Name: using nanoplasmon-enhanced scattering and low-magnification microscope imaging to quantify tumor-derived exosomes
Uploaded: 2019-05-24T13:00:00
Duration: 9 min 30 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about Using Nanoplasmon-Enhanced Scattering and Low-Magnification Microscope Imaging to Quantify Tumor-Derived Exosomes at JoVE.com

Эта работа была в первую очередь поддерживается финансирования исследований, предоставляемых низ (U01CA214254, R01HD090927, R01AI122932, R01AI113725 и R21Al126361-01), Аризона биомедицинских исследований Комиссии (ABRC) молодой следователь награду.

<ol>
	<li>Andaloussi S, E. L., Mager, I., Breakefield, X. O., Wood, M. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+vesicles:+biology+and+emerging+therapeutic+opportunities.">Extracellular vesicles: biology and emerging therapeutic opportunities.</a> Nature Reviews Drug Discovery. 12 (5), 347-357 (2013).</li><li>Choi, D. S., Kim, D. K., Kim, Y. K., Gho, Y. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Proteomics,+transcriptomics+and+lipidomics+of+exosomes+and+ectosomes.">Proteomics, transcriptomics and lipidomics of exosomes and ectosomes.</a> Proteomics. 13 (10-11), 1554-1571 (2013).</li><li>Schorey, J. S., Cheng, Y., Singh, P. P., Smith, V. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes+and+other+extracellular+vesicles+in+host-pathogen+interactions.">Exosomes and other extracellular vesicles in host-pathogen interactions.</a> EMBO Reports. 16 (1), 24-43 (2015).</li><li>Hoshino, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+exosome+integrins+determine+organotropic+metastasis.">Tumour exosome integrins determine organotropic metastasis.</a> Nature. 527 (7578), 329-335 (2015).</li><li>Zaborowski, M. P., Balaj, L., Breakefield, X. O., Lai, C. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles:+Composition,+Biological+Relevance,+and+Methods+of+Study.">Extracellular Vesicles: Composition, Biological Relevance, and Methods of Study.</a> Bioscience. 65 (8), 783-797 (2015).</li><li>Liang, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoplasmonic+Quantification+of+Tumor-derived+Extracellular+Vesicles+in+Plasma+Microsamples+for+Diagnosis+and+Treatment+Monitoring.">Nanoplasmonic Quantification of Tumor-derived Extracellular Vesicles in Plasma Microsamples for Diagnosis and Treatment Monitoring.</a> Nature Biomedical Engineering. 1, (2017).</li><li>Severino, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extracellular+Vesicles+in+Bile+as+Markers+of+Malignant+Biliary+Stenoses.">Extracellular Vesicles in Bile as Markers of Malignant Biliary Stenoses.</a> Gastroenterology. 153 (2), 495-504 (2017).</li><li>Osteikoetxea, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+and+proteomic+characterization+of+extracellular+vesicles+in+human+pancreatic+juice.">Detection and proteomic characterization of extracellular vesicles in human pancreatic juice.</a> Biochemical and Biophysical Research Communications. 499 (1), 37-43 (2018).</li><li>Bulacio, R. P., Nosetto, E. C., Brandoni, A., Torres, A. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Novel+finding+of+caveolin-2+in+apical+membranes+of+proximal+tubule+and+first+detection+of+caveolin-2+in+urine:+A+promising+biomarker+of+renal+disease.">Novel finding of caveolin-2 in apical membranes of proximal tubule and first detection of caveolin-2 in urine: A promising biomarker of renal disease.</a> Journal of Cellular Biochemistry. , (2018).</li><li>Nair, S., Tang, K. D., Kenny, L., Punyadeera, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Salivary+exosomes+as+potential+biomarkers+in+cancer.">Salivary exosomes as potential biomarkers in cancer.</a> Oral Oncology. 84, 31-40 (2018).</li><li>Kim, J. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+value+of+microRNAs+derived+from+exosomes+in+bronchoalveolar+lavage+fluid+of+early-stage+lung+adenocarcinoma:+A+pilot+study.">Diagnostic value of microRNAs derived from exosomes in bronchoalveolar lavage fluid of early-stage lung adenocarcinoma: A pilot study.</a> Thoracic Cancer. 9 (8), 911-915 (2018).</li><li>Boussadia, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Acidic+microenvironment+plays+a+key+role+in+human+melanoma+progression+through+a+sustained+exosome+mediated+transfer+of+clinically+relevant+metastatic+molecules.">Acidic microenvironment plays a key role in human melanoma progression through a sustained exosome mediated transfer of clinically relevant metastatic molecules.</a> Journal of Experimental &#38; Clinical Cancer Research. 37 (1), 245 (2018).</li><li>An, M., Wu, J., Zhu, J., Lubman, D. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+an+Optimized+Ultracentrifugation+Method+versus+Size-Exclusion+Chromatography+for+Isolation+of+Exosomes+from+Human+Serum.">Comparison of an Optimized Ultracentrifugation Method versus Size-Exclusion Chromatography for Isolation of Exosomes from Human Serum.</a> Journal of Proteome Research. , (2018).</li><li>Brenner, A. W., Su, G. H., Momen-Heravi, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+Extracellular+Vesicles+for+Cancer+Diagnosis+and+Functional+Studies.">Isolation of Extracellular Vesicles for Cancer Diagnosis and Functional Studies.</a> Methods in Molecular Biology. 1882, 229-237 (2019).</li><li>Li, P., Kaslan, M., Lee, S. H., Yao, J., Gao, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Progress+in+Exosome+Isolation+Techniques.">Progress in Exosome Isolation Techniques.</a> Theranostics. 7 (3), 789-804 (2017).</li><li>Sun, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Noise+Reduction+Method+for+Quantifying+Nanoparticle+Light+Scattering+in+Low+Magnification+Dark-Field+Microscope+Far-Field+Images.">Noise Reduction Method for Quantifying Nanoparticle Light Scattering in Low Magnification Dark-Field Microscope Far-Field Images.</a> Analytical Chemistry. 88 (24), 12001-12005 (2016).</li><li>Sun, D., Hu, T. Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+low+cost+mobile+phone+dark-field+microscope+for+nanoparticle-based+quantitative+studies.">A low cost mobile phone dark-field microscope for nanoparticle-based quantitative studies.</a> Biosensors and Bioelectronics. 99, 513-518 (2018).</li><li>Koshikawa, N., Minegishi, T., Kiyokawa, H., Seiki, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+detection+of+soluble+EphA2+fragments+in+blood+as+a+new+biomarker+for+pancreatic+cancer.">Specific detection of soluble EphA2 fragments in blood as a new biomarker for pancreatic cancer.</a> Cell Death &#38; Disease. 8 (10), e3134 (2017).</li><li>Clayton, A., Turkes, A., Navabi, H., Mason, M. D., Tabi, Z. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Induction+of+heat+shock+proteins+in+B-cell+exosomes.">Induction of heat shock proteins in B-cell exosomes.</a> Journal of Cell Science. 118 (Pt 16), 3631-3638 (2005).</li><li>Henne, W. M., Buchkovich, N. J., Emr, S. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+ESCRT+pathway.">The ESCRT pathway.</a> Developmental Cell. 21 (1), 77-91 (2011).</li><li>Panagiotara, A., Markou, A., Lianidou, E. S., Patrinos, G. P., Katsila, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Exosomes:+a+cancer+theranostics+road+map.">Exosomes: a cancer theranostics road map.</a> Public Health Genomics. 20 (2), 116-125 (2017).</li></ol>

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих финансовых интересов.

Exosomes возникают из-за регулируемых инвагивания внешней эндосомы мембраны, которые производят мультивезикулярные тела, специализированное подмножество эндосомов, которые содержат большое количество внутрилунальных пузырьков, которые проходят слияние с плазматической мембраной, чтобы выпустить Зрелые exosomes в внеклеточное пространство. Из-за этого пути биогенеза, exosomes может нести мембранные связанные факторы, связанные с мембранными фракциями, которые состоят или сливаются с эндозомой мембраной, а также несколько различных типов цитозолольных компонентов, и таким образом содержат грузы белков, ДНК и различные подтипы РНК (mRNAs, микроРНК, длинные Некодирующие RNAs), которые могут отражать фенотипа их ячейки происхождения20. В виду того что exosomes секретируются большинством если не всеми типами клетки, могут показать увеличрованную секретирование от больных или злокачественных клеток, и аккумулировать в большинств жидкостях тела, exosomes будут предметом всестороннего и систематического исследования как перспективнейший минимально инвазивные средства для выявления специфических условий заболевания и мониторинга их реакции на лечение21.
Выделения экзосом изоляция, которая необходима для большинств в настоящее время анализов выделения экзосом, Длинномерная и трудн-интенсивная процедура, ограничивая клинический перевод выделения экзосом-связанных биомаркеров с потенциальной медицинской релевантностью. Многие распространенные методы изоляции (ультрагастрифугация, размер-исключение, осадки и т.д.) часто недостаточно различают exosomes (30 – 100 Нм) от микро-пузырьков (100 – 1000 Нм) и апоптотических тел (100 – 5000 нм) из-за дублирования в их размерах или физические свойства или могут повредить выделения экзосом целостность15. Новые подходы находятся в стадии разработки, которые могут позволить более быстрого выделения экзосом анализа, но это не ясно, насколько это возможно для реализации многих из этих платформ в клинических условиях из-за.
В этом отчете мы представляем новый подход, который позволяет выделения экзосом квантификации на основе наностатей с использованием низких увеличенное изображение темного поля микроскопа. Этот метод не требует выделения экзосом очистки, дорогостоящего специального оборудования или новых технических знаний и, таким образом, должен поддаваться быстрому переводу в большинстве исследований и клинических условиях. Наш анализ может быть применен для точного количественного измерения концентрации целевого выделения экзосом населения подшипника конкретного биомаркера, когда результаты анализа сравниваются со стандартной кривой, так как наши результаты выставки есть сильная линейная корреляция (R2 = 0,99) между оптической реакцией и выделения экзосом концентрацией. Чтобы продемонстрировать реальный мировой потенциал этого подхода, мы предоставили данные, где мы использовали этот метод для количественной оценки концентрации выделения экзосом, связанного с раком поджелудочной железы в образцах сыворотки, полученных от пациентов с и без раком поджелудочной железы.
В LMMFM, весь образец хорошо отображаемого, чтобы избежать смещения отбора, найденных в высоком увеличении DFM-анализа, где пользователи должны непосредственно выбрать образец полей для захвата для последующего анализа изображения, но подлежит свету рассеяния артефакты с поверхности нарушения, включая царапины и образец мусора. Этот фон может быть сокращен до обнаружения целевого выделения экзосом-полученного сигнала с помощью нашего DSM шумоподавления алгоритм, который работает на анализ изображения низ программы, Iiieej, но следует по-прежнему следует принимать во избежание введения таких артефактов, которые могут уменьшить динамический диапазон анализа.
Материалы, используемые в этом анализа:
Многотонные Сверхпротеиновые слайды A/G, удерживаные 1 мкл/колодец, были приобретены у корпорации Arrayit (AGMSM192BC). Наночастицы были получены из наночастиц (C12-25 -650-TN-DIH-50-1, 6,4 x 1012/мл). DFM-изображения были захвачены с цифровой камерой Nikon DiR2, прикрепленной к микроскопу Nikon Ti-Eclipse, с последовательным освещением и временем экспозиции 1/220 s. Клеточная линия PANC-1, используемая в данном исследовании, была приобретена у американской коллекции культурного типа.

Exosomes выпускаются из большинства типов клеток и играют ключевую роль в связи между ячейками клеток, включая патофизиологические процессы, связанные с различными заболеваниями, так как они могут быть домом для определенных тканей или типов клеток, и содержат различные нуклеиновые кислоты , белки и липиды, которые отражают их ячейки происхождения и могут оказывать регламентационные эффекты на их клетках-реципиентов1,2,3,4. Exosomes часто секретируются на повышенном уровне в состояниях состояний, могут взаимодействовать как с соседними, так и с отдаленными клетками, и находятся при относительно высокой концентрации в обращении, а также в большинстве других жидкостей организма, включая слюну, мочу, поджелудочную и желчь сок, и бронкоальвеолярный промывание жидкость5,6,7,8,9,10,11. Это изобилие и устойчивость exosomes в жидкостях организма человека, в сочетании с их богатой информацией природы, делает их идеальными биомаркеров для диагностики заболеваний и мониторинга лечения.
Это включает в себя опухоль-производные exosomes (TDEs), которые содержат опухоль конкретных или селективных факторов, которые могут служить в качестве биомаркеров болезни, в том числе опухоль связанных мутантных аллелей. TDEs может участвовать в реконструкции микроокружения опухоли для облегчения развития опухоли и метастазов, и регулировать анти-опухолевые ответы12. Увеличение секреции TDE является распространенным фенотипом большинства видов рака, и некоторые особенности микроокружения опухоли, включая гипоксию, кислотный рН и воспаление, как известно, способствуют выделения экзосом секреции. Удивительно, учитывая количество клеток, которые выделяют exosomes, увеличение общего уровня выделения экзосом может, само по себе, функционировать в качестве биомаркера рака. Например, недавнее исследование показало, что общая концентрация EV в желчных соке дискриминирует злокачественные и незлокачественные в общих желчных протоков стеноза пациентов с 100% точность7. Аналогичные результаты были обнаружены в исследованиях с использованием других жидкостей организма, в том числе плазмы. Однако, из-за возможности для предмета к изменению предмета, и других смешанных факторов, большинство исследований, исследывающих exosomes как Биомаркеры болезни были сосредоточены на обнаружении биомаркеров, которые выборочно связаны с TDEs вместо полного выделения экзосом Номера.
Перевод выделения экзосом биомаркеров в клиническую практику, однако, остается сложной задачей, поскольку большинство зарегистрированных выделения экзосом методов анализа требуют трудоемких и трудоемких процедур изоляции 13. В настоящее время популярные методы выделения экзосом изоляции включают ультрагастрифугагации, градиенты плотности, размер-исключение, Co-высыпания, захват сродства, и микрофлюидная изоляция причаливает. Ультра«золотой стандарт» метод, и наиболее обыкновенно использован для выделения экзосом изоляций, но эта процедура отнимает много времени и приводит к в выделения экзосом повреждении и выделения экзосом мембране кластеризации, и производит выделения экзосом пробы которые загрязнены с белки, липопротеины и другие факторы, которые могут влиять на последующий анализ14. Наиболее выделения экзосом методы изоляции, включая ультрахризугации, не могут отделить exosomes (30 – 150 Нм) от микро-везикулы (100 – 1000 Нм) и апоптотических тел (100 – 5000 нм), которые возникают при помощи различных механизмов и имеют различные функции, из-за размера между этими группами и разнообразием выделения экзосом популяций15. Необходимы новые подходы для улучшения чувствительности и воспроизводимости выделения экзосом анализа путем улучшения выделения экзосом восстановления при одновременном снижении выделения экзосом повреждения и загрязнения, хотя любые исследования, основанные на таких методах также должны быть оптимизированы, чтобы сделать их подходит для перевода на приложения в клинических условиях.
Несколько недавних изучений предлагали использовать интегрированные платформы для того чтобы захватить и проанализировать exosomes сразу от жидкостей тела. Эти методы используют микрофлюидную, электрокинетическую, улавливание, и различные другие методы для выделения экзосом изоляции, и электрохимию, резонанс поверхности плазмона, и другие методы для того чтобы обнаружить захваченное exosomes. Не ясно, насколько осуществимо многие из этих подходов будут в клинических условиях, из-за их сложности, расход, низкая пропускная способность или другие вопросы.
Мы разработали быстрый и недорогой анализ, который может быть использован для чувствительной и конкретной количественной оценки общих exosomes и конкретных подтипов выделения экзосом, включая связанные с болезнью exosomes, такие как TDEs, который требует лишь небольшого количества образца и который использует Оптимизированный рабочий процесс, подходящий для клинической среды. В этом пробирке, скольжение покрыно с антителами которые связывают или выделения экзосом-специфически или заболевание-специфически маркер выраженное на поверхности выделения экзосом для того чтобы сразу захватить цель exosomes присутствующего в малом объеме пробы плазмы или сыворотки прилоёных к скваживам на Слайд. Захваченные exosomes затем гибридизированных с антитело-пряные нано, что признает биомаркеров интереса на этих exosomes, которые могут быть либо общий выделения экзосом маркер или фактор, специфичен для выделения экзосом подтипа интереса. Изображения этих образцов скважин затем захватили с помощью темного поля микроскопа (DFM) и проанализированы для измерения света, рассеянного от наночастиц, связанных с exosomes интерес захватили в каждом образце хорошо6,16,17. Примечательно, что визуализация всего образца также низким увеличением DFM (LMDFM) позволяет избежать смещения отбора, с которым сталкиваются большие увеличения DFM-анализа, когда пользователи должны непосредственно выбирать, какие поля захватить для последующего анализа изображения. LMMFM анализ изображений подлежит свет рассеяния артефакты от поверхностных нарушений, в том числе царапины и образец мусора, но этот фон может быть уменьшена с помощью простого шумоподавления алгоритм, который мы разработали для работы на анализ изображения низ программы, Имиджей (https://imagej.nih.gov/ij/). Этот алгоритм сначала применяет порог контура ввода, используемый для обнаружения границ образца и для определения области изображения для последующего анализа. Область, определяемая этой области контура, затем делится на отдельный сигнал, присутствующий в красных, синих и зеленых каналах изображения, а синий канал вычитается из красного канала для удаления сигнала, возникающего из поверхностных артефактов и неравномерного освещения из наноода Сигнал.
В этой статье описывается, как использовать этот анализ для быстрой количественной оценки либо полного, либо специфического уровня выделения экзосом в образцах плазмы или сыворотки.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:836px;" width="836">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Eppendorf Repeater stream</td>
			<td style="width:120px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:187px;">05-401-040</td>
			<td style="width:219px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Eppendorf Research plus</td>
			<td style="width:120px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:187px;">3120000011</td>
			<td>0.1 &#8211; 2.5 &#181;L, dark gray</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:311px;">Functionalized Gold Nanorods</td>
			<td style="width:120px;">Nanopartz</td>
			<td style="width:187px;">C12-25-650-TN-DIH-50-1</td>
			<td style="width:219px;">In vitro neutravidin polymer functionalization</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:311px;">HulaMixer Sample Mixer</td>
			<td style="width:120px;">Thermo Fisher Scientific</td>
			<td style="width:187px;">15920D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:311px;">Incu-shaker 10L</td>
			<td style="width:120px;">Benchmark Scientific</td>
			<td style="width:187px;">H1010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:311px;">Inverted Research Microscope</td>
			<td style="width:120px;">Nikon</td>
			<td style="width:187px;">Ti-DH</td>
			<td style="width:219px;">With Dark field condenser, DS-Ri2 camera, and Ti-SH-U universal holder, and motorized stage</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">NIS-Elements</td>
			<td style="width:120px;">Nikon</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td>Microscope imaging software</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:311px;">Phosphate Buffered Saline (1X)</td>
			<td style="width:120px;">GE Healthcare Life Sciences</td>
			<td style="width:187px;">SH30256.02</td>
			<td>HyClone</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Protein A/G Treated Glass Substrate Slides</td>
			<td style="width:120px;">Arrayit Corp.</td>
			<td style="width:187px;">AGMSM192BC</td>
			<td style="width:219px;">Premium microarray substrate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Q500 Sonicator</td>
			<td style="width:120px;">Qsonica, LLC</td>
			<td style="width:187px;">Q500-110</td>
			<td>With standard probe (#4220)</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:311px;">Superblock blocking buffer</td>
			<td style="width:120px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:187px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:311px;">TWEEN 20</td>
			<td style="width:120px;">Sigma Life Sciences</td>
			<td style="width:187px;">9005-64-5</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

using nanoplasmon-enhanced scattering and low-magnification microscope imaging to quantify tumor-derived exosomes

Инфицированные или злокачественные клетки часто выделяют больше exosomes, что приводит к повышенному уровню заболеваний, связанных exosomes в обращении. Эти exosomes имеют потенциал служить в качестве биомаркеров для диагностики заболеваний и мониторинга прогрессирования заболевания и реакции на лечение. Однако, большинств выделения экзосом анализы требуют выделения экзосом изоляции и шаги очищения, которые обычно требующий много времени и трудоёмко, и таким образом лимитированное общее назначение в клинических установках. В этом отчете описывается быстрая процедура анализа специфических биомаркеров на внешней мембране exosomes без отдельной изоляции и шагов очищения. В этом методе, exosomes захвачены на поверхности слайда выделения экзосом-специфических антител и затем гибридизированный с нанозондами-пряные антитела датчики специфическая для болезни. После гибридизации, обилие целевого выделения экзосом населения определяется путем анализа низкочастотного микроскопа темного поля (LMDFM) изображений связанных наночастиц. Этот подход может быть легко принят для исследования и клинического использования для анализа мембранно-ассоциированные выделения экзосом Биомаркеры связаны с болезнью.

Multi-well протеин A/G покрыл скольжения (Диаграмма 1A) было функционализировано с антителом Anti-EphA2 и после этого использовано специфически для того чтобы захватить EphA2-положительное exosomes от образцов сыворотки пациентов с и без поджелудочного рака (1 мкл/наилучшим образом) и инкубировано с золотыми наносами, сопрягается с антителом Anti-CD9 (Рисунок 1B). DFM-изображения света, рассеянного от этих наночастиц были проанализированы с использованием плагина DSM в Iifiej программного обеспечения для количественной оценки связанного Эф-2 положительный exosomes в каждом хорошо. Алгоритм DSM автоматически определяет границу образца, отфильтровывает шум от артефактов, вычисляет рассеянный сигнал от каждого колодца и выводит эту информацию (рис. 2). Алгоритм DSM сильно ослабляет артефакты рассеяния света от царапин или мусора, присутствующих в образце и улучшает чувствительность и воспроизводимость наночастиц обнаружения и может автоматически обрабатывать партию слайдов изображений для высокой пропускной способностью Использовать. Этот алгоритм использует команды и параметры, вводимые пользователем, для вычитания фона изображения, расчета сигнала рассеяния от каждого колодца и вывода файла данных и изображений (Рисунок 3). Регионы, представляющие интерес, определяются высокой интенсивностью, а также границами в изображении захвата с использованием контура порога программы маидж макрос. Анализ изображений использует предопределенный порог контура и параметры изображения для вычисления интенсивности рассеяния наноматериалов для каждого колодца.
Как сообщалось в нашей предыдущей работы (дополнительная информация Лян et al.6), exosomes изолированы от Panc-1 клеточных культур, характеризующихся просвечивающей электронной микроскопии и Вестерн-блот выставлены размер диапазона, морфология, и белка маркер выражение согласуется с образцом высокой чистоты выделения экзосом. Exosomes PANC-1, подготовленный с той же процедурой, что и наша предыдущая работа, были использованы здесь для подтверждения нашего nPES анализа для выделения экзосом количественной оценки. Этот анализ использовал антитело anti-EphA2 для того чтобы захватить большую населенность exosomes от полного выделения экзосом населенности и антитела против вообще выделения экзосом протеина CD9 для того чтобы обнаружить захваченное exosomes. Результаты, полученные с использованием серийно разбавленных проб PANC-1 выделения экзосом, с концентрацией белка в диапазоне от 0,24 до 1,2 мкг/мкл, показали хорошую воспроизводимость в реплицирующихся скважинах (рис. 4A) и сильную линейную корреляцию между реакцией рассеивания и выделения экзосом концентрация белка (рис. 4B).
Для того чтобы продемонстрировать потенциальное применение этого метода, пробы сыворотки от пациентов с и без поджелудочного рака были проанализированы для того чтобы обнаружить обилие сыворотки exosomes выражая рак-связанный биомаркер EphA2, использующ антитело anti-EphA2 к сразу захват цели exosomes от сыворотки и наночастиц сопрягано с антителом Anti-CD9 для того чтобы обнаружить прыгнутого exosomes. Этот анализ показал что пробы сыворотки от поджелудочных больных рака имели значительно более высокие уровни EphA2 + exosomes (Диаграмма 5) чем их управления.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59177/59177fig1.jpg"> Диаграмма 1: схема выделения экзосом количественной оценки. A) схема с несколькими скважинами белка A/G слайды (192 скважин), используемых в этом анализа. (B) Целевая exosomes непосредственно захватили из образцов, в том числе сыворотки и плазмы, по поверхности иммобилизации на антитела захвата (например, анти-EphA2 антитела) связаны с слайда, а затем инкубировали с золотыми наносами сопрягается с обнаружением Антитело (например антитела anti-CD9) перед анализом анализом изображения DFM. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59177/59177fig1large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59177/59177fig2.jpg"> Рисунок 2: выделения экзосом квантификация путем применения АЛГОРИТМА DSM к изображениям LMDFM. Изображения с низким увеличением обрабатываются алгоритмом DSM для устранения артефактов фоновых сигналов и сигналов, которые могут возникать из-за царапин, смешивания пустот, мусора и неравномерного освещения образцов, что позволяет обеспечить надежное обнаружение сигнала золотого наноода, который коррелирует с выделения экзосом концентрацией. Эта цифра была адаптирована с разрешения ВС, D. et al. метод снижения шума для количественной Нанораспыленной рассеяния света в низком увеличении темно-полевой Микроскоп FAR-Field изображения. Аналитическая химия. 88 (24), 12001-12005 (2016). Авторское право (2016) Американское химическое общество. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59177/59177fig2large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59177/59177fig3.jpg"> Рисунок 3: схема команд DSM-алгоритмов и выходов. Указанные шаги использовать родные команды из Iiiej и все входные параметры выбираются в соответствии с требованиями экспериментов с помощью графического пользовательского интерфейса. Эта цифра была адаптирована с разрешения ВС, D. et al. метод снижения шума для количественной Нанораспыленной рассеяния света в низком увеличении темно-полевой Микроскоп FAR-Field изображения. Аналитическая химия. 88 (24), 12001-12005 (2016). Авторское право (2016) Американское химическое общество. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59177/59177fig3large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59177/59177fig4.jpg"> Рисунок 4: репрезентативные изображения nPES LMDFM и данные о выходе DSM. (A) изображение lmmfm-анализа NPES анализа градиента концентрации Panc-1 exosomes и (B) линейной корреляции оптического сигнала и выделения экзосом концентрации от этого слайда (слева направо: 0,24, 0,356, 0,53, 0,80, 1,20 мкг/мкл соответственно для каждой колонки). Данные представляются как среднее ± SE, n = 6, с коэффициентом корреляции Пирсона R2 = 0,99 и коэффициент вариации для реплицирует каждой концентрации < 0,2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59177/59177fig4large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/59177/59177fig5.jpg"> Рисунок 5: сигнал LMDFM EphA2+ exosomes отличается в сыворотке крови от пациентов с раком поджелудочной железы и без него. Пробы сыворотки проанализированные nPES использующ антитело anti-EphA2 захват (рак-Associated) и антитело anti-CD9 обнаружения (генералитет выделения экзосом маркер) показал существенную разницу в концентрации EphA2 + exosomes в образцах сыворотки пациентов с и без рака поджелудочной железы (N = 7/Группа). Результаты представлены как среднее ± SE. * *p = 0,002 Манн-Уитни U-Test (двусторонняя). Эта цифра была изменена с [ВС, D. et al. шумоподавления метод для количественного Нанораспыляющая рассеяние света в низком увеличении темно-полевой Микроскоп далеко-полевые изображения. Аналитическая химия. 88 (24), 12001-12005 (2016)]. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/59177/59177fig5large.jpg" target="_blank">Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы посмотреть увеличенном варианте этой фигуры.</a>

Watch this Scientific Journal Video about Using Nanoplasmon-Enhanced Scattering and Low-Magnification Microscope Imaging to Quantify Tumor-Derived Exosomes at JoVE.com

Using Nanoplasmon-Enhanced Scattering and Low-Magnification Microscope Imaging to Quantify Tumor-Derived Exosomes

Использование Наноплазмона-усиленного рассеяния и Низкоувеличенного микроскопа визуализации для количественной оценки опухоли-производные Exosomes

Клинический перевод биомаркеров, полученных с помощью выделения экзосом, для больных и злокачественных клеток затруднен из-за отсутствия быстрых и точных методов количественной оценки. Этот отчет описывает использование изображений с низким увеличением темно-полевого микроскопа для количественной оценки конкретных подтипов выделения экзосом в малых объемах сыворотки или плазменных образцах.

Infected or malignant cells frequently secrete more exosomes, leading to elevated levels of disease-associated exosomes in the circulation. These exosomes ...

Наноплазмон-улучшенное рассеяние, или nPES, является простой и неинвазивной альтернативой хирургической биопсии, которая может пропустить трудоемкие и трудоемкие шаги по очистке экзосомы, расширяя применение экзосомного анализа до клинических условий. Этот анализ nPES является быстрой процедурой для анализа конкретных биомаркеров на внешней мембране экзосом, которая не требует отдельных шагов изоляции и очистки. Нам нужен только очень маленький клинический образец для этого анализа.Таким образом, этот метод может расширить использование nPES для изучения генетически модифицированных или PDX мышиных моделей. Есть несколько шагов в этом протоколе, которые могут показаться пугающими. Тем не менее, с несколькими практикой работает, каждый с основными навыками мокрой лаборатории можно научиться успешно выполнять nPES.Для начала процедуры объедините 40 микролитров подвески нанородов NeutrAvidin с 200 микролитров холодного, рН семь фосфатно-буферизированных солевые растворы. Центрифуга смеси при 8500 раз г при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут, и удалить супернатант. Повторите этот процесс стирки в два раза больше, а затем повторно нанородов в 40 микролитров холодного PBS.Далее добавьте 150 микролитров холодного PBS и 10 микролитров раствора 0,5 миллиграмма на миллилитр соответствующих биотинилированных антител к суспензии. Смешайте при четырех градусах по Цельсию в течение двух часов, чтобы получить антитела спряженных золотых нанородов. Вымойте нанород три раза центрифугации в 200-микролитровых порциях холодного PBS при 6500 раз g при четырех градусах Цельсия в течение 10 минут каждый.После этого, resuspend промывают антитела спряженных нанородов в 200 микролитров холодного PBS, и хранить их при четырех градусах по Цельсию на срок до 24 часов. Чтобы начать подготовку слайда, разбавить желаемого экзосомы захвата антител до 025 миллиграммов на миллилитр в PBS. Pipette один микролитер этого раствора в каждой колодец белка A / G-обработанные слайд при поддержке оптического класса стекла.Затем перенесите слайд в увлажняющую коробку, чтобы скважины не высохли во время инкубации. Инкубировать слайд при 37 градусах по Цельсию в течение одного часа, чтобы обездвижить захват антител. Затем, аспирировать оставшийся раствор для удаления несыхух антител.Вымойте скважины, добавив и аспирируя один микролитер PBS три раза. Затем быстро загрузите каждую колодец одним микролитером блокирующего буфера на основе PBS и инкубировать слайд при 37 градусах по Цельсию в течение двух часов. При запуске около 15 образцов, мы должны использовать одноканайонный пипетку для загрузки блокирующего буфера на 120 скважин менее чем за пять минут, чтобы избежать испарения блокирующего агента.Начните готовить раствор конъюгированных антителами золотых нанородов во время блокирования слайдов. Примерно за 30 минут до блокирования отделки, быстро разморозить плазмы или сыворотки образцов в комнатной температуре водяной бане. Vortex размороженных образцов в течение 30 секунд, чтобы убедиться, что подвески являются однородными.Затем центрифуга образцов в 500 раз g в течение 15 минут, чтобы вызвать белковые агрегаты и другой мусор. Передача 10-микролитровых алицитов супернатанта на свежие трубки, и сделать один-к-одному разбавления с PBS. Смешайте разбавленные образцы нежным вихрем или инверсией по мере необходимости.Когда блокировка слайда закончена, аспирировать блокирующий буфер и мыть скважины три раза с помощью одномиберосных частей PBS. Немедленно загрузите образцы в скважины одним микролитером на скважину и восемью тиражами на образец. Загрузите стандарты экзосомы в соответствующие скважины таким же образом.Инкубировать слайд в течение 12 до 18 часов в холодильнике при четырех градусах по Цельсию. Затем, аспирировать колодцы, и мыть каждый хорошо один раз с одним микролитером PBS. Загрузите один микролитер спрягаемой золотой нанородной подвески в каждую колодец и инкубировать горку при 37 градусах по Цельсию в течение двух часов.После этого, аспирировать подвеску нанорода, и мыть слайд в PBS дополняется 1%полисорбат 20 в течение 10 минут с помощью смесителя. Затем, аспирировать колодцы, и мыть слайд в деионизированной воде в течение 10 минут на вращающийся смеситель. Удалите воду и дайте слайду высохнуть в чистой чашке Петри перед тем, как донести слайд до темного полевого микроскопа.Настройка перевернутого микроскопа, оснащенного конденсатором погружения в нефть темного поля, 4x целью и моторизованной ступени. Подключите микроскоп к компьютеру с помощью цифровой камеры и откройте программное обеспечение для визуализации. Затем поместите образец слайда вверх дном на стадии микроскопа, и применить небольшую каплю масла погружения, где конденсатор объектив контактов слайда.Отображение представления через микроскоп в программном обеспечении для визуализации. Отрегулируйте время экспозиции по отношению к стандарту высокой концентрации, чтобы убедиться, что изображение не будет насыщено. Затем откройте инструмент для сканирования больших изображений и установите объективное увеличение до 10 раз.Выберите, чтобы закрыть активный затвор во время движения этапа и ждать 20 миллисекунд перед каждым захватом. Установите перекрытие стежка до 20% и выберите сшивание через оптимальный путь. Выберите для создания большого изображения из сканирования.Установите камеру, чтобы сосредоточиться вручную в начале сканирования, и включить автоматическое пошаговое внимание каждые 20 полей. Затем выберите установить левые, правые, верхние и нижние пределы для целевого поля сканирования и определить область сканирования, перемещая стадию микроскопа к каждому из желаемых пределов. Затем отрегулируйте фокус, конденсатор и освещение области, чтобы получить четкое, хорошо освещенное изображение.Назовите созданный файл изображения и начните сканирование. Когда он закончит, откройте изображение и сохраните его в масштабе 1/8. Откройте программное обеспечение для анализа изображений.Затем откройте меню Plugins, нажмите DSM Scan, определите количество столбцов и строк, установите процент размера до 25, установите диаметр пятна в пикселях до 190-200, установите диапазон диаметра до 32 и установите диаметр прироста в пикселях до восьми. Установите низкие и высокие пределы DSM до нуля и 62, прилегающее расстояние до 100 и смещение вычитания до нуля. Запустите алгоритм DSM и сохраните полученные данные.Метод анализа DSM показал хорошую воспроизводимость в последовательно разбавленных экзосомных образцах PANC-1 в диапазоне от 0,24 до 1,2 микрограмма на микролитер. Наблюдалась сильная линейная корреляция между реакцией рассеяния нанородов золота и концентрацией белка экзосомы. Значительная разница в изобилии экзосом сыворотки, выражаюющих связанный с раком биомаркер EphA2, наблюдалась между пациентами с раком поджелудочной железы и здоровыми пациентами.С добавлением блокирующего агента вперед, быстрый и точный трубопровод имеет решающее значение, чтобы избежать испарения образцов, введения перекрестного загрязнения, и царапины поверхности слайда. Следуя этой процедуре, мы выполняем статистический анализ, чтобы исследовать любую корреляцию между выражением экзосомального биомаркера интереса и различной стадией исследуемого заболевания. После создания этой технологии, и мы в состоянии найти экзосомные биомаркеры для ранней стадии рака поджелудочной железы.В настоящее время мы расширяем это открытие на другие виды рака и инфекционных заболеваний. Как правило, образцы обрабатываются в этом анализе либо пациента образцов или очищенных образцов экзосомы из раковых клеток линий, которые требуют специальной подготовки безопасности.

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Design of a Cyclic Pressure Bioreactor for the Ex Vivo Study of Aortic Heart Valves

Дизайн Циклические биореактора давление для Ex Vivo Изучение аортального клапанов сердца

The aortic valve, located between the left ventricle and the aorta, allows for unidirectional blood flow, preventing backflow into the ventricle. Aortic ...

Small and Wide Angle X-Ray Scattering Studies of Biological Macromolecules in Solution

Малый и широкий угол рассеяния рентгеновских лучей исследования биологических макромолекул в растворе

In this paper, Small and Wide Angle X-ray Scattering (SWAXS) analysis of macromolecules is demonstrated through experimentation. SWAXS is a technique ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

От быстрого флуоресценции визуализации к молекулярной диффузии Закона о живых клеточных мембран в торговом микроскоп

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

High Speed Sub-GHz Spectrometer for Brillouin Scattering Analysis

Высокоскоростной югу ГГц спектрометр для анализа рассеяния Бриллюэна

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a ...

Selective Cell Elimination from Mixed 3D Culture Using a Near Infrared Photoimmunotherapy Technique

Селективный Cell Исключение из смешанной 3D культуры Использование ближней инфракрасной области Photoimmunotherapy Техника

Recent developments in tissue engineering offer innovative solutions for many diseases. For example, tissue engineering using induced pluripotent stem ...

A Rapid and Chemical-free Hemoglobin Assay with Photothermal Angular Light Scattering

Быстрой и Бесхимический Гемоглобин Анализ с фототермического углового рассеяния света

Photo-thermal angular light scattering (PT-AS) is a novel optical method for measuring the hemoglobin concentration ([Hb]) of blood samples. On the basis ...

Using Extraordinary Optical Transmission to Quantify Cardiac Biomarkers in Human Serum

Использование чрезвычайных оптической передачи для количественного определения сердечного биомаркеров в сыворотке крови человека

For a biosensing platform to have clinical relevance in point-of-care (POC) settings, assay sensitivity, reproducibility, and ability to reliably monitor ...

Targeting Neuronal Fiber Tracts for Deep Brain Stimulation Therapy Using Interactive, Patient-Specific Models

Ориентация нейрональных волокна участки для глубоких мозга стимуляции терапии с использованием интерактивных, пациент конкретных моделей

Deep brain stimulation (DBS), which involves insertion of an electrode to deliver stimulation to a localized brain region, is an established therapy for ...

Stiffness Measurement of Soft Silicone Substrates for Mechanobiology Studies Using a Widefield Fluorescence Microscope

Жесткость измерения мягкого силикона субстратов для Mechanobiology исследований с использованием Widefield флуоресцентным микроскопом

Soft tissues in the human body typically have stiffness in the kilopascal (kPa) range. Accordingly, silicone and hydrogel flexible substrates have been ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Проведение нескольких режимов изображения с одной флуоресцентным микроскопом

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...