Name: enhanced yeast one-hybrid screens to identify transcription factor binding to human dna sequences
Uploaded: 2019-02-11T15:00:00
Description: Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences at JoVE.com

وأيد هذا العمل "المعاهد الوطنية للصحة" [R35-GM128625 على J.I.F.B.].

1-الأعمال التحضيرية
<ol><li>
اتفاقية استكهولم −U −H لوحات (أطباق بيتري 150 مم) ملاحظة: سيتم استخدام هذه اللوحات لزراعة سلالات الخميرة الطعم الحامض النووي.<ol>
<li>حل ميكس التسرب، الخميرة قاعدة النيتروجين (YNB)، هيميسولفاتي الأدنين، وسلفات الأمونيوم في 920 مل من الماء، ودرجة الحمو...

<ol>
	<li>Vaquerizas, J. M., Kummerfeld, S. K., Teichmann, S. A., Luscombe, N. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+census+of+human+transcription+factors:+function,+expression+and+evolution.">A census of human transcription factors: function, expression and evolution.</a> Nature Reviews Genetics. 10 (4), 252-263 (2009).</li><li>Lambert, S. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Human+Transcription+Factors.">The Human Transcription Factors.</a> Cell. 172 (4), 650-665 (2018).</li><li>Arda, H. E., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-centered+regulatory+networks.">Gene-centered regulatory networks.</a> Briefings in Functional Genomics. 9 (1), 4-12 (2010).</li><li>Jolma, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DNA-binding+specificities+of+human+transcription+factors.">DNA-binding specificities of human transcription factors.</a> Cell. 152 (1-2), 327-339 (2013).</li><li>Bulyk, M. L., Gentalen, E., Lockhart, D. J., Church, G. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantifying+DNA-protein+interactions+by+double-stranded+DNA+arrays.">Quantifying DNA-protein interactions by double-stranded DNA arrays.</a> Nature Biotechnology. 17 (6), 573-577 (1999).</li><li>Robertson, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-wide+profiles+of+STAT1+DNA+association+using+chromatin+immunoprecipitation+and+massively+parallel+sequencing.">Genome-wide profiles of STAT1 DNA association using chromatin immunoprecipitation and massively parallel sequencing.</a> Nature Methods. 4 (8), 651-657 (2007).</li><li>Li, J. J., Herskowitz, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+of+ORC6,+a+component+of+the+yeast+origin+recognition+complex+by+a+one-hybrid+system.">Isolation of ORC6, a component of the yeast origin recognition complex by a one-hybrid system.</a> Science. 262 (5141), 1870-1874 (1993).</li><li>Sewell, J. A., Fuxman Bass, J. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Options+and+Considerations+When+Using+a+Yeast+One-Hybrid+System.">Options and Considerations When Using a Yeast One-Hybrid System.</a> Methods in Molecular Biology. 1794, 119-130 (2018).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene-Centered+Yeast+One-Hybrid+Assays.">Gene-Centered Yeast One-Hybrid Assays.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Enhanced+yeast+one-hybrid+assays+for+high-throughput+gene-centered+regulatory+network+mapping.">Enhanced yeast one-hybrid assays for high-throughput gene-centered regulatory network mapping.</a> Nature Methods. 8 (12), 1059-1064 (2011).</li><li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene-centered+C.+elegans+protein-DNA+interaction+network+provides+a+framework+for+functional+predictions.">A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network provides a framework for functional predictions.</a> Molecular Systems Biology. 12 (10), 884 (2016).</li><li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+gene-centered+transcription+factor+networks+for+enhancers+and+disease+variants.">Human gene-centered transcription factor networks for enhancers and disease variants.</a> Cell. 161 (3), 661-673 (2015).</li><li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Yeast+one-hybrid+assays+for+gene-centered+human+gene+regulatory+network+mapping.">Yeast one-hybrid assays for gene-centered human gene regulatory network mapping.</a> Nature Methods. 8 (12), 1050-1052 (2011).</li><li>Sahni, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Widespread+macromolecular+interaction+perturbations+in+human+genetic+disorders.">Widespread macromolecular interaction perturbations in human genetic disorders.</a> Cell. 161 (3), 647-660 (2015).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Generating+Bait+Strains+for+Yeast+One-Hybrid+Assays.">Generating Bait Strains for Yeast One-Hybrid Assays.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Colony+Lift+Colorimetric+Assay+for+beta-Galactosidase+Activity.">Colony Lift Colorimetric Assay for beta-Galactosidase Activity.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Fuxman Bass, J. I., Reece-Hoyes, J. S., Walhout, A. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Zymolyase-Treatment+and+Polymerase+Chain+Reaction+Amplification+from+Genomic+and+Plasmid+Templates+from+Yeast.">Zymolyase-Treatment and Polymerase Chain Reaction Amplification from Genomic and Plasmid Templates from Yeast.</a> Cold Spring Harbor Protocols. (12), (2016).</li><li>Deplancke, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+gene-centered+C.+elegans+protein-DNA+interaction+network.">A gene-centered C. elegans protein-DNA interaction network.</a> Cell. 125 (6), 1193-1205 (2006).</li><li>Reece-Hoyes, J. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Extensive+rewiring+and+complex+evolutionary+dynamics+in+a+C.+elegans+multiparameter+transcription+factor+network.">Extensive rewiring and complex evolutionary dynamics in a C. elegans multiparameter transcription factor network.</a> Molecular Cell. 51 (1), 116-127 (2013).</li><li>Carrasco Pro, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Global+landscape+of+mouse+and+human+cytokine+transcriptional+regulation.">Global landscape of mouse and human cytokine transcriptional regulation.</a> Nucleic Acids Research. 46 (18), 9321-9337 (2018).</li><li>Whitfield, T. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Functional+analysis+of+transcription+factor+binding+sites+in+human+promoters.">Functional analysis of transcription factor binding sites in human promoters.</a> Genome Biology. 13 (9), R50 (2012).</li><li>Fuxman Bass, J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcription+factor+binding+to+Caenorhabditis+elegans+first+introns+reveals+lack+of+redundancy+with+gene+promoters.">Transcription factor binding to Caenorhabditis elegans first introns reveals lack of redundancy with gene promoters.</a> Nucleic Acids Research. 42 (1), 153-162 (2014).</li><li>Hens, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+protein-DNA+interaction+screening+of+Drosophila+regulatory+elements.">Automated protein-DNA interaction screening of Drosophila regulatory elements.</a> Nature Methods. 8 (12), 1065-1070 (2011).</li><li>Gubelmann, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+yeast+one-hybrid+and+microfluidics-based+pipeline+to+map+mammalian+gene+regulatory+networks.">A yeast one-hybrid and microfluidics-based pipeline to map mammalian gene regulatory networks.</a> Molecular Systems Biology. 9, 682 (2013).</li><li>Brady, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+stele-enriched+gene+regulatory+network+in+the+Arabidopsis+root.">A stele-enriched gene regulatory network in the Arabidopsis root.</a> Molecular Systems Biology. 7, 459 (2011).</li><li>Pruneda-Paz, J. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-scale+resource+for+the+functional+characterization+of+Arabidopsis+transcription+factors.">A genome-scale resource for the functional characterization of Arabidopsis transcription factors.</a> Cell Reports. 8 (2), 622-632 (2014).</li><li>Burdo, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Maize+TFome--development+of+a+transcription+factor+open+reading+frame+collection+for+functional+genomics.">The Maize TFome--development of a transcription factor open reading frame collection for functional genomics.</a> The Plant Journal. 80 (2), 356-366 (2014).</li></ol>

EY1H الروبوتية التزاوج فحص النهج الموصوفة هنا إلى حد كبير يزيد من سرعة النقل لتحديد المجموعة TFs التي تربط منطقة الحمض النووي من اهتمام، مقارنة بفحص المكتبة السابقة أو الفرز صفت النهج القائمة على التحول. علاوة على ذلك، التفاعلات الحمض النووي TF الكشف عنها بواسطة eY1H فحوصات يتم استنساخه بدرجة ع...

مشكلة مركزية في مجال الطب الحيوي هو تحديد الآليات التي تنظم كل الجينات البشرية. النسخ هو الخطوة الأولى في السيطرة على مستويات التعبير الجيني، وأنه يخضع لمجموعات من عوامل النسخ (TFs) التي تكون فريدة لكل الجينات. ونظرا لأن البشر ترميز > 1,500 TFs1،2، تحديد مجموعة كاملة من TFs التي تتحكم في التعبير عن كل الجينات لا يزال يشكل تحديا مفتوحاً.
يمكن استخدام نوعين من أساليب لخريطة التفاعلات الحمض النووي TF: أساليب محورها TF وتتمحور حول الحمض النووي3 (الشكل 1A). في أساليب محورها TF، يتم سبر TF الاهتمام لربط المجينية الحمض النووي المناطق أو تحديد خصوصيته ربط الحمض النووي. وتشمل هذه الأساليب الكروماتين إيمونوبريسيبيتيشن (رقاقة) متبوعاً بالتسلسل الفائق والبروتين ملزمة [ميكروارس] سيليكس4،،من56. في أساليب تتمحور حول الحمض النووي، هو سبر تسلسل الحمض النووي من الفائدة لتحديد مجموعة TFs ربط تسلسل الحمض النووي. على أوسع نطاق تطبيق هذه الأساليب هو الخميرة مختلطة واحدة فحوصات (Y1H)، في التفاعلات التي بين TFs والحمض النووي يتم اختبار المناطق في وسط نواة الخميرة استخدام مراسل الجينات7،،من89.
فحوصات Y1H تنطوي على عنصرين هما: 'الحمض النووي-طعم' (مثلاً المروجين، والقدرة على، وكواتم الصوت، إلخ) و 'TF-فريسة،' التي يمكن فحصها لمراسل الجينات التنشيط9،10 (الشكل 1B). هو استنساخ الحمض النووي-الطعم المنبع مراسل اثنين تتكامل الجينات (لاكز و HIS3) وكل بنيات bait::reporter الحمض النووي في جينوم الخميرة لتوليد تشروماتينيزيد 'سلالات الطعم الحامض النووي'. يتم إدخال TF الفريسة، ترميز في بلازميد يعبر عن TF تنصهر إلى مجال التنشيط (AD) من الخميرة TF Gal4، في سلالة الحمض النووي-الطعم لصيد السمك للتفاعلات TF-الحمض النووي. إذا كان يربط TF-الفريسة لتسلسل الحمض النووي-الطعم، ثم الإعلان الحالي في TF-الفريسة سيؤدي إلى تفعيل كلا الجينات مراسل. نتيجة لذلك يمكن المحددة للنمو في اللوحات التي تفتقر إلى الحامض الأميني، فضلا عن التغلب على مثبط تنافسي، 3-أمينو-1,2,4-تريازولي (3-ات)، الخلايا مع تفاعل إيجابي وتصور كمستعمرات الأزرق حضور X-غال. لأن الخميرة قوية Gal4 يستخدم الإعلانية، وفحوصات Y1H يمكن الكشف عن التفاعلات التي تنطوي على تفعيل النسخي، فضلا عن ريبريسورس. وبالإضافة إلى ذلك، نظراً لأن يتم التعبير عن TF يفترس من مروج خميرة قوية (ADH1)، ويمكن الكشف عن التفاعلات حتى بالنسبة TFs التي لديها مستويات منخفضة من التعبير الذاتية، التي تشكل تحديا للكشف عن طريق رقاقة11،12.
وتستند معظم البروتوكولات المنشورة لإجراء فحوصات Y1H إدخال سلالات الحمض النووي-الطعم الخميرة يفترس TF بتحويل مكتبات فريسة TF المجمعة متبوعاً بالتحديد ومستعمرة الانتقاء والتسلسل لتحديد TF متفاعلة فيما بينها، أو تحويل كل استنساخ8،9. هذه هي بروتوكولات تستغرق وقتاً طويلاً، مما يحد من العدد تسلسل الحمض النووي التي يمكن أن يكون اختبار كل باحث. عزز تحسن الذي حدث مؤخرا لفحوصات Y1H، تسمى Y1H (eY1H)، زاد زيادة كبيرة الإنتاجية الفحص باستخدام منصة روبوتية صفيف (HDA) كثافة عالية لرفيقه سلالات الخميرة الطعم الحامض النووي مع مجموعة من سلالات الخميرة كل التعبير عن مختلف TF-فريسة10،13 (الشكل 1). تستخدم هذه الشاشات تنسيق مستعمرة 1,536 السماح لاختبار TFs معظم البشرية في البيلوروسية استخدام لوحات ثلاثة فقط. علاوة على ذلك، ونظرا لأن اختبار الحمض النووي TF التفاعلات بطريقة عشوائية ويسمح هذا النهج بمقارنة التفاعلات بين الحمض النووي-الطعوم (مثل الخيارين فضله النوكليوتيدات واحدة) وبين TFs مختلفة أو TF متغيرات11،12 ،14.
استخدام فحوصات eY1H، نحن قد تتحدد بالإنسان أكبر و ايليجانس كاينورهابديتيس TF تتمحور حول الحمض النووي-DNA التفاعلات الشبكات إلى تاريخ. على وجه الخصوص، قمنا بتحديد 2,230 التفاعلات بين القدرة على التنمية البشرية 246 و 283 TFs12. علاوة على ذلك، لقد استخدمنا eY1H فحوصات للكشف عن تغيير الربط TF إلى 109 النوكليوتيدات واحدة فضله المتغيرات المرتبطة بالأمراض الوراثية مثل تشوه التنموية، والسرطان، والاضطرابات العصبية. في الآونة الأخيرة، كنا eY1H تحدد شبكة تتألف من 21,714 التفاعلات بين مروجي الجينات C. ايليجانس 2,576 و 366 TFs11. وكان هذه الشبكة مفيدة للكشف عن الدور الوظيفي لعشرات من TFs C. ايليجانس .
البروتوكولات لتوليد بقع الحمض النووي-الطعم وتقييم مستويات النشاط مراسل الخلفية قد ذكرت في مكان آخر من15،،من1617. وهنا يصف لنا خط أنابيب eY1H التي يمكن استخدامها لفحص أي منطقة الحمض النووي الجينوم البشري ضد مجموعة من 1,086 TFs البشرية. حالما يتم إنشاؤها من خميرة سلالة الحمض النووي-الطعم ورصدت مجموعة TF-فريسة على لوحات المقابلة، يمكن تنفيذ البروتوكول بأكمله في الأسبوعين الماضيين (الجدول 1). الأهم من ذلك، يمكن أن باراليليزيد البروتوكول حيث أن باحث واحد يمكن أن الشاشة 60 تسلسل الحمض النووي-الطعم في وقت واحد. وللتدليل على البروتوكول، ونحن فحص المروجين لاثنين من الجينات سيتوكين CCL15 و IL17F. وباﻹضافة إلى ذلك، نعرض النتائج من شاشات الفاشلة لتوضيح أنواع المشاكل التي قد تنشأ عند إجراء فحوصات eY1H وكيفية استكشاف لهم.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:1195px;" width="1195">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">3-Amino-1,2,4-triazole (3AT) ~95 % TLC</td>
			<td style="width:223px;">Sigma</td>
			<td style="width:103px;">A8056-100G</td>
			<td style="width:315px;">Competitive inhibitor for products of HIS3 gene</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Adenine sulfate (hemisulfate), dihydrate</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>A0865</td>
			<td>Required for proper yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Agar High Gel Strength - Bacteriological grade</td>
			<td>American International Chemical</td>
			<td>AGHGUP</td>
			<td>Nutritive media for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Ammonium Sulfate</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>A1450</td>
			<td>Nitrogen source in synthetic yeast media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">D+ Glucose Anhydrous</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>G3050</td>
			<td>Required for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Drop-Out Mix minus His, Leu, Tryp and Uracil, adenine rich w/o yeast nitrogen base</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>D9540-02</td>
			<td>Synthetic complete media required for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">edge Multiparameter pH Meter</td>
			<td style="width:223px;">Hanna Instruments</td>
			<td>HI2020-01</td>
			<td>To measure pH of selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Flat Toothpicks 750ct</td>
			<td style="width:223px;">Diamond</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>To streak yeasts on petridishes</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">Glass Beads</td>
			<td style="width:223px;">Walter Stern</td>
			<td style="width:103px;">100C</td>
			<td>To spreak yeast when making lawns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glycerol &#8805;99%</td>
			<td>Millipore Sigma</td>
			<td>G9012-1L</td>
			<td>Required to make frozen yeast stocks</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Histidine</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>H5100</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Leucine</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>L2020-05</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">L-Tryptophan</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T-0254</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">N,N-Dimethylformamide</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>319937-1L</td>
			<td>To make X-gal solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Omnipense Elite</td>
			<td style="width:223px;">Wheaton</td>
			<td>W375030-A</td>
			<td>For dispensing accurate volumes of media into Singer plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Peptone, Bacteriological</td>
			<td>American International Chemical</td>
			<td>PEBAUP</td>
			<td>Protein source required for yeast growth</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Petri Dish, 150x15 mm</td>
			<td>VWR</td>
			<td>10753-950</td>
			<td>For growing yeast baits for screening</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">PlusPlates</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">PLU-003</td>
			<td>To make rectangular agar plates to use with Singer Robot</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">Precision Low Temperature BOD Refrigerated Incubator</td>
			<td style="width:223px;">ThermoFisher Scientific</td>
			<td>PR205745R</td>
			<td>To incubate yeast plates at constant temperature</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 1,536 short</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-005</td>
			<td>To transfer the TF-prey array, mate yeast, and transfer yeast to diploid selection and readout plates</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 384 short</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-004</td>
			<td>To transfer TF-prey array from 384 to 1,536 colony format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 96 long</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-001</td>
			<td>To transfer TF-prey array from glycerol stock to agar plate</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">RePads 96 short</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;">REP-002</td>
			<td>To transfer TF-prey array from 96 to 384 colony format</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:555px;">Singer HDA RoToR robot</td>
			<td style="width:223px;">Singer Instruments</td>
			<td style="width:103px;"></td>
			<td>For transfering yeast in high-throughput manner</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Hydroxide (Pellets/Certified ACS)</td>
			<td>Fisher</td>
			<td>S318-1</td>
			<td>For adjusting pH of selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate dibasic heptahydrate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-203402C</td>
			<td>Required for LacZ reporter activity on X-gal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sodium Phosphate monobasic monohydrate</td>
			<td>Santa Cruz Biotechnology</td>
			<td>sc-202342B</td>
			<td>Required for LacZ reporter activity on X-gal&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Uracil</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>U0750-100G</td>
			<td>For yeast growth selection in selective media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">X-gal (5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl-beta-Dgalactopyranoside)</td>
			<td>Gold Biotechnology</td>
			<td>X4281C100</td>
			<td>&#946;-galactosidase turns colorless X-gal blue to detect protein-DNA interaction</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Extract</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>Y2010</td>
			<td>Nutritious medium for growth and propagation of yeast</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Yeast Nitrogen Base (powder) w/o AA, carbohydrate and w/o AS&#160;</td>
			<td>US Biologicals</td>
			<td>Y2030</td>
			<td>Required for vigorous yeast growth</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

enhanced yeast one-hybrid screens to identify transcription factor binding to human dna sequences

تحديد مجموعات عوامل النسخ (TFs) التي تنظم كل الجينات البشرية هو مهمة شاقة تتطلب إدماج العديد من النهج التجريبي والحسابية. أحد هذه الأساليب هو الإنزيم (Y1H) واحد-الهجين الخميرة، في التفاعلات التي بين TFs والحمض النووي يتم اختبار المناطق في وسط نواة الخميرة استخدام الجينات مراسل. فحوصات Y1H تنطوي على عنصرين هما: 'الحمض النووي-طعم' (.على سبيل المثال، والمروجين، والقدرة على، وكواتم الصوت، إلخ) و 'TF-فريسة،' التي يمكن فحصها لتنشيط الجينات مراسل. وتستند معظم البروتوكولات المنشورة لأداء شاشات Y1H تحويل مكتبات TF-فريسة أو صفائف إلى سلالات الخميرة الطعم الحامض النووي. هنا، يمكننا وصف خط أنابيب، ودعا Y1H المحسن (eY1H) فحوصات، حيث استجوبه التفاعلات الحمض النووي TF تزاوج سلالات الطعم الحامض النووي مع مجموعة أراييد من سلالات فريسة TF استخدام صفيف عالية كثافة منصة الروبوتية (HDA) أن يسمح للفحص في 1,536 تنسيق مستعمرة. وهذا يسمح بزيادة كبيرة في الإنتاجية (60 تسلسل الحمض النووي-الطعم ضد > 1,000 TFs تستغرق أسبوعين كل باحث) وإمكانية تكرار نتائج. نحن توضيح أنواع مختلفة من النتائج المتوقعة عن طريق اختبار تسلسل المروج البشرية ضد صفيف TFs البشرية 1,086، فضلا عن أمثلة للمسائل التي يمكن أن تنشأ من خلال الشاشات وكيفية استكشاف أخطاء وإصلاحها لهم.

ينبغي النظر في العوامل الرئيسية الثلاثة عند تحليل النتائج من فحوصات eY1H: النشاط مراسل الخلفية من سلالة الطعم الحامض النووي، وقوام النشاط مراسل المقابلة للتفاعلات TF-الحمض النووي، وعدد المستعمرات الإيجابية. النشاط مراسل الخلفية (أي، أوتواكتيفيتي) من سلالة الطعم الحامض النووي تشير إلى النم?...

Watch this Scientific Journal Video about Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences at JoVE.com

Enhanced Yeast One-hybrid Screens To Identify Transcription Factor Binding To Human DNA Sequences

نقدم هنا، تعزيز خميرة مختلطة واحدة فحص بروتوكول لتحديد عوامل النسخ (TFs) التي يمكن أن تربط إلى منطقة الحامض النووي البشري من الفائدة. هذا الأسلوب يستخدم خط أنابيب فرز الفائق الذي يمكن استجواب الربط > TFs 1,000 في تجربة واحدة.

شاشات الهجين واحد الخميرة المحسنة لتحديد عامل النسخ ملزمة لتسلسل الحمض النووي البشري

Identifying the sets of transcription factors (TFs) that regulate each human gene is a daunting task that requires integrating numerous experimental and ...

الهدف من تعزيز الخميرة واحد الهجين المقايسات هو تحديد مجموعة من عوامل النسخ التي ترتبط تسلسل الحمض النووي من الفائدة. وميزة هذه التقنية هي أن الخميرة المعززة واحدة الهجين المقايسات يمكن تقييم أكثر من 1000 عامل نسخ في تجربة واحدة. وعلى العكس من ذلك، يقيم التدهور المناعي للكروماتين عامل نسخ واحد فقط في كل مرة.وتشكل هذه الطريقة أداة رئيسية للجينومات الوظيفية لتحديد ذخيرة عوامل النسخ التي ترتبط بمروجي الجينات والمعززين، ولتحديد عامل النسخ المتغير الملزم بالمتغيرات غير الترميزية. إثبات الإجراء سيكون الدكتور شينغ ليو ما بعد الدكتوراه من مختبري. ذوبان لوحات الأسهم غليسرول الخميرة مع مجموعة فريسة TF على الجليد.Resuspend الخميرة باستخدام ماصة قناة 12 والمضي قدما إلى الخطوة التالية في غضون 1 إلى 3 دقائق. لبقعة الخميرة في Sc ناقص التربتوفان لوحات مستطيلة، استخدم روبوت صفيف عالي الكثافة لتحديد لوحات متعددة الويل 96 كمصدر، 96 لوحات أجار كهدف، و 96 منصات دبوس طويلة. لا يمكن إعادة استخدام منصات الدبابيس ويجب تجاهلها.حدد برنامج Spot Many لعمل نسختين لكل لوحة 96 بئر. لا تستخدم خيارات إعادة التدوير أو إعادة النظر لتجنب التلوث الخلفي للمخزونات المجمدة. أيضا، حدد الخيار إلى دوامة صعودا وهبوطا في المصدر لخلط الخميرة.اتبع التعليمات عن مكان ومتى لوضع لوحات والسماح للروبوت على الفور الخميرة في Sc ناقص التربتوفان لوحات مستطيلة. حقيبة الصفيف رصدت واحتضان ذلك الجانب أجار حتى في 30 درجة مئوية لمدة 2 إلى 3 أيام. لتوليد 384 صفائف مستعمرة في Sc ناقص التربتوفان لوحات مستطيلة، حدد 96 لوحات أجار كمصدر، 384 لوحة أجار كهدف، و 96 منصات دبوس قصيرة.ثم حدد 1:4 برنامج مصدر واحد الصفيف. وبهذه الطريقة، سيتم دمج أربع لوحات مستعمرة 96 في لوحة مستعمرة واحدة 384. لا تستخدم خيارات إعادة التدوير أو إعادة النظر لتجنب التلوث بين الألواح المختلفة.حقيبة لوحات واحتضان 384 مستعمرة مجموعة agar الجانب حتى في 30 درجة مئوية لمدة 2 أيام. لتوليد 1536 صفائف مستعمرة في Sc ناقص التربتوفان لوحات مستطيلة، حدد 384 لوحات أجار كمصدر، و1536 لوحات أجار كهدف، و 384 منصات دبوس قصيرة. ثم حدد 1:4 برنامج مصدر واحد.والهدف هو نسخ كل مستعمرة في أربع مستعمرات للحصول على رباعية. استخدام خيارات إعادة التدوير وإعادة النظر لأن هذا ينطوي على نسخ كل مستعمرة 4 مرات. اتبع تعليمات الروبوت والسماح للروبوت على الفور الخميرة في لوحات قبل التعبئة والتحضيب رصدت 1536 مستعمرة مجموعة agar الجانب حتى في 30 درجة مئوية لمدة 3 أيام.لتضخيم صفيف مستعمرة 1536 في Sc ناقص التربتوفان لوحات مستطيلة، حدد 1536 لوحات أجار كمصدر، 1536 لوحات أجار كهدف، و 1536 منصات دبوس قصيرة. حدد برنامج النسخ المتماثل العديد نسخاً متماثلاً 3 إلى 4 نسخ. استخدام خيار إعادة التدوير وإعادة النظر ولكن رمي خارج لوحة عند التحول إلى لوحة مختلفة من مجموعة لتجنب التلوث المتبادل.السماح للروبوت لتضخيم صفيف مستعمرة 1536 في Sc ناقص التربتوفان لوحات مستطيلة. وأخيرا، كيس لوحات واحتضان 1536 مستعمرة رصدت مجموعة agar الجانب حتى في 30 درجة مئوية لمدة 3 أيام لاستخدامها في خطوات التزاوج. لإعداد الحمض النووي الطعم سلالة المروج للتزاوج، بقعة الحمض النووي سلالات الطعم الخميرة على سلالات Sc ناقص uracil وطبقة الهستيدين وتنمو لمدة 3 أيام في 30 درجة مئوية.خط الخميرة في 15 سنتيمترا Sc ناقص uracil ولوحة الهستيدين باستخدام مسواك معقمة بحيث تناسب كل لوحة 12 إلى 16 سلالات مختلفة. احتضان لوحة يوم واحد في 30 درجة مئوية. في اليوم التالي، خط الخميرة في 15 سم Sc ناقص uracil ولوحة الهستيدين باستخدام مسواك معقمة بحيث تناسب كل لوحة 4 سلالات مختلفة.احتضان لوحة ليوم واحد في 30 درجة مئوية. بعد الحضانة، كشط الخميرة باستخدام مسواك معقمة، والتأكد من عدم كشط أي أجار. تضاف الخميرة إلى أنبوب 1.5 ملليلتر مع 500 ميكرولترات من الماء المعقم.الآن إضافة 10 إلى 15 حبات الزجاج المعقمة والتعليق الخميرة على لوحة مستطيلة YAPD. يهز جيدا في جميع الاتجاهات لمدة دقيقة واحدة لضمان انتشار الخميرة في جميع أنحاء لوحة. عكس لوحة على الفور، والاستفادة بحيث تذهب الخرز إلى الغطاء.إزالة وإعادة تدوير الخرز. كيس لوحات واحتضان لهم جانب أجار إلى أسفل لمدة 1 إلى 2 أيام في 30 درجة مئوية. ثم، انتقل إلى خطوة التزاوج.لمصاحبة الطعم الحمض النووي الخميرة وسلالات مجموعة TF، نقل مجموعة TF إلى لوحة مستطيلة YAPD مع الروبوت. حدد لوحة 1536 agar كمصدر والهدف، و1536 لوحة دبوس قصيرة. حدد برنامج النسخ المتماثل العديد.حدد 4 لوحات المصدر وإعادة تدوير وإعادة النظر الخيارات. يمكن استخدام كل لوحة صفائف TF لنقل 3 إلى 4 لوحات YAPD. يجب أن تكون لوحات مجموعة TF المستخدمة في التزاوج 2 إلى 3 أيام من العمر ، ولكن ليس أكثر من التزاوج قد يكون غير فعال.لنقل العشب من سلالة الطعم الحمض النووي إلى لوحات YAPD التي تحتوي بالفعل على مجموعة TF، حدد لوحة أجار 1536 كمصدر والهدف و1536 لوحة دبوس قصيرة. حدد برنامج النسخ المتماثل العديد. استخدام إزاحة عشوائية في المصدر مع دائرة نصف قطرها حوالي 0.6 ملليمتر لتجنب أخذ الخميرة من نفس المكان وحدد ميكس على الهدف لتسهيل الاتصال بين سلالات الخميرة.استخدام الحديقة التي تحتوي على سلالات الطعم الحمض النووي كمصدر، ولوحات YAPD التي تحتوي على مجموعة TF رصدت كهدف قبل التعبئة لوحات وتحتضن لهم جانب أجار في 30 درجة مئوية ليوم واحد. لاختيار الخميرة diploid، حدد لوحة 1536 أجار كمصدر والهدف، وحدد لوحة دبوس قصيرة 1536. حدد برنامج النسخ المتماثل.حدد المزيج على المصدر وعلى الهدف. السماح للروبوت لنقل الخميرة تزاوج من لوحات YAPD إلى الـ Sc ناقص uracil و لوحات التربتوفان قبل التعبئة لوحات وتحتضن لهم جانب أجار حتى في 30 درجة مئوية لمدة 2 إلى 3 أيام. الآن، حدد لوحات أجار 1536 كمصدر والهدف و 1536 لوحة دبوس قصيرة.حدد برنامج النسخ المتماثل. نقل الخميرة diploid من ال Sc ناقص uracil ولوحات التربتوفان إلى قراءة مستطيلة 3-AT وX-غال تحتوي على لوحات باستخدام الروبوت. حقيبة لوحات واحتضان لهم جانب أجار حتى في 30 درجة مئوية لمدة تصل إلى 7 أيام.لسلالات الطعم الحمض النووي مع نشاط مراسل الخلفية عالية، التقاط الصور في الأيام 2 و 3 و 4. وإلا، التقاط الصور في أيام 4 و 7. احتفظ بلوحات الصفيف TF في درجة حرارة الغرفة وانسخها مرة أخرى بعد 7 أيام لجولة جديدة من الفحص.لتوضيح نوع النتائج التي يمكن الحصول عليها باستخدام الخميرة المعززة واحد الهجين المقايسات، تم فحص المناطق المروج من الجينات CCL15 وIL17F ضد مجموعة من 1086 TFs الإنسان. المروج CCL15 هو مثال على الطعم غير التلقائي للحمض النووي، حيث التفاعلات، حتى الضعيفة منها، يمكن الكشف عنها بسهولة. المروج IL17F هو مثال على طعم الحمض النووي التلقائي مع نشاط مراسل الخلفية غير المستوية حيث يمكن الكشف عن بعض التفاعلات ، في حين أنه بالنسبة للعديد من TFs ، من غير المؤكد ما إذا كان نشاط المراسل أعلى من الخلفية.هناك العديد من المشاكل التي يمكن أن تحدث عند تنفيذ الخميرة المحسنة واحد الهجين المقايسات. في هذه الحالة، المستعمرات صغيرة جداً وفشلت في النقل. عادة، ما يقرب من 95٪ من مستعمرات فريسة TF عرض النمو الطبيعي.في هذا المثال، لا يوجد أي نمو الخميرة في جزء من لوحة. وترتبط هذه المسألة عموما إلى فشل في خطوة التزاوج إذا لوحة دبوس 1536 فشل في إجراء اتصال مع الخميرة في العشب سلالة الطعم الحمض النووي، في مجموعة TF، أو في لوحة التزاوج. في هذين المثالين، يتم الكشف عن أية تفاعلات.غالباً ما ترتبط هذه المشكلة إما بالطفرات غير المقصودة في جينات المراسل، ولا سيما LacZ، أو النشاط التلقائي العالي للغاية الذي يخفي التفاعلات. في هذه الحالة ، يعرض الصفيحة بقع زرقاء عشوائية والتي غالبا ما ترتبط بالتلوث البكتيري. أهم شيء للنظر هو إعداد لوحة السليم.التأكد من أن يتم إضافة كافة المكونات وأن ارتفاع agar هو موحدة كما تعتمد على هذا كافة الخطوات اللاحقة. على الرغم من أن معظم الكواشف ليست خطرة، من المهم ارتداء القفازات في جميع الأوقات لتجنب تلوث العينات واللوحات. كما هو الحال مع أي اختبار ملزم للحمض النووي ، من المهم التحقق من التفاعلات المحددة باستخدام مقايسات وظيفية مثل مقايسات المراسل ، أو اختبار عامل النسخ أو الضربة القاضية ، تليها قياس التعبير عن الجين المستهدف.وقد سمحت هذه الطريقة بتحديد عوامل النسخ التي تنظم الجينات المشاركة في عمليات بيولوجية معينة، وكذلك عوامل النسخ مع ربط بديل للمتغيرات غير الترميزية المرتبطة بمرض.

Research

JoVE Journal

Genetics

Methyl-binding DNA capture Sequencing for Patient Tissues

ملزم الميثيل تسلسل القبض على الحمض النووي للأنسجة المريض

Methylation is one of the essential epigenetic modifications to the DNA, which is responsible for the precise regulation of genes required for stable ...

Analysis of Cap-binding Proteins in Human Cells Exposed to Physiological Oxygen Conditions

تحليل البروتينات ملزم كاب في خلايا الإنسان تتعرض لظروف الأوكسجين فسيولوجية

Translational control is a focal point of gene regulation, especially during periods of cellular stress. Cap-dependent translation via the eIF4F complex ...

Real-time Analysis of Transcription Factor Binding, Transcription, Translation, and Turnover to Display Global Events During Cellular Activation

تحليل في الوقت الحقيقي النسخ عامل ملزم، النسخ والترجمة، ودوران لعرض الأحداث العالمية خلال التنشيط الهاتف الخلوي

Upon activation, cells rapidly change their functional programs and, thereby, their gene expression profile. Massive changes in gene expression occur, for ...

RNA Pull-down Procedure to Identify RNA Targets of a Long Non-coding RNA

الجيش الملكي النيبالي المنسدلة الإجراء لتحديد أهداف الجيش الملكي النيبالي للجيش الملكي النيبالي منذ فترة طويلة غير الترميز

Long non-coding RNA (lncRNA), which are sequences of more than 200 nucleotides without a defined reading frame, belong to the regulatory non-coding ...

Gene-targeted Random Mutagenesis to Select Heterochromatin-destabilizing Proteasome Mutants in Fission Yeast

استهداف الجين الطفرات العشوائية لتحديد طفرات بروتوزوم هيتيروتشروماتين-زعزعة الاستقرار في انشطار الخميرة

Random mutagenesis of a target gene is commonly used to identify mutations that yield the desired phenotype. Of the methods that may be used to achieve ...

Informatic Analysis of Sequence Data from Batch Yeast 2-Hybrid Screens

تحليل بيانات تسلسل من دفعة الخميرة 2-الهجين شاشات المعلوماتي

We have adapted the yeast 2-hybrid assay to simultaneously uncover dozens of transient and static protein interactions within a single screen utilizing ...

Determining 3'-Termini and Sequences of Nascent Single-Stranded Viral DNA Molecules during HIV-1 Reverse Transcription in Infected Cells

3 '-تيرميني وتسلسل الجزيئات الوليدة الدنا الفيروسي واحد-الذين تقطعت بهم السبل أثناء فيروس نقص المناعة البشرية-1 تحديد عكس النسخ في الخلايا المصابة

Monitoring of nucleic acid intermediates during virus replication provides insights into the effects and mechanisms of action of antiviral compounds and ...

Exploring Sequence Space to Identify Binding Sites for Regulatory RNA-Binding Proteins

استكشاف مساحة التسلسل لتحديد مواقع الربط للبروتينات الملزمة بالحمض النووي الريبي التنظيمية

Gene regulation plays an important role in all cells. Transcriptional, post-transcriptional (or RNA processing), translational, and post-translational ...

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

In Vivo Forward Genetic Screen to Identify Novel Neuroprotective Genes in Drosophila melanogaster

في فيفو إلى الأمام الشاشة الوراثية لتحديد الجينات العصبية الجديدة في دروسوفيلا melanogaster

There is much to understand about the onset and progression of neurodegenerative diseases, including the underlying genes responsible. Forward genetic ...

Pooled CRISPR-Based Genetic Screens in Mammalian Cells

الشاشات الوراثية المجمعة المستندة إلى كريسبر في خلايا الثدييات

Genome editing using the CRISPR-Cas system has vastly advanced the ability to precisely edit the genomes of various organisms. In the context of mammalian ...