendel alle resterende eiwitbinding sites.</li>
	<li>Aspireren Wells te verwijderen blokkering buffer, wassen putten drie keer door de toevoeging en aspiratie van 1 µ L/put van PBS, en onmiddellijk gebruik maken van de geblokkeerde dia's voor exosoom vastleggen en analyse.</li>
</ol>3. standaard curve voorbereiding
<ol><li>Om de absolute of relatieve overvloed van een specifiek exosoom subtype nauwkeurig te kwantificeren, moet de gebruiker een standaardkromme met een zuivere exosoom bevolking produceren die uniform de exosoom oppervlakte biomarker van belang uitdrukt. Deze studie analyseert de overvloed van exosomes het uitdrukken van een metastase-geassocieerde membraanproteïne, Ephrin a2 receptor, die een gemelde verhouding met alvleesklier-kanker stadium en prognose6,18heeft. Opmerking: de menselijke alvleesklierkanker cel lijn PANC-1 en de exosomes is bekend dat dit eiwit en geïsoleerde exosomes uit deze cel lijn te uiten werden gebruikt om een standaard curve te genereren om het aantal exosomes dat deze eiwitten Express in complexe exosoom te kwantificeren Monsters.</li>
	<li>De cellen van de cultuur voor 48 uren bij 37 °C in serum-vrije cultuurmedia om exosoom accumulatie in de media toe te staan, dan de supernatants van de cel cultuur door centrifugeren van opschortings culturen of directe aspiratie van cultuurmedia van aanhangende cel culturen te isoleren.</li>
	<li>Centrifugeer de verzamelde media bij 2000 x g voor 30 min om puin te verwijderen en de bovendrijvende terug te krijgen.</li>
	<li>Filtreer de verduidelijkte cultuur bovendrijvende door een 0,45 µm laag proteïne bindende filtereenheid van aangewezen capaciteit (b.v. een 250 mL polyethersulfone vacuümfiltratie eenheid).</li>
	<li>Concentraat de resulterende filtraat door centrifugeren op 3200 x g met behulp van een 100.000 nominale molecuulgewicht limietfilter systeem om een 250 µ l Final volume. Verzamel het ingehouden volume van dit filter, dan was het filter met 200 µ L PBS, en combineer dit wassen volume met de verzamelde exosoom sample volume.</li>
	<li>Centrifugeer deze steekproef bij 21.000 x g voor 45 notulen en herstel zorgvuldig de bovendrijvende, verzorgend om geen gestort materiaal te verzamelen.</li>
	<li>Centrifugeer de teruggewonnen bovendrijvende bij 100.000 x g 3 uren om de exosomes te neerslaan. Aspireren weg de bovendrijvende en het verzamelen van de exosoom pellet in 100 µ L PBS.</li>
	<li>Bewaar de resulterende exosoom suspensies bij 4 °C indien gebruikt binnen 24 uur of bij-80 °C voor lange termijn opslag. Opmerking: niet onderworpen exosoom monsters te herhalen Freeze-ontdooicycli.</li>
	<li>Kwantificeren van een hoeveelheid van de exosoom schorsing na het mengen door directe meting van exosoom nummers (bijvoorbeeld door nanodeeltjes tracking analyse of tunable resistieve puls sensing of door het meten van de eiwitconcentratie van exosoom lysaten door micro-bicinchoninic zure analyse, of een gelijkwaardige methode, als middel om exosoom hoeveelheid te benaderen16,19.</li>
	<li>Genereer een reeks seriële verdunningen van de exosoom suspensie om de vergelijking van nanodeeltjes signaal naar input exosoom aantal of eiwitgehalte mogelijk te maken.</li>
	<li>Breng 1 µ L van elke exosoom-norm over aan elk van zijn herhalings putten op de assay plaat. Opmerking: standaard krommen kunnen worden gebruikt om de helling van de correlatie lijn tussen nanodeeltjes signaal en exosoom concentratie te berekenen tot (1) de Testprestaties te evalueren en (2) de relatieve concentratie van doel exosomes in experimentele monsters te bepalen.</li>
</ol>4. verwerking van menselijke plasma-of serummonsters
<ol><li>Verzamel plasma of serum steekproeven door standaardmethodes en opslag bij-80 °C tot nodig voor exosoom analyse. Snel ontdooien monsters in een kamer temperatuur water bad. Meng herhaaldelijk de ontdooide monsters door inversie ter bevordering van homogene schorsing. Nota: de resultaten van serum en plasma steekproeven kunnen niet gelijkwaardig zijn, aangezien er een significante versie van exosomes tijdens de het klonteren reactie is.</li>
	<li>Centrifugeer plasma of serum steekproeven bij 500 x g 15 min om eiwitcomplexen en ander puin te neerslaan. Breng een hoeveelheid van het plasma of serummonster over naar een verse buis en voeg PBS toe om een 1:1 verdunning te genereren. Meng het verdunde monster door zachte vortexen of inversie, naar gelang van het geval. Breng 1 µ L van elke plasma-of serum suspensie over naar elk van zijn herhalings putten op de assay plaat.</li>
</ol>5. exosoom vastleggen en detecteren
<ol><li>Laad putten van een geblokkeerde EV Capture dia met 1 µ L/put van exosoom monster, met behulp van 8 repliceert per monster, en Incubeer de dia overnachting bij 4 ° c in een bevochtigde kamer. Aspireren alle monster putten en voeg vervolgens 1 µ L/put van PBS om putten te wassen en te verwijderen ongebonden exosomes en andere contaminanten uit de geladen exosoom monster.</li>
	<li>Laad monster putten met 1 µ L/put van een eerder geprepareerde AuNR-IgG Suspension (zie punt 1 hierboven) en broed de glijbaan voor 2 uur bij 37 °C in een bevochtigde kamer. Aspireren de nano partikel oplossing en was de glijbaan in PBS aangevuld met 0,01% tween-20 (PBST) voor 10 min met behulp van een mixer, dan aspireren en was alle monster putten met deioniseerde water voor 10 min met behulp van een roterende mixer, en de lucht drogen voor de daaropvolgende LMDFM beelden. Opmerking: de Inter-assay coëfficiënten van variatie (CVs) worden beoordeeld vanaf acht herhalingen van hetzelfde monster. Monsters die CVs > 20% vertonen, worden als niet-informatief beschouwd en moeten worden herhaald, als er voldoende steekproef is.</li>
</ol>6. DFM beeld vast te leggen
<ol><li>Capture beelden voor exosoom kwantificering onder consistente verlichting met behulp van een digitale camera bevestigd aan een Microscoop uitgerust met een donkere veld condensator (1,2 < NA < 1,4) en een 4x doelstelling met een 1/220 s belichtingstijd.</li>
	<li>Open de Image Capture software. Opmerking: we gebruiken NIS-Elements Microscoop imaging software (Zie de lijst van materialen) voor het protocol hieronder beschreven, maar het is mogelijk om een andere software die kan overeenkomen met de Image Capture parameters te gebruiken. NIS-Elements viewer Imaging software is een gratis standalone programma om beeldbestanden en datasets die analyse, visualisatie en archivering tools bevat te bekijken. De parameters hieronder zijn ook voor een microscoop met autofocus en een geautomatiseerde fase die het mogelijk maakt meerdere beelden automatisch worden vastgelegd en gestikt in een enkel beeld.</li>
	<li>Plaats de dia ondersteboven op de Microscoop fase, pas de dia positie en breng een kleine druppel onderdompeling olie op de achterkant van de glijbaan, waar de condensor lens contact met de dia.</li>
	<li>Klik op de knop Live in de software-interface, en pas de belichtingstijd tegen een hoge concentratie standaard goed om ervoor te zorgen het beeld is niet verzadigd.</li>
	<li>Open het venster grote afbeelding scannen op het tabblad overnemen en stel de software interface parameters als volgt in: macro image Optical conf = Current; Doelstelling: 2:10x, Scanning Optical conf = Current, doelstelling: 2:10x; Stiksels overlap ping = 20%; Stiksels via = optimaal pad.</li>
	<li>Kies Maak grote afbeelding, sluit actieve sluitertijd tijdens het podium beweging, wacht voordat elke Capture: 20 MS, focus handmatig bij het begin, en het gebruik stap-voor-stap focus elke 20 veld. Deze instelling wordt opgeslagen met de gescande afbeeldingen.</li>
	<li>Verplaats de Microscoop fase om de linker bovenkant rechtsonder grenzen van de target scan veld te definiëren. Pas de focus aan om een duidelijk beeld op de monitor te bereiken en pas de condensor-instellingen en omgevingsverlichting zo nodig aan om eventuele belichtings onregelmatigheden in het gefocuste beeld te minimaliseren.</li>
	<li>Noem het beeld outputdossier in de software. Klik op de knop scannen en laat de Microscoop te scannen en te creëren en een gestikt beeld van de hele dia op te slaan.</li>
	<li>Open de opgeslagen afbeelding met de Image Capture software die u gebruikt en sla het op 1/8 schaal voor de daaropvolgende analyse van de DSM-plugin in ImageJ.</li>
</ol>7. DFM beeldanalyse
<ol><li>Download het ImageJ programma (https://imagej.nih.gov/ij/). Installeer de DSM Algorithm plugin in ImageJ met behulp van de instructies vermeld op https://imagej.net/Plugins#Installing_plugins_manually.</li>
	<li>Open de ImageJ software en stel de volgende invoerparameters in binnen het DSM-algoritme: Contour drempel (CT) = 253,020, type = rood, middelste schaal (S) = 0,8, lage (lt)/High (HT) kwantificatie limiet = 0/62.</li>
	<li>Open de opgeslagen afbeelding uit sectie 6,8 met ImageJ. Kies de DSM-scan knop op het tabblad Plug-ins en definieer vervolgens het aantal kolommen en rijen op basis van de geopende afbeelding. Het programma kan herkennen de detectie gebieden en de analyse van de spreiding intensiteit van nanodeeltjes in de gebieden automatisch. Stel de volgende invoerparameters in het DSM-scan venster in: Resize percentage = 25, Spot diameter (in pixels) = 190 – 200, diameter bereik = 32, increment diameter (in pixels) = 8, DSM-configuratie-laag Limit = 0, hoge limiet = 62, aangrenzende afstand = 100, aftrekken bias = 0. Opmerking: de resultaten van de Scatter-intensiteit van nanodeeltjes weerspiegelen de hoeveelheid gebonden exosomes op de dia.</li>
</ol>

<ol>
	<li>Andaloussi S, E. L., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+biology+and+emerging+therapeutic+opportunities.">Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).</li><li>Choi, D. S., Kim, D. K., Kim, Y. K., Gho, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics,+transcriptomics+and+lipidomics+of+exosomes+and+ectosomes.">Proteomics, transcriptomics and lipidomics of exosomes and ectosomes.</a> Proteomics. 13 (10-11), 1554-1571 (2013).</li><li>Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+other+extracellular+vesicles+in+host-pathogen+interactions.">Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions.</a> EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).</li><li>Hoshino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+exosome+integrins+determine+organotropic+metastasis.">Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.</a> Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).</li><li>Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield, X. O., Lai, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles:+Composition,+Biological+Relevance,+and+Methods+of+Study.">Extracellular Vesicles: Composition, Biological Relevance, and Methods of Study.</a> Bioscience. 65 (8), 783-797 (2015).</li><li>Liang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoplasmonic+Quantification+of+Tumor-derived+Extracellular+Vesicles+in+Plasma+Microsamples+for+Diagnosis+and+Treatment+Monitoring.">Nanoplasmonic Quantification of Tumor-derived Extracellular Vesicles in Plasma Microsamples for Diagnosis and Treatment Monitoring.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, (2017).</li><li>Severino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles+in+Bile+as+Markers+of+Malignant+Biliary+Stenoses.">Extracellular Vesicles in Bile as Markers of Malignant Biliary Stenoses.</a> Gastroenterology. 153 (2), 495-504 (2017).</li><li>Osteikoetxea, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+proteomic+characterization+of+extracellular+vesicles+in+human+pancreatic+juice.">Detection and proteomic characterization of extracellular vesicles in human pancreatic juice.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 499 (1), 37-43 (2018).</li><li>Bulacio, R. P., Nosetto, E. C., Brandoni, A., Torres, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+finding+of+caveolin-2+in+apical+membranes+of+proximal+tubule+and+first+detection+of+caveolin-2+in+urine:+A+promising+biomarker+of+renal+disease.">Novel finding of caveolin-2 in apical membranes of proximal tubule and first detection of caveolin-2 in urine: A promising biomarker of renal disease.</a> Journal of Cellular Biochemistry. , (2018).</li><li>Nair, S., Tang, K. D., Kenny, L., Punyadeera, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+exosomes+as+potential+biomarkers+in+cancer.">Salivary exosomes as potential biomarkers in cancer.</a> Oral Oncology. 84, 31-40 (2018).</li><li>Kim, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+value+of+microRNAs+derived+from+exosomes+in+bronchoalveolar+lavage+fluid+of+early-stage+lung+adenocarcinoma:+A+pilot+study.">Diagnostic value of microRNAs derived from exosomes in bronchoalveolar lavage fluid of early-stage lung adenocarcinoma: A pilot study.</a> Thoracic Cancer. 9 (8), 911-915 (2018).</li><li>Boussadia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidic+microenvironment+plays+a+key+role+in+human+melanoma+progression+through+a+sustained+exosome+mediated+transfer+of+clinically+relevant+metastatic+molecules.">Acidic microenvironment plays a key role in human melanoma progression through a sustained exosome mediated transfer of clinically relevant metastatic molecules.</a> Journal of Experimental &#38; Clinical Cancer Research. 37 (1), 245 (2018).</li><li>An, M., Wu, J., Zhu, J., Lubman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+an+Optimized+Ultracentrifugation+Method+versus+Size-Exclusion+Chromatography+for+Isolation+of+Exosomes+from+Human+Serum.">Comparison of an Optimized Ultracentrifugation Method versus Size-Exclusion Chromatography for Isolation of Exosomes from Human Serum.</a> Journal of Proteome Research. , (2018).</li><li>Brenner, A. W., Su, G. H., Momen-Heravi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Extracellular+Vesicles+for+Cancer+Diagnosis+and+Functional+Studies.">Isolation of Extracellular Vesicles for Cancer Diagnosis and Functional Studies.</a> Methods in Molecular Biology. 1882, 229-237 (2019).</li><li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Exosome+Isolation+Techniques.">Progress in Exosome Isolation Techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li><li>Sun, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+Reduction+Method+for+Quantifying+Nanoparticle+Light+Scattering+in+Low+Magnification+Dark-Field+Microscope+Far-Field+Images.">Noise Reduction Method for Quantifying Nanoparticle Light Scattering in Low Magnification Dark-Field Microscope Far-Field Images.</a> Analytical Chemistry. 88 (24), 12001-12005 (2016).</li><li>Sun, D., Hu, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low+cost+mobile+phone+dark-field+microscope+for+nanoparticle-based+quantitative+studies.">A low cost mobile phone dark-field microscope for nanoparticle-based quantitative studies.</a> Biosensors and Bioelectronics. 99, 513-518 (2018).</li><li>Koshikawa, N., Minegishi, T., Kiyokawa, H., Seiki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+detection+of+soluble+EphA2+fragments+in+blood+as+a+new+biomarker+for+pancreatic+cancer.">Specific detection of soluble EphA2 fragments in blood as a new biomarker for pancreatic cancer.</a> Cell Death &#38; Disease. 8 (10), e3134 (2017).</li><li>Clayton, A., Turkes, A., Navabi, H., Mason, M. D., Tabi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+heat+shock+proteins+in+B-cell+exosomes.">Induction of heat shock proteins in B-cell exosomes.</a> Journal of Cell Science. 118 (Pt 16), 3631-3638 (2005).</li><li>Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ESCRT+pathway.">The ESCRT pathway.</a> Developmental Cell. 21 (1), 77-91 (2011).</li><li>Panagiotara, A., Markou, A., Lianidou, E. S., Patrinos, G. P., Katsila, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+a+cancer+theranostics+road+map.">Exosomes: a cancer theranostics road map.</a> Public Health Genomics. 20 (2), 116-125 (2017).</li></ol>

De auteurs verklaren dat zij geen concurrerende financiële belangen hebben.

Exosomes ontstaan uit gereguleerde invaginations van de buitenste endosome membraan dat de productie van multivesiculaire lichamen, een gespecialiseerde subset van endosomes die een groot aantal intraluminal blaasjes die fusie ondergaan met het plasmamembraan om volwassen release bevatten exosomes in de extracellulaire ruimte. Door deze biogenese pathway, exosomes kan dragen membraan-gebonden factoren geassocieerd met membraan fracties die bestaan uit of fuseren met de endosome membraan, evenals meerdere verschillende soorten cytosolische componenten, en dus bevatten ladingen van eiwitten, DNA en diverse subtypen van RNA (mRNAs, microase, lange non-coding ASE) die het fenotype van hun cel van oorsprong kunnen weerspiegelen20. Aangezien exosomes worden afgescheiden door de meeste, zo niet alle soorten cellen, kan vertonen verhoogde secretie van zieke of kwaadaardige cellen, en accumuleren in de meeste lichaamsvloeistoffen, exosomes zijn het onderwerp van een alomvattend en systematisch onderzoek als een veelbelovende minimaal invasieve middelen om specifieke ziektevoorwaarden te ontdekken en hun reacties op behandeling21te controleren.
Exosoom isolatie, die nodig is voor de meeste huidige exosoom analyses, is een langdurige en arbeidsintensieve procedure, het beperken van de klinische vertaling van exosoom-geassocieerde biomarkers met potentiële medische relevantie. Veel gemeenschappelijke isolatie methoden (ultracentrifugation, grootte-uitsluiting, neerslag, enz.) vaak niet voldoende te onderscheiden exosomes (30-100 nm) van micro-blaasjes (100 – 1000 Nm) en apoptotic lichamen (100 – 5000 nm) als gevolg van overlappingen in hun grootte varieert of fysische eigenschappen of kan schade exosoom integriteit15. Nieuwe benaderingen zijn in ontwikkeling die kunnen toelaten meer snelle exosoom analyses, maar het is niet duidelijk hoe haalbaar het kan zijn om veel van deze platforms in de klinische instellingen te wijten te voeren.
In dit rapport presenteren we een nieuwe aanpak die het mogelijk maakt op nanodeeltjes gebaseerde High-throughput exosoom kwantificering met behulp van lage vergroting donkere veld Microscoop beelden. Deze methode vereist geen exosoom zuivering, dure dedicated apparatuur, of nieuwe technische expertise en moet dus vatbaar zijn voor snelle vertaling in de meeste onderzoek en klinische instellingen. Onze analyse kan worden toegepast om precies te kwantificeren van de concentratie van een doelgroep exosoom bevolking met een specifieke biomarker wanneer assay resultaten worden vergeleken met een standaard curve, omdat onze resultaten vertonen is er een sterke lineaire correlatie (R2 = 0,99) tussen optische respons en exosoom concentratie. Om het echte potentieel van de wereld van deze benadering aan te tonen, hebben wij gegevens verstrekt waar wij deze methode aanwendden om de concentratie van een exosoom biomarker te kwantificeren verbonden aan alvleesklier-kanker in serum steekproeven die van patiënten met en zonder worden verkregen pancreaskanker.
In LMDFM, het hele monster goed is afgebeeld om te voorkomen dat de selectie bias gevonden in high-vergroting DFM analyses, waar gebruikers moeten direct kiezen voor de monster velden te vangen voor de daaropvolgende beeldanalyse, maar is onderworpen aan lichtverstrooiing artefacten van het oppervlak onregelmatigheden, met inbegrip van krassen en monster puin. Deze achtergrond kan worden verlaagd om Target exosoom-afgeleide signaal te detecteren met behulp van onze DSM Noise-reductie algoritme dat draait op de NIH Image Analysis Program, ImageJ, maar zorg moet nog worden genomen om te voorkomen dat de invoering van dergelijke artefacten die kunnen verminderen het dynamisch bereik van de assay.
Materialen gebruikt in deze test:
Multi-well superprotein A/G dia's Holding 1 µ L/well werden gekocht bij Arrayit Corporation (AGMSM192BC). Nanodeeltjes werden verkregen uit Nanopartz (C12-25 -650-TN-DIH-50-1, 6,4 x 1012/ml). DFM beelden werden gevangen met een Nikon map2 digitale camera bevestigd aan een Nikon Ti-Eclipse Microscoop, met consistente verlichting en een 1/220 s belichtingstijd. De PANC-1 Cell lijn gebruikt in deze studie werd gekocht van de American Type Culture Collection.

Exosomes worden vrijgegeven van de meeste soorten cellen en spelen een belangrijke rol in cel-naar-cel communicatie, met inbegrip van pathofysiologische processen in verband met verschillende ziekten, omdat ze kunnen worden naar huis om specifieke weefsels of cel types, en bevatten een verscheidenheid van nucleïnezuren , eiwitten en lipiden die hun cel van oorsprong weerspiegelen en kunnen regulerende effecten uitoefenen op de ontvanger cellen1,2,3,4. Exosomes worden vaak afgescheiden op verhoogde niveaus in de ziekte van Staten, kunnen interageren met zowel aangrenzende en verre cellen, en zijn te vinden op relatief hoge concentratie in de circulatie en de meeste andere lichaamsvloeistoffen, waaronder speeksel, urine, pancreas en gal SAP, en bronchoalveolaire lavage vloeistof5,6,7,8,9,10,11. Deze overvloed en stabiliteit van exosomes in menselijk lichaam vloeistoffen, in combinatie met hun informatie-rijke aard, maakt ze ideaal biomarkers voor de ziekte van diagnose en behandeling monitoring.
Dit omvat tumor-afgeleide exosomes (TDEs), die tumor-specifieke of selectieve factoren bevatten, die als ziekte biomarkers, met inbegrip van tumor-geassocieerde gemuteerde alleles kunnen dienen. TDEs kan deelnemen aan de verbouwing van de tumor microenvironment te vergemakkelijken tumorontwikkeling en metastase, en reguleren anti-tumor reacties12. Verhoogde TDE secretie is een gemeenschappelijk fenotype van de meeste vormen van kanker en verschillende kenmerken van de tumor microenvironment, met inbegrip van hypoxie, zure pH, en ontsteking, zijn bekend om exosoom secretie te bevorderen. Verrassend, gezien het aantal cellen dat afscheiden exosomes, een stijging van de totale exosoom niveau kan, zelf, functioneren als een kanker biomarker. Bijvoorbeeld, een recente studie bleek dat de totale EV concentratie in de gal SAP discrimineert maligne en niet-maligne in het gemeenschappelijk galwegen stenose patiënten met 100% nauwkeurigheid7. Vergelijkbare resultaten zijn gevonden met studies met behulp van andere lichaamsvloeistoffen, met inbegrip van plasma. Nochtans, wegens het potentieel voor onderworpen aan onderworpen variatie, en andere verwarrende factoren, hebben de meeste studies die exosomes als ziekte biomarkers onderzoeken zich op opsporing van biomarker geconcentreerd die selectief met TDEs in plaats van totale exosoom wordt geassocieerd Getallen.
Het vertalen van exosoom biomarkers in de klinische praktijk, blijft echter uitdagend, aangezien de meeste gemelde exosoom assay benaderingen vergen tijdrovende en arbeidsintensieve isolatie procedures 13. Momenteel populaire exosoom isolatie methoden omvatten ultracentrifugation, dichtheidsgradiënten, grootte-uitsluiting, co-precipitatie, affiniteit vast te leggen, en microvloeiende isolatie benaderingen. Ultracentrifugation is de "Gold Standard" methode, en wordt meestal gebruikt voor exosoom isolaties, maar deze procedure is tijdrovend en resulteert in exosoom schade en exosoom membraan Clustering, en produceert exosoom monsters die zijn verontreinigd met eiwitten, lipoproteïnen en andere factoren die de daaropvolgende analyses kunnen beïnvloeden14. De meeste exosoom isolatiemethodes, met inbegrip van ultracentrifugation, kunnen exosomes (30-150 Nm) van micro-blaasjes (100 – 1000 Nm) en apoptotic organismen (100 – 5000 nm) niet scheiden, die door verschillende mechanismen ontstaan en verschillende functies hebben, wegens de grootte overlap tussen deze groepen, en de diversiteit van exosoom bevolking15. Nieuwe benaderingen zijn nodig om de gevoeligheid en reproduceerbaarheid van exosoom assays te verbeteren door het verbeteren van exosoom herstel, terwijl het verminderen van exosoom schade en vervuiling, hoewel alle analyses op basis van dergelijke methoden zal ook moeten worden geoptimaliseerd om ze te maken geschikt voor vertaling naar toepassingen in klinische settings.
Verscheidene recente studies hebben voorgesteld om geïntegreerde platforms in dienst te nemen om exosomes van lichaamsvloeistoffen direct te vangen en te analyseren. Deze methoden maken gebruik van microvloeistoffen, electrokinetic, affiniteit vast te leggen, en diverse andere methoden voor exosoom isolatie, en electrochemistry, oppervlak Plasmon resonantie, en andere methoden op te sporen gevangen exosomes. Het is niet duidelijk hoe haalbaar veel van deze benaderingen zal worden in de klinische instellingen, vanwege hun complexiteit, kosten, lage doorvoersnelheid of andere kwesties.
We hebben een snelle en goedkope assay ontwikkeld die gebruikt kan worden voor de gevoelige en specifieke kwantificering van totale exosomes en specifieke exosoom subtypen, inclusief ziekte-geassocieerde exosomes, zoals TDEs, die slechts een kleine hoeveelheid monster vereist en die maakt gebruik van een gestroomlijnde workflow geschikt voor klinische omgevingen. In deze Assay, een dia is bedekt met antilichamen die binden ofwel een exosoom-specifieke of ziekte-specifieke marker uitgedrukt op de exosoom oppervlak om direct te vangen doel exosomes aanwezig in kleine volume plasma-of serummonsters toegepast op putten op de Dia. Gevangen exosomes worden vervolgens gekruist met een antilichaam-geconjugeerde nanodeeltjes die de biomarker van belang erkent op deze exosomes, die kan worden ofwel een algemene exosoom marker of een factor die specifiek zijn voor een exosoom subtype van belang. Beelden van deze monster putten worden vervolgens gevangen met behulp van een donkere veld Microscoop (dfm) en geanalyseerd om het licht te meten verspreid van nanodeeltjes gebonden aan exosomes van belang gevangen in elk monster goed6,16,17. Met name, Imaging een hele steekproef goed door lage-vergroting DFM (LMDFM) vermijdt een selectie bias ondervonden met een hoge vergroting DFM analyses wanneer gebruikers moeten direct kiezen welke velden te vangen voor de daaropvolgende beeldanalyse. LMDFM beeldanalyse is onderworpen aan lichtverstrooiing artefacten van oppervlakte onregelmatigheden, met inbegrip van krassen en monster puin, maar deze achtergrond kan worden verlaagd met behulp van een eenvoudige Noise-reductie algoritme ontwikkeld om te draaien op de NIH beeldanalyse-programma, ImageJ (https://imagej.nih.gov/ij/). Dit algoritme past eerst een input contour drempel die wordt gebruikt om de grenzen van het monster goed te detecteren om de regio van de afbeelding voor de volgende analyse te definiëren. Het gebied dat door dit contour gebied wordt bepaald wordt dan verdeeld aan afzonderlijk signaal aanwezig in de rode, blauwe en groene kanalen van het beeld en het blauwe kanaal wordt afgetrokken van het rode kanaal om signaal te verwijderen die uit oppervlakte artefacten en ongelijke verlichting van nano staafje Signaal.
In dit artikel wordt beschreven hoe u deze test gebruiken om de totale of specifieke exosoom niveaus in plasma-of serummonsters snel te kwantificeren.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:836px;" width="836">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Eppendorf Repeater stream</td>
			<td style="width:120px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:187px;">05-401-040</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Eppendorf Research plus</td>
			<td style="width:120px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:187px;">3120000011</td>
			<td>0.1 &#8211; 2.5 &#181;L, dark gray</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:311px;">Functionalized Gold Nanorods</td>
			<td style="width:120px;">Nanopartz</td>
			<td style="width:187px;">C12-25-650-TN-DIH-50-1</td>
			<td style="width:219px;">In vitro neutravidin polymer functionalization</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:311px;">HulaMixer Sample Mixer</td>
			<td style="width:120px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:187px;">15920D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:311px;">Incu-shaker 10L</td>
			<td style="width:120px;">Benchmark Scientific</td>
			<td style="width:187px;">H1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:311px;">Inverted Research Microscope</td>
			<td style="width:120px;">Nikon</td>
			<td style="width:187px;">Ti-DH</td>
			<td style="width:219px;">With Dark field condenser, DS-Ri2 camera, and Ti-SH-U universal holder, and motorized stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">NIS-Elements</td>
			<td style="width:120px;">Nikon</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td>Microscope imaging software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:311px;">Phosphate Buffered Saline (1X)</td>
			<td style="width:120px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:187px;">SH30256.02</td>
			<td>HyClone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Protein A/G Treated Glass Substrate Slides</td>
			<td style="width:120px;">Arrayit Corp.</td>
			<td style="width:187px;">AGMSM192BC</td>
			<td style="width:219px;">Premium microarray substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Q500 Sonicator</td>
			<td style="width:120px;">Qsonica, LLC</td>
			<td style="width:187px;">Q500-110</td>
			<td>With standard probe (#4220)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Superblock blocking buffer</td>
			<td style="width:120px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:311px;">TWEEN 20</td>
			<td style="width:120px;">Sigma Life Sciences</td>
			<td style="width:187px;">9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using nanoplasmon-enhanced scattering and low-magnification microscope imaging to quantify tumor-derived exosomes

Geïnfecteerde of kwaadaardige cellen vaak afscheiden meer exosomes, wat leidt tot verhoogde niveaus van ziekte-geassocieerde exosomes in de circulatie. Deze exosomes hebben het potentieel om als biomarkers voor ziektediagnose te dienen en ziektevooruitgang en behandelings reactie te controleren. Nochtans, vereisen de meeste exosoom analyseprocedures exosoom isolatie en reinigingsstappen, die gewoonlijk tijdrovend en arbeidsintensief, en zo van beperkt nut in klinische montages zijn. Dit rapport beschrijft een snelle procedure om specifieke biomarkers op het buitenmembraan van exosomes te analyseren zonder afzonderlijke isolatie en reinigingsstappen te vereisen. In deze methode, exosomes worden gevangen op het oppervlak van een dia door exosoom antilichamen en vervolgens gekruist met nano partikel-geconjugeerde antilichaam sondes die specifiek zijn voor een ziekte. Na hybridisatie, de overvloed van de doelgroep exosoom bevolking wordt bepaald door het analyseren van low-vergroting Dark-Field Microscoop (LMDFM) beelden van de gebonden nanodeeltjes. Deze aanpak kan gemakkelijk worden vastgesteld voor onderzoek en klinisch gebruik te analyseren membraan-geassocieerde exosoom biomarkers in verband met ziekte.

Multi-well proteïne A/G met een laag bedekte dia's (Figuur 1a) werden gefunctioneerd met anti-EphA2 antilichaam en dan gebruikt om EphA2-positieve exosomes van serum steekproeven van patiënten met en zonder alvleesklier-kanker (1 µ l/well) specifiek te vangen en bebroede met goud nanorods vervoegd met een anti-CD9 antilichaam (Figuur 1b). DFM beelden van licht verspreid uit deze nanodeeltjes werden geanalyseerd met behulp van de DSM-plugin in ImageJ software om de gebonden EphA-2 positieve exosomes in elk goed te kwantificeren. Het DSM-algoritme definieert automatisch de grens van een monster, filtert het geluid van artefacten, berekent het verspreide signaal van elk goed en geeft deze informatie uit (Figuur 2). Het DSM-algoritme verzwakt sterk licht verstrooiende artefacten van krassen of puin aanwezig in het monster en verbetert de gevoeligheid en reproduceerbaarheid van nanodeeltjes detectie en kan automatisch een batch van dia-afbeeldingen verwerken voor een hoge doorvoersnelheid Gebruiken. Dit algoritme gebruikt ImageJ commando's en parameters input door de gebruiker om de Beeldachtergrond af te trekken, het verstrooiings signaal te berekenen van elk goed, en de uitgang van een Data-en image-bestand (Figuur 3). Regio's van belang zijn gedefinieerd door de hoge intensiteit goed grenzen in de Capture beeld met behulp van de contour drempel functie van de ImageJ macro-programma. Beeld analyses maken gebruik van een predeﬁned contour drempel en beeld parameters om de intensiteit van de deeltjes spreiding voor elk goed te berekenen.
Zoals gerapporteerd in ons vorige werk (aanvullende informatie van Liang et al.6), exosomes GEÏSOLEERD van PANC-1 cel culturen die door transmissie worden gekenmerkt elektronenmicroscopie en westelijke vlek tentoongesteld de groottewaaier, de morfologie, en eiwit teller expressie in overeenstemming met een hoge zuiverheid exosoom monster. De PANC-1 exosomes, bereid met dezelfde procedure als ons vorige werk, werden hier gebruikt om onze nPES assay voor exosoom kwantificering te valideren. Deze analyse gebruikte een anti-EphA2 antilichaam om een grote bevolking van exosomes van de totale exosoom bevolking en een antilichaam tegen de algemene exosoom proteïne CD9 te vangen om gevangen exosomes te ontdekken. Resultaten verkregen met behulp van serieel verdunde PANC-1 exosoom monsters, met eiwit concentraties variërend van 0,24 tot 1,2 µ g/µ L, toonde goede reproduceerbaarheid in repliceren putten (figuur 4a) en een sterke lineaire correlatie tussen de spreiding respons en exosoom eiwitconcentratie (figuur 4b).
Om de potentiële toepassing van deze methode aan te tonen, werden de serum steekproeven van patiënten met en zonder alvleesklier-kanker geanalyseerd om de overvloed van serum exosomes te ontdekken die de kanker-bijbehorende biomarker EphA2 uitdrukt, gebruikend een anti-EphA2 antilichaam aan direct Capture target exosomes van serum en nanodeeltjes geconjugeerd met een anti-CD9 antilichaam op te sporen gebonden exosomes. Deze analyse bleek dat serummonsters van de alvleesklierkanker patiënten hadden signiﬁcantly hogere niveaus van EphA2 + exosomes (Figuur 5) dan hun controles.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59177/59177fig1.jpg"> Figuur 1: exosoom kwantificatie schema. (A) schematische van multi-goed eiwit A/G dia's (192 putten) gebruikt in deze test. (B) doel exosomes worden rechtstreeks gevangen uit monsters, met inbegrip van serum en plasma, door oppervlakte immobilisatie op de Capture antilichaam (bijv. anti-EphA2 antilichaam) gebonden aan de glijbaan, en vervolgens uitgebroed met goud nanorods geconjugeerd met een detectie antilichaam (b.v. anti-CD9 antilichaam) vóór analyse door DFM beeldanalyse. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59177/59177fig1large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59177/59177fig2.jpg"> Figuur 2: exosoom kwantificering door het DSM-algoritme toe te passen op LMDFM images. Low-vergroting beelden worden verwerkt met de DSM-algoritme om achtergrond signaal en signaal artefacten die kunnen ontstaan door krassen, het mengen van vides, puin, en ongelijke steekproef verlichting te elimineren om robuuste detectie van goud nano staafje signaal, dat correleert met exosoom concentratie. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Sun, D. et al. Noise Reduction methode voor het kwantificeren van nanodeeltjes lichtverstrooiing in lage vergroting Dark-veld Microscoop ver-veld beelden. Analytische chemie. 88 (24), 12001-12005 (2016). Auteursrecht (2016) de Amerikaanse chemische maatschappij. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59177/59177fig2large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59177/59177fig3.jpg"> Figuur 3: schematisch van de DSM-algoritme opdrachten en-uitgangen. De vermelde stappen gebruiken inheemse bevelen van ImageJ en alle InputParameters worden geselecteerd volgens de vereisten van experimenten via grafisch gebruikersinterface. Dit cijfer is aangepast met toestemming van Sun, D. et al. Noise Reduction methode voor het kwantificeren van nanodeeltjes lichtverstrooiing in lage vergroting Dark-veld Microscoop ver-veld beelden. Analytische chemie. 88 (24), 12001-12005 (2016). Auteursrecht (2016) de Amerikaanse chemische maatschappij. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59177/59177fig3large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59177/59177fig4.jpg"> Figuur 4: representatieve NPES LMDFM images en DSM output data. (A) LMDFM beeld van een nPES assay analyse van een concentratiegradiënt van PANC-1 exosomes en (B) de lineaire correlatie van het optische signaal en de exosoom concentratie van deze dia (van links naar rechts: 0,24, 0,356, 0,53, 0,80, 1,20 µ g/µ l respectievelijk voor elke kolom). De gegevens worden gepresenteerd als mean ± SE, n = 6, met een Pearson correlatiecoëfficiënt R2 = 0,99 en coëfficiënt van variatie voor de replicatie van elke concentratie < 0,2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59177/59177fig4large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59177/59177fig5.jpg"> Figuur 5: LMDFM signaal van EphA2+ exosomes verschilt in serum van patiënten met en zonder pancreaskanker. Serummonsters geanalyseerd door nPES met behulp van een anti-EphA2 Capture antilichaam (kanker-geassocieerde) en een anti-CD9 detectie antilichaam (General exosoom marker) tentoongesteld een significant verschil in de concentratie van EphA2 + exosomes in serummonsters van patiënten met en zonder pancreaskanker (N = 7/groep). De resultaten worden gepresenteerd als mean ± SE. * *p = 0,002 door Mann-Whitney U-test (dubbelzijdig). Dit cijfer is gewijzigd van [Sun, D. et al. Noise Reduction methode voor het kwantificeren van nanodeeltjes lichtverstrooiing in lage vergroting Dark-veld Microscoop ver-veld beelden. Analytische chemie. 88 (24), 12001-12005 (2016)]. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59177/59177fig5large.jpg" target="_blank">Klik hier om een grotere versie van dit cijfer te bekijken.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using Nanoplasmon-Enhanced Scattering and Low-Magnification Microscope Imaging to Quantify Tumor-Derived Exosomes at JoVE.com

Using Nanoplasmon-Enhanced Scattering and Low-Magnification Microscope Imaging to Quantify Tumor-Derived Exosomes

Met behulp van Nanoplasmon-Enhanced verstrooiing en low-vergroting Microscoop Imaging te kwantificeren tumor-afgeleide Exosomes

De klinische vertaling van exosoom biomarkers voor zieke en kwaadaardige cellen wordt belemmerd door het ontbreken van snelle en accurate kwantificatie methoden. Dit rapport beschrijft het gebruik van low-vergroting Dark-Field Microscoop beelden te kwantificeren specifieke exosoom subtypen in kleine volume serum of plasma monsters.

Infected or malignant cells frequently secrete more exosomes, leading to elevated levels of disease-associated exosomes in the circulation. These exosomes ...

Nanoplasmon-enhanced verstrooiing, of nPES, is een eenvoudig en niet-invasief alternatief voor de chirurgische biopsie die tijdrovende en arbeidsintensieve exosoomzuivere zuiveringsstappen kan overslaan, waardoor de toepassing van exosoomanalyse naar klinische instellingen wordt uitgebreid. Deze nPES-test is een snelle procedure om specifieke biomarkers te analyseren op het buitenste membraan van exosomen die geen afzonderlijke isolatie- en zuiveringsstappen vereisen. We hebben alleen een zeer klein klinisch monster nodig voor deze test.Daarom kan deze methode het gebruik van nPES uitbreiden naar het bestuderen van genetisch gemanipuleerde of PDX-muismodellen. Er zijn een paar stappen in dit protocol die misschien ontmoedigend lijken. Echter, met een paar praktijk loopt, iedereen met fundamentele natte lab vaardigheden kunnen leren om succesvol uit te voeren nPES.Om te beginnen met de procedure, combineren 40 microliters van een suspensie van NeutrAvidin-gefunctionaliseerde gouden nanorods met 200 microliters van koude, pH zeven fosfaat-gebufferde zoutoplossing. Centrifugeren het mengsel op 8500 keer g bij vier graden Celsius gedurende 10 minuten, en verwijder de supernatant. Herhaal dit wasproces nog twee keer, en dan resuspend de nanorods in 40 microliters van koude PBS.Voeg vervolgens 150 microliter koude PBS en 10 microliter van een 0,5 milligram-per-milliliter oplossing van de juiste biotinylated antilichamen aan de suspensie. Meng op vier graden Celsius gedurende twee uur om antilichaam-geconjugeerde gouden nanorods te verkrijgen. Was de nanorods drie keer door centrifugatie in 200 microliter porties koude PBS bij 6500 keer g bij vier graden Celsius gedurende elk 10 minuten.Daarna, resuspend de gewassen antilichaam-geconjugeerde nanorods in 200 microliters van koude PBS, en bewaar ze op vier graden Celsius voor maximaal 24 uur. Om te beginnen met de voorbereiding van de dia, verdun de gewenste exosoom vangen antilichamen tot 025 milligram per milliliter in PBS. Pipette één microliter van deze oplossing in elke put van een eiwit A/G-behandelde dia die met optisch-rangglas wordt gesteund.Breng de schuif vervolgens over naar een bevochtigingsdoos om ervoor te zorgen dat putten niet opdrogen tijdens incubatie. Broed de glijbaan een uur lang in op 37 graden Celsius om de vangantilichamen te immobiliseren. Vervolgens, aspirate de resterende oplossing om niet-gebonden antilichamen te verwijderen.Was de putten door het toevoegen en aspirating een microliter van PBS drie keer. Laad vervolgens snel elke put met één microliter pbs-gebaseerde blokkeringsbuffer en ontcubeer de dia twee uur lang bij 37 graden Celsius. Bij het uitvoeren van ongeveer 15 monsters, moeten we gebruik maken van een single-channel pipet te laden blokkeren buffer op 120 putten in minder dan vijf minuten om de verdamping van blokkerende agent te voorkomen.Begin met het voorbereiden van een oplossing van antilichaam-geconjugeerde gouden nanorods tijdens het blokkeren van dia's. Ongeveer 30 minuten voor het blokkeren van afwerkingen, snel dooi plasma of serum monsters in een kamertemperatuur waterbad. Vortex de ontdooide monsters gedurende 30 seconden om ervoor te zorgen dat de suspensies homogeen zijn.Vervolgens, centrifugeren de monsters op 500 keer g gedurende 15 minuten om eiwit aggregaten en ander puin neerslaan. Breng 10-microliter aliquots van de supernatant over naar verse buizen en maak één-op-één verdunningen met PBS. Meng de verdunde monsters door zachte vortexing of inversie naar gelang van het geval.Wanneer het blokkeren van de dia is voltooid, de blokkeringsbuffer aangezogen en de putten drie keer wassen met één microlitergedeelten pbs. Laad onmiddellijk de monsters in de putten met één microliter per put en acht replica's per monster. Laad exosoom normen in de juiste putten op dezelfde manier.Broed de glijbaan 12 tot 18 uur in een koelkast bij vier graden Celsius. Dan, aspirate de putten, en was elke put een keer met een microliter van PBS. Laad een microliter van de antilichaam-geconjugeerde gouden nanorod suspensie in elke put, en broed de dia op 37 graden Celsius gedurende twee uur.Daarna, aspirate de nanorod suspensie, en was de dia in PBS aangevuld met 1%polysorbate 20 gedurende 10 minuten met behulp van een mixer. Vervolgens, aspirate de putten, en was de glijbaan in gedeïsized water gedurende 10 minuten op een roterende mixer. Verwijder het water en laat de glijbaan drogen in een schone petrischaal voordat u de glijbaan naar de donkere veldmicroscoop brengt.Zet een omgekeerde microscoop uitgerust met een donkere veld olie-onderdompeling condensor, een 4x doelstelling, en een gemotoriseerde fase. Sluit de microscoop aan op een computer via een digitale camera en open de beeldsoftware. Plaats vervolgens de monsterschuif ondersteboven op het microscooppodium en breng een kleine druppel onderdompelingsolie aan waar de condensatorlens de dia ingaat.Geef het zicht door de microscoop weer in de beeldsoftware. Pas de belichtingstijd aan op een hoge concentratienorm om ervoor te zorgen dat het beeld niet verzadigd is. Open vervolgens het hulpprogramma voor het scannen van grote afbeeldingen en stel de objectieve vergroting in op 10x.Kies ervoor om de actieve sluiter te sluiten tijdens de fasebeweging en 20 milliseconden te wachten voordat deze wordt vastgelegd. Stel de stiksels overlap in op 20% en selecteer stiksels via het optimale pad. Kies ervoor om een grote afbeelding te maken in de scan.Stel de camera in om handmatig scherp te stellen aan het begin van de scan en schakel elke 20 velden een automatische stapsgewijze focus in. Kies vervolgens om de linker-, rechter-, boven- en onderkantslimieten voor het doelscanveld in te stellen en het scangebied te definiëren door de microscoopfase naar elk van de gewenste limieten te verplaatsen. Pas vervolgens de focus, de condensor en de gebiedsverlichting aan om een helder, goed verlicht beeld te verkrijgen.Geef het te maken afbeeldingsbestand een naam en start de scan. Wanneer deze is voltooid, opent u de afbeelding en slaat u deze op 1/8-schaal op. Open de software voor beeldanalyse.Open vervolgens het menu Plug-ins, klik op DSM-scan, definieer het aantal kolommen en rijen, stel het formaatpercentage in op 25, stel de diameter van de spot in pixels in op 190 tot 200, stel het diameterbereik in op 32 en stel de toenamediameter in pixels in op acht. Stel de lage en hoge DSM-limieten in op nul en 62, de aangrenzende afstand op 100 en de aftrekkende bias op nul. Voer het DSM-algoritme uit en sla de resulterende gegevens op.De DSM-analysetechniek toonde een goede reproduceerbaarheid voor serieverdunde PANC-1 exosoommonsters variërend van 0,24 tot 1,2 microgram per microliter. Een sterke lineaire correlatie werd waargenomen tussen de scatter respons van de gouden nanorods en de exosoom eiwitconcentratie. Een significant verschil in overvloed aan serumexosomen die de aan kanker geassocieerde biomarker EphA2 uitdrukken, werd waargenomen tussen patiënten met alvleesklierkanker en gezonde patiënten.Vanaf de toevoeging van het blokkeermiddel verder, snelle en nauwkeurige pipetting is van cruciaal belang om de verdamping van monsters te voorkomen, de invoering van kruisbesmetting, en krassen op het oppervlak van de dia. Na deze procedure voeren we statistische analyses uit om een correlatie te onderzoeken tussen de expressie van de exosomale biomarker van belang en het verschillende stadium van de ziekte dat wordt bestudeerd. Na het opzetten van deze technologie, en we zijn in staat om exosomale biomarkers te vinden voor vroeg stadium alvleesklierkanker.Momenteel breiden we deze ontdekking uit naar andere vormen van kanker en infectieziekte. Meestal zijn de monsters behandeld in deze test ofwel patiënt monsters of gezuiverd exosoom monsters van kanker cellijnen, die speciale veiligheidstraining noodzakelijk.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Ontwerp van een Cyclic Pressure Bioreactor voor de Ex Vivo Studie van Aorta hartkleppen

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Small and Wide Angle X-Ray Scattering Studies of Biological Macromolecules in Solution

Kleine en Wide Angle X-ray scattering Studies van biologische macromoleculen in oplossing

In this paper, Small and Wide Angle X-ray Scattering (SWAXS) analysis of macromolecules is demonstrated through experimentation. SWAXS is a technique ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

Van Fast Fluorescentie Imaging om moleculaire diffusie wet op de Live-celmembranen in een Commercial Microscoop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

High Speed Sub-GHz Spectrometer for Brillouin Scattering Analysis

High Speed ​​Sub-GHz Spectrometer voor Brillouin Scattering Analyse

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Selectieve Cell Eliminatie van Gemengde 3D Cultuur Met behulp van een Near Infrared Photoimmunotherapy Techniek

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

A Rapid and Chemical-free Hemoglobin Assay with Photothermal Angular Light Scattering

Een snelle en chemische-vrij hemoglobine Assay met Fotothermisch Angular Light Scattering

Photo-thermal angular light scattering (PT-AS) is a novel optical method for measuring the hemoglobin concentration ([Hb]) of blood samples. On the basis ...

Using Extraordinary Optical Transmission to Quantify Cardiac Biomarkers in Human Serum

Met behulp van buitengewone optische transmissie te kwantificeren cardiale Biomarkers in menselijk Serum

For a biosensing platform to have clinical relevance in point-of-care (POC) settings, assay sensitivity, reproducibility, and ability to reliably monitor ...

Targeting Neuronal Fiber Tracts for Deep Brain Stimulation Therapy Using Interactive, Patient-Specific Models

Richtend neuronale Fiber traktaten voor diepe brein stimulatie therapie met behulp van interactieve, patiënt-specifieke modellen

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for ...

Stiffness Measurement of Soft Silicone Substrates for Mechanobiology Studies Using a Widefield Fluorescence Microscope

Meting van de stijfheid van zachte siliconen substraten voor Mechanobiology Studies met een Widefield fluorescentie Microscoop

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Uitvoeren van meerdere Imaging modi met één fluorescentie Microscoop

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...