Name: isolation of adipose derived regenerative cells for the treatment of erectile dysfunction following radical prostatectomy
Uploaded: 2021-12-28T14:00:00
Duration: 9 min 49 s
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Este trabajo ha sido fundado por el Hospital Universitario de Odense (11/31936), el Centro Danés de Medicina Regenerativa (14/50427) y la Sociedad Danesa del Cáncer.

Todos los métodos descritos en el protocolo fueron aprobados por el Comité Nacional de Ética de Dinamarca (No. 37054), la Autoridad Danesa de Salud y Medicamentos (número EUDRA-CT 2013-004220-11) y la Agencia Danesa de Protección de Datos (2008-58-0035). El estudio se registró en ClinicalTrials.gov (NCT02240823). El estudio se realizó de acuerdo con la Declaración de Helsinki monitoreada por la unidad de Buenas Prácticas Clínicas (GCP) del Hospital Universitario de Odense. La preparación de ADRC se llevó a cabo en un establecimiento autorizado de tejidos para el manejo de tejidos y células humanas en el Hospital Universitario de Odense (Autoridad Danesa de Salud y Medicamentos, Autorización n.º 29035).
1. Reclutamiento de pacientes/participantes
<ol><li>Para participar en el ensayo, reclute pacientes que cumplan los siguientes criterios de inclusión.<ol>
<li>Reclutar pacientes mayores de 18 años, sexualmente activos antes de la RP y no infectados con las enfermedades de transmisión sexual, por ejemplo, infección por el virus de la inmunodeficiencia humana, sífilis o hepatitis.</li>
		<li>Asegúrese de que sufren de disfunción eréctil después de una RP que se realizó debido al cáncer de próstata. NOTA: En este estudio, los pacientes se inscribieron en el estudio 5-18 meses después de la RP y se incluyeron independientemente del método de cirugía: abierto / asistido por robot o de búsqueda nerviosa / no nerviosa.</li>
		<li>Asegurar que el valor del antígeno prostático específico (PSA) tenía que ser indetectable en el seguimiento clínico después de la RP.</li>
		<li>Asegúrese de que los pacientes fueran sexualmente activos antes de la RP, y aún expresando su deseo de permanecer sexualmente activos después de la RP. Asegúrese de que la intervención farmacológica con un inhibidor de la fosfodiesterasa tipo 5 (inhibidor de la PDE5 ) o un análogo sintético de la prostaglandina E1 (PGE1) se ha intentado antes de participar y se considera insuficiente.</li>
		<li>Además, asegúrese de que los pacientes tengan suficiente grasa subcutánea en el abdomen o el muslo.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Excluir a los pacientes del ensayo, si hubo eventos graves bajo la anestesia durante la RP o si fueron tratados con anticoagulantes.</li>
</ol>2. Liposucción
NOTA: La liposucción es una operación que elimina la grasa o los lipocitos de la zona subcutánea. Esta parte del protocolo se realiza como una liposucción estándar y el procedimiento se realiza en condiciones estériles en un quirófano. Todos los instrumentos utilizados durante el procedimiento deben ser estériles y el cirujano debe usar exfoliantes, bata quirúrgica estéril, guantes estériles, máscara quirúrgica y sombrero.
<ol><li>Anestesiar al paciente.<ol>
<li>Asegúrese de que el paciente esté bajo anestesia general durante el procedimiento, y esta parte es realizada por un anestesiólogo.</li>
		<li>Desinfectar la piel del abdomen y el escroto con clorhexidina 0.5% (aguardiente de clorhexidina, 96% de digluconato de clorhexidina medicado con etanol 77% W/W = 83% v/v). Utilice un marcador quirúrgico para dibujar las áreas en el abdomen donde se realizará la liposucción. El área generalmente será el área entre la sínfisis y el ombligo.</li>
	</ol></li>
	<li>Haga dos incisiones de 6 mm de ancho en la piel del abdomen con un bisturí (número 11). Coloque las incisiones simétrica y lateralmente desde el área hacia arriba de la liposucción.<ol>
<li>Ponga un poco de lubricante como vaselina en las incisiones, para asegurarse de que la cánula de infiltración se deslice dentro y fuera de las incisiones fácilmente durante la liposucción.</li>
	</ol></li>
	<li>Introducir una cánula de infiltración tamaño 14 G a través de las incisiones en la piel. Inyecte la solución modificada de Kleins por vía subcutánea en las áreas marcadas paralelas a la superficie de la piel. Inyecte tanto de la solución que el tejido objetivo se vuelva hinchado y firme, o tumescente. NOTA: La solución de Kleins modificada consiste en una solución de 1.000 ml de lactato de Ringers y 1 mg de adrenalina (epinefrina (1:1.000.000)). No aplique anestesia local a la solución, ya que puede tener un impacto negativo en los ADRC.<ol>
<li>Inyecte un volumen de solución de Kleins modificada que corresponda a la proporción 1:1 con respecto al tejido adiposo.</li>
		<li>Espere 10 minutos para maximizar el efecto de la adrenalina y reducir la cantidad de sangre en el tejido adiposo recolectado.</li>
	</ol></li>
	<li>Realice una liposucción estándar utilizando una liposucción de infusión a chorro para cosechar 200-300 ml de tejido adiposo. Use cánulas romas que sean huecas, a las que se integran un tubo de infusión y una boquilla. Conecte la cánula a un dispositivo de succión para la liposucción. NOTA: Una infusión continua de agua en forma de abanico afloja el tejido graso en fragmentos que se pueden succionar fácilmente a través de la abertura en la cánula.<ol>
<li>Introducir una jeringa de 3 mm con una punta roma a través de las incisiones en el abdomen</li>
	</ol></li>
	<li>Recoger el tejido adiposo en un lipo-colector para preservar el lipoaspirado en un ambiente estéril. El lipoaspirado comenzará a separarse de la fase acuática.</li>
	<li>Use jeringas estériles de 50 ml para succionar el lipoaspirado del lipocolector.<ol>
<li>Minimice el volumen de agua aspirada en las jeringas y atornille un tapón en la punta de las jeringas para mantener el tejido adiposo estéril.</li>
	</ol></li>
	<li>Coloque las jeringas con la punta hacia abajo en una bolsa de plástico estéril para iniciar la separación del lipoaspirado de la fase acuosa. Coloque la bolsa en un recipiente estéril aún con las puntas hacia abajo para continuar la separación.<ol>
<li>Cubra el recipiente con una cortina estéril para asegurar el ambiente estéril durante el transporte. NOTA: De acuerdo con el manual de usuario de la máquina utilizada para el aislamiento, el lipoaspirado se puede almacenar hasta un máximo de 4 h antes del aislamiento de los ADRC, sin embargo, siempre lo procesamos de inmediato.</li>
	</ol></li>
	<li>Cierre las incisiones de la piel con el material de sutura preferido por los cirujanos. Coloque una prenda de compresión, un aglutinante abdominal, alrededor del abdomen para reducir el edema postoperatorio.</li>
	<li>Haga un bloqueo del pene inyectando 20 ml de bupivacaína 5 mg / ml que contenga 5 μg de adrenalina.<ol>
<li>Use una jeringa de 20 ml y aplíquela con una aguja de 23 G, de 1 1/4 de pulgada de largo.</li>
		<li>Aplicar 5 ml de bupivacaína en cada cuadrante del subcutis.</li>
		<li>Inyecte la bupivacaína en dos sitios, uno colocado ventralmente y el otro dorsalmente. Introduzca la aguja en toda su longitud en el tejido subcutáneo apuntando la aguja lateralmente hacia la derecha e inyecte la anestesia a medida que la aguja se retrae. Repita la inyección apuntando la aguja hacia la izquierda. NOTA: El paciente ahora puede ser despertado de la anestesia general por el anestesiólogo.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Aislamiento de los ADRC
NOTA: El proceso de aislamiento de los ADRC se realiza como se describe en detalle en el manual del usuario después del dispositivo (consulte la Tabla de materiales). Es importante que el procedimiento se realice en condiciones estériles para garantizar que el lipoaspirado no esté expuesto a ningún contaminante durante la purificación de los ADRC. El tiempo necesario para el aislamiento de los ADRC depende del volumen de lipoaspiración, pero todo el procedimiento durará aproximadamente 2,5 h utilizando el dispositivo semiautomático como se describe aquí.
<ol><li>Coloque todos los consumibles y enzimas asépticamente sobre una mesa cubierta por una toalla quirúrgica desechable estéril. NOTA: Un kit de procedimiento contiene todos los consumibles y enzimas necesarios para el aislamiento de ADRC de un paciente. Además de esto, tres bolsas de infusión de 37-39 ° C, de un litro de Ringers lactados deben estar disponibles junto con ropa estéril, guantes y toallas y etanol para la desinfección. Anote todos los números de lote de consumibles y enzimas y también la temperatura de los Ringers Lactated, cuando se conectan al sistema.<ol>
<li>Limpie el dispositivo con etanol y siga las instrucciones del fabricante</li>
		<li>Cargue el conjunto de consumibles en el dispositivo y conecte una bolsa de Ringers Lactated al sistema.</li>
		<li>Realice la serie de pruebas semiautomáticas (comprobación del sistema y prueba de fugas) antes de añadir el lipoaspirado.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Deje reposar el lipoaspirado en tubos de 50 ml mientras se realizan los pasos en 3.1. Esto permitirá que la grasa se separe de la fase líquida. Anote la cantidad total (en ml) de tejido graso y úselo para asegurarse de que la cantidad de grasa cargada esté en el rango de capacidad del dispositivo.</li>
	<li>Cargue el tejido cuando el dispositivo se lo solicite. La máquina ahora drenará el exceso de líquido y pesará la cantidad de tejido graso cargado antes de lavarlo con ringers lactados.<ol>
<li>Cuando el pañuelo se haya lavado y drenado de nuevo, conecte una nueva bolsa de infusión con timbres lactados de 37-39 °C cuando la máquina lo solicite.</li>
		<li>Reconstituir la enzima disponible comercialmente que contiene la mezcla de colagenasa y proteasa en anillos lactados de 5 ml (un vial de enzima es suficiente para cantidades de grasa de hasta 270 ml).</li>
		<li>Asegúrese de que el dispositivo muestre la cantidad de enzima (basada en el peso del tejido) para inyectar en el recipiente con el tejido graso. Una vez inyectada, la digestión enzimática que se lleva a cabo bajo agitación durará alrededor de 20 min.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Después de la digestión del tejido, deje que el agitador se detenga y verifique que el contenido esté separado en dos fases: una fase amarilla que contiene lípidos superiores y una capa rosa inferior que contiene los ADRC. Deje que esta última capa drene en la cámara de procesamiento celular (que entra en la centrífuga incorporada del dispositivo) del conjunto de consumibles, mientras deja atrás la capa lipídica.</li>
	<li>Deje que los ADRC se concentren en la cámara de procesamiento celular durante múltiples rondas de centrifugación. Ahora agregue 10 ml de Intravase (contiene DNasa, que ayuda a evitar la aglomeración en la suspensión final de ADRC) reconstituida en Lactated Ringers. La reacción enzimática dura 10 minutos después de lo cual se lavan los ADRC. NOTA: Este paso es totalmente automático y la máquina informará cuando finalice el proceso.</li>
	<li>Cuando se complete el aislamiento de los ADRC, resuspender las células en 5 ml de ringer lactato. Aspire la solución en una jeringa de 5 ml.</li>
	<li>Monte una llave de paso luer-lock hembra de 3 vías en la jeringa de 5 ml que contiene los ADRC, y aspire 4 ml de ADRC en otra jeringa estéril de 5 ml.</li>
	<li>Transfiera el último 1 ml a una jeringa de 1 ml. Utilice este 1 ml para la caracterización de ADRC, por ejemplo, recuento de células, viabilidad celular, análisis de marcadores de superficie por citometría de flujo y capacidad de diferenciación de ADRC.</li>
	<li>Coloque una aguja de 25 G en la jeringa de 5 ml que contiene los 4 ml de ADRC antes de envasarla en una cortina estéril. Use los ADRC para inyección en el receptor. En este caso, la solución de ADRC contendrá en promedio 8.4-32.7 millones de células.</li>
</ol>4. Implantación de los ADRC en cuerpos cavernosos
NOTA: Este es un procedimiento estéril. Todos los instrumentos deben ser estériles, y la persona que inyecta la solución que contiene las células madre en los cuerpos cavernosos debe usar guantes estériles. El paciente está despierto durante este procedimiento y recibirá sus propias células madre. Los ADRC se inyectan sin contar las células antes de la inyección.
<ol><li>Mantenga la solución de EDRC homogénea inclinando la jeringa suavemente hasta que se inyecte en los cuerpos cavernosos.</li>
	<li>Coloque una cortina de apertura sobre el pene. Coloque un torniquete en la raíz del pene mediante el uso de un lazo de vaso de silicona. Apriete el lazo y asegúrelo con pinzas curvas de guisante. Haga que el torniquete sea lo suficientemente apretado como para detener el flujo sanguíneo del pene.</li>
	<li>Use dos intercambios antisépticos para desinfectar la piel del pene en el sitio de inyección (sitio lateral de los cuerpos cavernosos). Inyecte 1 ml de la solución que contiene ADRC, en un ángulo directo en los cuerpos cavernosos del lado derecho en dos lugares diferentes, repita este paso después en el cuerpo cavernoso izquierdo. El volumen total de ADRC inyectados es de 4 ml.</li>
	<li>Espere 30 minutos y luego retire el torniquete.</li>
	<li>Dar de alta al paciente después de 2 h de observación después de la inyección de ADRC, para asegurar que el paciente esté bien recuperado después de la anestesia.</li>
</ol>5. Cuidados postoperatorios
<ol><li>Recomendar al paciente que no realice ningún rendimiento físico que pueda elevar la presión arterial dentro de la primera semana, para prevenir el desarrollo de hematomas.</li>
	<li>Recomendar al paciente que use el aglutinante abdominal durante 24 h los primeros 14 días después de la cirugía y en lo sucesivo durante 14 días durante el día.</li>
	<li>Tratar el dolor posquirúrgico con paracetamol oral (p. ej., paracetamol; 1.000 mg, 4 veces al día) y antiinflamatorio oral (p. ej., ibuprofeno; 400 mg 3 veces al día).</li>
</ol>

<ol>
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El autor Søren P. Sheikh es CEO de Blue Cell Therapeutics, Copenhague, Dinamarca.

El procedimiento presentado para aislar los ADRC no se limita a ser utilizado solo para la terapia de la disfunción eréctil, sino que se puede utilizar en muchas otras formas de tratamiento y experimentos. Nuestro ensayo mostró que los ADRC autólogos y recién aislados son seguros de usar, y el tratamiento es bien tolerable en un seguimiento de 12 meses.
Antes de que se utilice el procedimiento, hay que hacer algunas consideraciones. Una desventaja de este procedimiento es que el paciente debe estar bajo anestesia general durante la liposucción. La liposucción es posible realizarla bajo anestesia local, pero un ensayo previo ha demostrado que una combinación de anestésicos locales y adrenalina puede tener un impacto negativo en el crecimiento celular de los fibroblastos20. El riesgo de estar bajo anestesia general es generalmente bajo, pero aún se observa un resultado negativo. Este riesgo debe tenerse en cuenta cuando los pacientes son seleccionados para el tratamiento. La liposucción es un procedimiento quirúrgico y, por lo tanto, siempre conllevará el riesgo de complicaciones. Al igual que con todos los demás procedimientos quirúrgicos, existe el riesgo de sangrado postoperatorio que resulta en la formación de hematomas y un riesgo de infección. Algunos de nuestros pacientes también informaron una sensibilidad reducida transitoria de la piel abdominal. Una complicación inmediata de la liposucción es el sangrado. Se sabe que los pacientes corren el riesgo de contraer complicaciones sistémicas cuando se extirpan grandes cantidades de tejido. La liposucción en este procedimiento fue relativamente pequeña y, por lo tanto, no se consideró un factor de riesgo.
Las complicaciones a la inyección de células se informan como enrojecimiento transitorio, sensibilidad y hematomas.
El dispositivo utilizado para el aislamiento de los ADRC, fue elegido porque el sistema está aprobado por ce. En Dinamarca, es obligatorio utilizar equipos aprobados por la CE porque las autoridades clasifican el tratamiento con células madre como un ensayo de prueba de drogas, cuando el ADRC se utiliza para la inyección en humanos.
El dispositivo tiene ventajas como que todo el procedimiento se estandariza y se realiza en un entorno estéril cerrado sin requerir un laboratorio altamente clasificado. Por lo tanto, se reduce el riesgo de contaminación. Esto asegura que el procedimiento sea uniforme y reproducible, y que la calidad del producto final sea siempre la misma cada vez (sin embargo, también depende de la calidad del tejido de entrada). Realizar el aislamiento en el dispositivo es fácil y no requiere operadores especialmente educados.
Una limitación del dispositivo es que la entrada mínima en la máquina es de 100 g de lipoaspirado drenado. Como la liposucción está completamente terminada antes de que comience el procesamiento celular (y en nuestro caso, en un lugar diferente, no en el quirófano) en nuestra experiencia, esto requerirá que la cantidad de lipoaspirado sea de al menos 125 ml utilizando la medida aproximada de las jeringas de 50 ml. De lo contrario, existe el riesgo de que no haya suficiente material para que la máquina continúe. Además, el uso del límite del extremo superior (la entrada máxima es de 425 ml) daría como resultado un procedimiento de aislamiento muy largo.
Las células madre adultas tanto del tejido adiposo como de la médula ósea parecen tener capacidad de autorrenovación y diferenciación como las células madre embrionarias. Una de las ventajas de las ADRC sobre las células madre hemopoyéticas es un rendimiento 100-500 veces mayor por volumen tisular en comparación con la médula ósea 21,22, y, por lo tanto, las ADRC no necesitan ser cultivadas. Además, las células madre hemopoyéticas son más difíciles y más dolorosas de cosechar del paciente que el tejido adiposo. En muchas situaciones, el tejido adiposo es solo un producto de desecho después de la cirugía. Es posible cultivar células madre para dar un mayor rendimiento adecuado para la angiogénesis, sin embargo, los ADRC recién aislados pueden tener un mayor potencial angiogénico que los cultivados23.

Las células madre tienen la capacidad de diferenciarse en diferentes tipos de células, y secretan factores paracrinos que se cree que promueven el proceso de curación en el tejido dañado 1,2,3,4. Son, por tanto, atractivos dentro del campo de la medicina regenerativa, porque pueden representar un posible tratamiento curativo.
La prostatectomía radical (RP) es el tratamiento curativo de oro para pacientes con cáncer de próstata localizado de riesgo bajo/intermedio y una esperanza de vida > 10 años. El objetivo de la cirugía es la erradicación del cáncer, pero tiene varios efectos secundarios. La prevalencia de incontinencia post-prostatectomía oscila entre el 2-60% y la disfunción eréctil (DE) es experimentada por el 20-90% de los pacientes5. La técnica de preservación nerviosa es una opción en algunos pacientes (puntuación de Gleason < 7, bajo riesgo de enfermedad extracapsular)5. Esta técnica preserva los nervios que son responsables de la erección, pero a pesar de que esto es posible, muchos pacientes todavía informan disfunción eréctil después de la operación.
Las opciones de tratamiento para la rehabilitación del pene después de la RP consisten principalmente en el tratamiento con inhibidores de la PDE-5, terapia de inyección o instilación y bombas de vacío. Los medicamentos utilizados para la rehabilitación del pene difieren farmacológicamente, pero su mecanismo de acción incluye la relajación de las células del músculo liso en el cuerpo cavernoso. Sin embargo, muchos pacientes experimentan fracaso del tratamiento y nunca logran un efecto del medicamento que permita el coito6.
Se cree que la disfunción eréctil que ocurre después de la RP se debe a cambios estructuralmente irreversibles7. Estos cambios ocurren en el tejido cavernoso e incluyen apoptosis del músculo liso y células endoteliales y fibrosis. El mecanismo veno-oclusivo que es responsable de una parte central de la erección, se ve afectado por los cambios, lo que resulta en un peor llenado y dureza del pene7.
Muchos de los pacientes informan que la disfunción eréctil que experimentan tiene un impacto negativo en su calidad de vida8. No están listos para abandonar su actividad sexual después de la cirugía y, por lo tanto, una terapia curativa para la disfunción eréctil es atractiva, cuando los otros tratamientos disponibles para la rehabilitación del pene fallan.
En ensayos anteriores, incluidos ensayos en animales y pequeños ensayos de fase 1 en humanos, las células madre han mostrado resultados prometedores como tratamiento alternativo parala disfunción eréctil 2,9,10,11,12. Los resultados muestran que es seguro usar ADRC, y que la función eréctil mejora significativamente después de una sola inyección en los cuerpos cavernosos 2,9,10,11,12. Se cree que las células regenerativas derivadas de tejido adiposo (ADRC) apoyan la regeneración de tejidos por mecanismos paracrinos a través de la liberación de múltiples hormonas, factores de crecimiento neurotróficos y otros, citoquinas y, posiblemente, micro-ARN13. Además, las ADRC son capaces de diferenciarse en varios tipos de células maduras, incluidas las células musculares endoteliales y vasculares, las células del cartílago, los osteocitos y las neuronas14,15. Estas propiedades hacen que las células madre sean interesantes para desarrollar un nuevo tratamiento permanente para la disfunción eréctil.
Las células madre se dividen en varios grupos, básicamente las derivadas del embrión temprano (células madre embrionarias) y las del tejido adulto (células madre adultas). Las células madre adultas incluyen células madre mesenquimales (MSC) que son multipotentes y se pueden encontrar en la médula ósea, el tejido adiposo, la sangre del cordón umbilical, la placenta y la pulpa dental17.
Las células madre del tejido adiposo son fáciles de acceder, a diferencia de las células madre derivadas de la médula ósea. La recolección de células madre de la médula ósea es un procedimiento arriesgado y doloroso en comparación con la liposucción. El número de células posibles de cosechar de la médula ósea será limitado, mientras que solo los depósitos de tejido adiposo del paciente establecen el límite para el número de células que se pueden cosechar. Por lo tanto, es posible aislar una gran cantidad de células madre del tejido adiposo sin necesidad posterior de cultivar las células para obtener una cantidad satisfactoria. Las células regenerativas derivadas de tejido adiposo, también conocidas a menudo como la fracción vascular estromal (SFV), se componen de muchos tipos de células, incluidas las MSC, las células endoteliales, los pericitos, las células inmunes y los progenitoresdel presente 18. Todos estos pueden desempeñar un papel en el proceso regenerativo.
El objetivo del presente estudio es investigar el efecto de las células madre en la disfunción eréctil después de la RP mediante el uso de 4 ml de ADRC autólogos aislados del tejido adiposo recién cosechado después de la inyección en los cuerpos cavernosos.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Liposuction</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Abdominal Binder</td>
			<td>Dale</td>
			<td></td>
			<td>Size depent of the patient</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhessive OP-towel</td>
			<td>M&#246;lnlycke Health Care</td>
			<td>906677</td>
			<td>90x75 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adrenalin 1 mg/ml</td>
			<td>Amgros I/s</td>
			<td>74 44 23</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Basic OP supplies</td>
			<td>M&#246;lnlycke Health Care</td>
			<td>97010873-07</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Carbon Steel blade 11</td>
			<td>Swann-Morton</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Chlorhixidine Ethanol</td>
			<td>Faarborg Pharma</td>
			<td>5% colored</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Disposable set Lipocollector 3</td>
			<td>Human Med</td>
			<td>670200</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Extension hoses</td>
			<td>Extrudan</td>
			<td></td>
			<td>5.8/8.3 mm, Ch 25, 3,5 M long</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gaze Rags</td>
			<td>Barrier</td>
			<td>175201</td>
			<td>30x45 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Jelonet</td>
			<td>Smith and Nephew Medical Ltd</td>
			<td>90509225</td>
			<td>10 x 10 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Marcaine 5 mg/ml + Adrenaline 5 micrigram</td>
			<td>Astra Zeneca</td>
			<td></td>
			<td>20 mL</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mesorb Bandage</td>
			<td>M&#246;lnlycke Health Care</td>
			<td>677001</td>
			<td>10x13 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlance</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>304622</td>
			<td>18 G + 23 G</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Monocryl suture</td>
			<td>Ethicon</td>
			<td></td>
			<td>04:00</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringer-lactat</td>
			<td>Fresinus Kabi</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gloves</td>
			<td>Gammex</td>
			<td>330052065</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Gown</td>
			<td>M&#246;lnlycke Health Care</td>
			<td>690103-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Marker</td>
			<td>Richard-Allan</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Surgical Mask</td>
			<td>3M</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Codan Medical</td>
			<td>6,28,402</td>
			<td>50/60 ml cath tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>700016181</td>
			<td>1 ml</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>WAL- Applikator for cannulae 25/30 cm</td>
			<td>Human Med</td>
			<td>REF 500001</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Isolation of ADRC&#39;s</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>1 ml Syringe</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td>REF 303172</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3 way stopcock</td>
			<td>One Med</td>
			<td>REF 10554-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Adhesive OP-towel</td>
			<td>M&#246;lnlycke Health Care AB</td>
			<td>REF 906677</td>
			<td>90x75 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cytori Celution 800IV device</td>
			<td>Cytori</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desinfection swaps</td>
			<td>Mediq Danmark</td>
			<td>3340010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microlance</td>
			<td>Becton Dickinson</td>
			<td></td>
			<td>25G (0,5*25 mm)</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nitril Gloves</td>
			<td>Abena</td>
			<td></td>
			<td>Powder free</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>OR drape Sheet, 2 layers</td>
			<td>Lohmann &#38; Rauscher</td>
			<td>REF 33005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ringers Lactate</td>
			<td>Fresinus Kabi</td>
			<td>06756 (DK)</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gown</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Supplemental kit for Cytori Celution 800IV devise</td>
			<td>Cytori</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Termometer</td>
			<td>Thomas Scientific</td>
			<td></td>
			<td>traceable</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Injection of ADRC&#39;s</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Aperture drape</td>
			<td>One Med</td>
			<td>REF1565-01</td>
			<td>75*90 cm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Desinfection swap</td>
			<td>Mediq Danmark</td>
			<td>3340010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pean</td>
			<td>Leibinger</td>
			<td>32-01257</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Silicone Vessel Loop</td>
			<td>Purple Surgical</td>
			<td>REF PS3203</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Sterile gloves</td>
			<td>Sempermed</td>
			<td></td>
			<td>Or Use your favorite</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

isolation of adipose derived regenerative cells for the treatment of erectile dysfunction following radical prostatectomy

Las células madre se utilizan en muchas áreas de investigación dentro de la medicina regenerativa, en parte porque estos tratamientos pueden ser curativos en lugar de sintomáticos. Las células madre se pueden obtener de diferentes tejidos y se han descrito varios métodos para el aislamiento. El método presentado para el aislamiento de células regenerativas derivadas de tejido adiposo (ADRC) se puede utilizar en muchas áreas terapéuticas porque el método es un procedimiento general y, por lo tanto, no se limita a la terapia de disfunción eréctil (DE). La disfunción eréctil es un efecto secundario común y grave de la prostatectomía radical (RP), ya que la disfunción eréctil a menudo no se trata bien con la terapia convencional. El uso de ADRC como tratamiento para la disfunción eréctil ha atraído un gran interés debido a los resultados positivos iniciales después de una sola inyección de células en los cuerpos cavernosos. El método utilizado para el aislamiento de ADRC es un proceso simple y automatizado, que es reproducible y garantiza un producto uniforme. Además, la esterilidad del producto aislado está asegurada porque todo el proceso tiene lugar en un sistema cerrado. Es importante minimizar el riesgo de contaminación e infección, ya que las células madre se utilizan para la inyección en humanos. Todo el procedimiento se puede realizar dentro de las 2.5-3.5 horas y no requiere un laboratorio clasificado, lo que elimina la necesidad de enviar tejido a un sitio externo. Sin embargo, el procedimiento tiene algunas limitaciones ya que la cantidad mínima de lipoaspirado drenado para que el dispositivo de aislamiento funcione es de 100 g.

El procedimiento presentado se ha utilizado para un ensayo clínico abierto de Fase 1 que incluye a 21 pacientes19. El criterio de valoración primario del ensayo fue la seguridad del uso de ADRC en humanos y el criterio de valoración secundario fue el efecto de ADRC sobre la función eréctil.
Veintiún hombres fueron incluidos en el ensayo con una edad media de 60 años (rango 46-69) y una erección normal y vida sexual activa antes de la RP debido al cáncer de próstata. Todos sufrieron de disfunción eréctil después de la RP, sin signos de recuperación de los medicamentos disponibles para la rehabilitación del pene. Seis hombres sufrieron de incontinencia como efecto secundario de la RP. Todos los hombres recibieron una sola inyección intracavernosa de ADRC aislado con el método presentado.
Los 21 hombres fueron seguidos con 4 visitas en la clínica ambulatoria a los 1,3,6 y 12 meses después de la inyección. La función sexual se evaluó con cuestionarios validados: el Índice Internacional de Función Eréctil-5 (IIEF-5) y el Puntaje de Dureza de la Erección (EHS) (Se adjunta como apéndices).
No ocurrieron eventos graves durante el tiempo de observación. Ocho hombres informaron enrojecimiento transitorio e hinchazón en los sitios de inyección, tres informaron reacción en el área del pene. Se informaron ocho eventos menores reversibles experimentados relacionados con la liposucción, como molestias abdominales leves y hematomas abdominales menores. Ningún paciente reportó molestias en el seguimiento de 1 mes. Ocho de cada quince (53%) en el grupo del continente informaron que la función eréctil era suficiente para el coito a los 12 meses. El grupo de 6 hombres incontinentes no mostró ninguna mejoría de la función eréctil.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td></td>
			<td>Continente</td>
			<td>Incontinente</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pacientes incluidos</td>
			<td>15</td>
			<td>6</td>
		</tr>
<tr>
<td>Efecto significativo</td>
			<td>8</td>
			<td>0</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabla 1: La tabla muestra las diferencias en el efecto significativo del tratamiento entre pacientes continentes e incontinentes.

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Isolation of Adipose Derived Regenerative Cells for the Treatment of Erectile Dysfunction Following Radical Prostatectomy

La divulgación precisa de métodos y protocolos es crucial para la adopción a gran escala de terapias con células madre. Aquí, presentamos un protocolo para aislar células regenerativas derivadas de tejido adiposo, utilizado para una sola inyección intracavernosa como tratamiento de la disfunción eréctil (DE) después de la prostatectomía radical (RP).

Aislamiento de células regenerativas derivadas de tejido adiposo para el tratamiento de la disfunción eréctil después de la prostatectomía radical

Stem cells are used in many research areas within regenerative medicine in part because these treatments can be curative rather than symptomatic. Stem ...

Esta técnica de aislamiento se puede utilizar para explorar si las células madre adiposas pueden ayudar a los pacientes a regenerar la función eréctil después de la prostatectomía radical. Este método no está limitado para una enfermedad específica. Podría usarse en todas las áreas de investigación con células madre adiposas.Las células madre aisladas se utilizan para tratar la disfunción eréctil, pero la técnica de aislamiento es un procedimiento general y las células madre pueden ser útiles en otras áreas dentro de la investigación con células madre. Comience desinfectando la piel del abdomen y el escroto con clorhexidina al 0,5%. Utilice un marcador quirúrgico para dibujar las áreas del abdomen donde se va a realizar la liposucción, generalmente el área entre la síntesis y el ombligo.Haga dos incisiones de seis milímetros de ancho en la piel del abdomen con un bisturí número 11. Coloque las incisiones simétrica y lateralmente desde el área dibujada hacia arriba de la liposucción. Coloque un poco de lubricante en las incisiones para asegurarse de que la cánula de infiltración se deslice dentro y fuera de las incisiones fácilmente durante la liposucción.Luego introduzca una cánula de infiltración de calibre 14 a través de las incisiones en la piel. Inyecte la solución de Klein modificada por vía subcutánea en las áreas marcadas paralelas a la superficie de la piel hasta que el tejido objetivo se hinche y firme o tumescente. Inyecte un volumen de solución de Klein modificada en una proporción de uno a uno en el tejido adiposo.Espere 10 minutos para maximizar los efectos de la adrenalina y reducir la cantidad de sangre en el tejido adiposo recolectado. Realice una liposucción de infusión de chorro estándar para cosechar de 200 a 300 milímetros de tejido adiposo. Use cánulas romas que sean huecas con un tubo de infusión y una boquilla integrados.Conecte la cánula a un dispositivo de succión para la liposucción. Introducir una jeringa de tres milímetros con una punta roma a través de las incisiones en el abdomen y recoger el tejido adiposo en el Lipo Collector para preservar el lipoaspirado en un ambiente estéril. El lipoaspirado comenzará a separarse de la fase acuática.Use jeringas estériles de 50 mililitros para succionar el lipoaspirado del LipoCollector, minimizando el volumen de agua aspirada en las jeringas. Atornille un tapón en la punta de las jeringas para mantener el tejido adiposo estéril. Coloque las jeringas con la punta hacia abajo en una bolsa de plástico estéril para comenzar la separación del lipoaspirado de la fase de agua.Luego coloque la bolsa en un recipiente estéril. Cubra el recipiente con una cortina estéril para asegurar el ambiente estéril durante el transporte. Cierre las incisiones de la piel con el material de sutura preferido por el cirujano.Coloque una prenda de compresión alrededor del abdomen para reducir el edema postoperatorio. Para hacer un bloqueo del pene, inyecte la bupivacaína en dos sitios, uno colocado ventralmente y el otro dorsalmente. Introduzca toda la aguja en el tejido subcutáneo, apuntándola lateralmente hacia la derecha, e inyecte la anestesia a medida que la aguja se retrae.Repita la inyección, apuntando la aguja hacia la izquierda. Coloque todos los consumibles y enzimas asépticamente sobre la mesa cubierta por una toalla quirúrgica desechable estéril. Limpie el dispositivo con etanol y cargue el conjunto de consumibles.Luego conecte una bolsa de timbres lactados al sistema. Realizar la serie de pruebas semiautomáticas antes de añadir el lipoaspirado. Mientras se prepara el dispositivo, deje que el lipoaspirado se coloque en un tubo de 50 mililitros para permitir que la grasa se separe de la fase líquida.Tenga en cuenta la cantidad total de tejido graso y úselo para asegurarse de que la cantidad total de grasa cargada estará en el rango de la capacidad del dispositivo. Cargue el tejido cuando el dispositivo se lo solicite. La máquina drenará el exceso de líquido.Pesa la cantidad de tejido graso y lávala con anillos lactados. Cuando el pañuelo haya sido lavado y drenado, conecte una nueva bolsa de infusión con anillos lactados de 37 a 39 grados Celsius. Reconstituir la enzima disponible comercialmente que contiene la mezcla de colagenasa y proteasa en anillos lactados de cinco mililitros.Asegúrese de que el dispositivo muestre la cantidad de enzima para inyectar en el recipiente con el tejido graso. Una vez inyectada la digestión enzimática durará alrededor de 20 minutos. Después de la digestión de los tejidos, verifique que el contenido esté separado en un lípido superior que contenga la fase amarilla y una capa rosa inferior que contenga las células regenerativas derivadas de tejido adiposo, o ADRC.Deje que la capa rosa drene en la cámara de procesamiento celular del conjunto de consumibles, dejando atrás la capa lipídica. Permita que los ADRC se concentren en la cámara de procesamiento celular durante múltiples rondas de centrifugación. Luego agregue 10 mililitros de intrabase reconstituidos en los timbres lactados.La reacción enzimática dura 10 minutos y los ADRC se lavan después. Cuando se haya completado el aislamiento de los ADRC, vuelva a suspender las células en cinco mililitros de lactato de Ringer y aspire la solución en una jeringa de cinco mililitros. Monte una llave de paso Luer hembra de tres vías en la jeringa y aspire cuatro mililitros de ADRC en otra jeringa estéril de cinco mililitros.Transfiera el último mililitro de ADRC a una jeringa de un mililitro. Utilice esta alícuota para los análisis de caracterización de ADRC, como el recuento de células, la viabilidad celular, el análisis de marcadores de superficie por citometría de flujo y la capacidad de diferenciación de ADRC. Coloque una aguja de calibre 25 en la jeringa de cinco mililitros que contiene los cuatro mililitros de ADRC.Luego envuélvalo en una cortina estéril. Esta solución de ADRC se inyectará en el receptor y debe contener en promedio de 8,4 a 32,7 millones de células. Asegúrese de que la solución de los ADRC permanezca homogénea inclinando la jeringa suavemente hasta que se inyecte en el cuerpo cavernoso.Coloque una cortina de apertura sobre el pene. Y un torniquete en la raíz del pene con un lazo de vaso de silicona. Apriete el lazo y asegúrelo con fórceps, haciendo que el torniquete sea lo suficientemente apretado como para detener el flujo sanguíneo del pene.Use dos hisopos antisépticos para desinfectar la piel del pene en el lugar de la inyección. Luego inyecte un mililitro de la solución ADRC en un ángulo directo en el cuerpo cavernoso, en el lado derecho en dos lugares diferentes. Repita este paso en los cuerpos cavernosos izquierdos, inyectando un volumen total de cuatro mililitros.Este método se probó en un ensayo clínico abierto de fase uno en 21 hombres con una edad media de 60 años y una erección normal y una vida sexual activa antes de una prostatectomía radical. Seis de los hombres también sufrían de incontinencia. Todos los hombres recibieron una sola inyección inter cavernosa de ADRC aislados y fueron seguidos con cuatro visitas en la clínica ambulatoria a los 1, 3, 6 y 12 meses después de la inyección.No ocurrieron eventos graves durante el tiempo de observación. Ocho hombres informaron enrojecimiento transitorio e hinchazón en los sitios de inyección, y tres informaron reacción en el área del pene. Ocho hombres experimentaron eventos menores reversibles relacionados con la liposucción, como molestias abdominales leves y hematomas abdominales menores.Ningún paciente reportó molestias en el seguimiento de un mes. Su función sexual fue evaluada con el Índice Internacional de la Función Eréctil Cinco y el Puntaje de Dureza de la Erección. Ocho de cada 15 hombres en el grupo del continente informaron que su función eréctil era suficiente para el coito a los 12 meses.El grupo de seis hombres incontinentes no mostró ninguna mejoría de la función eréctil Al intentar este protocolo, tenga en cuenta que las enzimas que se utilizan durante el procedimiento de aislamiento deben sacarse del congelador o refrigerador dos horas antes de que se inicie el procedimiento. Los resultados de esta técnica han allanado el camino para un ECA donde los efectos de las células madre adiposas se exploran a mayor escala.

Research

JoVE Journal

Medicine

Repair of a Critical-sized Calvarial Defect Model Using Adipose-derived Stromal Cells Harvested from Lipoaspirate

La reparación de un modelo de defecto crítico del tamaño de calota Uso adiposo derivados de las células del estroma cosechadas desde lipoaspirado

Craniofacial skeletal repair and regeneration offers the promise of de novo tissue formation through a cell-based approach utilizing stem cells. ...

Investigación

Medicina

Isolation, Characterization and Comparative Differentiation of Human Dental Pulp Stem Cells Derived from Permanent Teeth by Using Two Different Methods

Diferenciación de aislamiento, caracterización y comparativo de las células madre derivadas de la Pulpa Dental de los dientes permanentes mediante dos métodos diferentes

Developing wisdom teeth are easy-accessible source of stem cells during the adulthood which could be obtained by routine orthodontic treatments. Human ...

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Patient Derived Cell Culture and Isolation of CD133+ Putative Cancer Stem Cells from Melanoma

Paciente celulares derivadas Cultura y aislamiento de CD133<sup&gt; +</sup&gt; Putativos células madre del cáncer de melanoma

Despite improved treatments options for melanoma available today, patients with advanced malignant melanoma still have a poor prognosis for ...

Quantitative Multispectral Analysis Following Fluorescent Tissue Transplant for Visualization of Cell Origins, Types, and Interactions

Análisis Cuantitativo multiespectrales después de un trasplante de tejido fluorescente para la visualización de los Orígenes celulares, tipos y Interacciones

With the desire to understand the contributions of multiple cellular elements to the development of a complex tissue; such as the numerous cell types that ...

Isolation, Cryopreservation and Culture of Human Amnion Epithelial Cells for Clinical Applications

El aislamiento, la criopreservación y cultivo de células epiteliales Amnion Humanos para Aplicaciones clínicas

Human amnion epithelial cells (hAECs) derived from term or pre-term amnion membranes have attracted attention from researchers and clinicians as a ...

Studying Pancreatic Cancer Stem Cell Characteristics for Developing New Treatment Strategies

El estudio de cáncer de páncreas Tallo Características de las células para el desarrollo de nuevas estrategias de tratamiento

Pancreatic ductal adenocarcinoma (PDAC) contains a subset of exclusively tumorigenic cancer stem cells (CSCs) which have been shown to drive tumor ...

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell (ASC) Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Creation and Transplantation of an Adipose-derived Stem Cell ASC Sheet in a Diabetic Wound-healing Model

Creación y el transplante de una hoja de células madre derivadas de adiposo (ASC) en un modelo de curación de herida diabética

Artificial skin has achieved considerable therapeutic results in clinical practice. However, artificial skin treatments for wounds in diabetic patients ...

Network Analysis of Foramen Ovale Electrode Recordings in Drug-resistant Temporal Lobe Epilepsy Patients

Análisis de la red de foramen oval de electrodos Grabaciones en epilepsia del lóbulo temporal pacientes resistentes a los medicamentos

Approximately 30% of epilepsy patients are refractory to antiepileptic drugs. In these cases, surgery is the only alternative to eliminate/control ...

Intense Pulsed Light for the Treatment of Dry Eye Owing to Meibomian Gland Dysfunction

Intensa luz pulsada para el tratamiento del ojo seco debido a la disfunción de la glándula de Meibomio

Dry eye disease (DED) is an increasingly common condition and one of the most common complaints of patients. The vast majority of DED is caused by the ...

Mechanical Micronization of Lipoaspirates for Regenerative Therapy

Micronización mecánica de Lipoaspirates para la terapia regenerativa

Stromal vascular fraction (SVF) has become a regenerative tool for various diseases; however, legislation strictly regulates the clinical application of ...